BR112016017281B1

BR112016017281B1 - Microrganismos produtores de l-aminoácidos e processo para produção de laminoácidos usando os mesmos

Info

Publication number: BR112016017281B1
Application number: BR112016017281-7A
Authority: BR
Inventors: Ji Sun Lee; Chang Il Seo; Ki Yong Cheong; Eun Sung Koh; Do Hyun Kwon; Kwang Ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2022-02-22
Also published as: JP2017504359A; US10202609B2; KR20150109989A; US20170044553A1; CN105980544B; JP6490714B2; EP3119875B1; ES2720032T3; JP2019047790A; BR112016017281A2; TR201903145T4; MY181143A; PL3119875T3; TW201538724A; EP3119875A1; TWI547558B; WO2015142020A1; KR101608734B1; UA114997C2; EP3119875A4

Abstract

MICRORGANISMOS PRODUTORES DE L-AMINOÁCIDOS E PROCES SO PARA PRODUÇÃO DE L- AMINOÁCIDOS USANDO OS MESMOS São revelados microrganismos recombinantes que possuem produtividade de L- aminoácido melhorada, em que o microrganismo recombinante é transformado para apresentar um receptor de fago inativado do mesmo e um método para produzir um L-aminoácido empregando o microrganismo recombinante. O emprego do microrganismo recombinante pode permitir a produção de um L-aminoácido de um modo altamente eficaz.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção se refere a um microrganismo recombinante que produz um L-aminoácido e um método de produção de um L-aminoácido utilizando o microrganismo recombinante.

ANTECEDENTES DA ARTE

[0002] Vários processos de fermentação que utilizam microrganismos para a produção em massa de metabólitos úteis, por exemplo, aminoácidos, têm sido utilizados e, além disso, várias técnicas incluindo o desenvolvimento da cepa, o estabelecimento das condições de fermentação, ou outros semelhantes, têm sido desenvolvidas para a fermentação de sucesso utilizando os microrganismos. Em particular, para o desenvolvimento de uma cepa hospedeira para a produção em massa de metabólitos úteis, muitas tentativas têm sido feitas para induzir a superexpressão ou baixa expressão de um gene específico.

[0003] No entanto, na produção fermentativa empregando bactérias, a produção de metabólitos úteis pode ser reduzida devido à contaminação de fagos. A contaminação de fagos é causada principalmente devido aos receptores de fagos que são proteínas, polissacarídeos de lipídeos e semelhantes, que são capazes de ligar os fagos a uma superfície bacteriana. No caso do Escherichia coli (E. coli), E. coli é atacado por uma variedade de fagos, e consequentemente, o estudo de receptores para cada um dos fagos tem sido relativamente bem sucedido. No entanto, o estudo da relação entre os receptores de fago e a produção de L-aminoácidos não foi suficientemente realizado ainda.

[0004] A este respeito, os inventores da presente invenção selecionaram genes que são receptores de fago bem conhecidos e, em seguida, inativaram cada um dos genes de modo a diminuir o risco de redução da produção de L- aminoácido, o risco sendo considerado como uma vulnerabilidade do E. coli. Em seguida, a influência sobre a produção de L-aminoácido é confirmada, e essa seleção e inativação dos genes se aplicam às cepas produtoras de L- aminoácido, completando assim a presente invenção.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0005] A presente invenção fornece um microrganismo recombinante tendo produtibilidade L-aminoácido e um receptor de fago inativado.

[0006] A presente invenção proporciona um método de produção de um L-aminoácido empregando o microrganismo.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[0007] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um L-aminoácido que produz microrganismo recombinante no qual pelo menos uma dentre NfrA e NfrB são inativadas.

[0008] O termo "NrfA", tal como empregado no presente documento se refere a uma proteína que forma um receptor para bacteriófago N4, e pode ser uma proteína da membrana da bactéria. Por exemplo, NrfA pode ser uma subunidade de uma proteína da membrana externa. A NfrA pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40. A NfrA pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, ou uma sequência de aminoácidos apresentando cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Uma sequência de um gene que codifica a NfrA pode incluir uma sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. A sequência do gene que codifica a NfrA pode incluir, por exemplo, uma sequência de um gene nfrA (NCBI Gene ID: 12930896). Por exemplo, a sequência do gene que codifica a NfrA pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 39, ou uma sequência de polinucleotídeos apresentando cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais sequência de identidade com a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 39.

[0009] O termo "NfrB", tal como empregado no presente documento se refere a uma proteína que forma um receptor para bacteriófago N4, e pode ser uma proteína da membrana de bactérias. Por exemplo, NfrB pode ser uma subunidade de uma proteína de membrana interna. A NfrB pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. A NfrB pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, ou uma sequência de aminoácidos apresentado identidade de sequência de cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. Uma sequência de um gene que codifica a NfrB pode incluir uma sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. A sequência do gene que codifica a NfrB pode incluir, por exemplo, uma sequência de um gene nfrB (NCBI Gene ID: 12933943). Por exemplo, a sequência do gene que codifica a proteína NfrB pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 41, ou uma sequência de polinucleotídeos tendo cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade da sequência com a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 41.

[0010] Além disso, no microrganismo recombinante que produz um L-aminoácido, pelo menos uma de Tsx e FhuA pode ser adicionalmente inativada.

[0011] O termo "Tsx", tal como empregado no presente documento se refere a uma proteína que forma um canal de nucleosídeo, ou seja, um canal específico para um nucleosídeo, e pode ser um componente formando um receptor para o fago T6 e colicina K. A Tsx pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, ou uma sequência de aminoácidos apresentando cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45. Uma sequência de um gene que codifica o gene da Tsx pode incluir uma sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45. A sequência do gene que codifica a Tsx pode incluir, por exemplo, uma sequência de um gene tsx (NCBI Gene ID: 12934188). Por exemplo, a sequência do gene que codifica o Tsx pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 44, ou uma sequência polinucleotídica tendo cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeos da ID SEQ NO: 44.

[0012] O termo "FhuA", tal como empregado no presente documento se refere a uma proteína multifuncional de uma membrana externa das bactérias que transporta (Fe3+) ferricromo ou antibióticos, tais como albomicina e rifamicina, e pode ser um receptor para fagos T1, T5, e phi80. A FhuA pode incluir, por exemplo, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, ou uma sequência de aminoácidos apresentando cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Uma sequência de um gene que codifica a FhuA pode incluir uma sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. A sequência do gene que codifica a proteína FhuA pode incluir, por exemplo, uma sequência de o gene fhuA (NCBI Gene ID: 12930751). Por exemplo, a sequência do gene que codifica a fhuA pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 47, ou uma sequência de polinucleotídeos apresentando cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeo da ID SEQ NO: 47.

[0013] O termo "identidade", tal como empregado no presente documento se refere à semelhança entre duas sequências de aminoácidos, o que pode ser determinado por um método que é bem conhecido na técnica, por exemplo, o algoritmo BLAST 2.0 que define os parâmetros, tais como um marcador, uma identidade, e uma semelhança entre duas sequências de aminoácidos.

[0014] O termo "microrganismo recombinante" como empregado no presente documento se refere a um microrganismo que é geneticamente modificado. O microrganismo recombinante pode ser um microrganismo que é geneticamente modificado e, por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode ser introduzido no microrganismo de acordo com métodos de engenharia genética, ou uma sequência ou a localização de um gene endógeno em um microrganismo pode ser transformada.

[0015] O termo "L-aminoácido" como empregado no presente documento se refere a uma unidade estrutural básica de uma proteína que constitui o corpo de um organismo e que tem tanto um grupo amino quanto um grupo ácido carboxílico que são ligados ao mesmo átomo de carbono. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em L-leucina, L-fenilalanina, L-lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser o L- triptofano ou L-treonina.

[0016] O termo "uma enzima ou uma proteína é inativada" ou "inativação de uma enzima ou uma proteína", tal como empregado no presente documento se refere a um caso em que a proteína descrita acima não é expressa em um microrganismo, caso em que a proteína acima descrita é expressa, mas não tem qualquer atividade, ou um caso onde a proteína descrita acima é expressa, mas a atividade da mesma é fraca em comparação com a atividade intrínseca. O termo "atividade intrínseca", tal como empregado no presente documento se refere à atividade de um microrganismo em um estado natural, isto é, atividade originalmente existente em um microrganismo, ou a atividade de uma proteína que não tenha sido geneticamente modificada.

[0017] A inativação da proteína NfrA, proteína NfrB, proteína Tsx e da proteína FhuA pode ser causada por mutação, deleção ou interrupção de genes que codificam a proteína NfrA, proteína NfrB, proteína Tsx, e a proteína FhuA. O termo "mutação, deleção ou interrupção de genes", tal como empregado no presente documento se refere a um caso em que uma parte ou a totalidade dos genes ou elementos de regulação nas regiões promotoras ou terminadoras dos genes é mutada, substituída, eliminada ou inserida com pelo menos uma base, de modo que os genes não são expressos ou os genes são expressos em uma pequena quantidade, ou os genes são expressos sem que mostrem atividade enzimática ou com atividade enzimática diminuída. A mutação, deleção ou interrupção de genes pode ser obtida por manipulação genética, tal como recombinação homóloga, mutagênese ou evolução molecular. Quando uma célula inclui uma pluralidade dos mesmos genes ou, pelo menos, dois genes homólogos, um ou mais genes podem ser eliminados ou alterados na célula. De modo a inativar os genes fornecidos em uma modalidade da presente invenção, os métodos de fabricação de um mutante usando uma lamBda Red recombinase podem ser realizados.

[0018] O microrganismo recombinante elimina ou reduz a atividade de cada uma das proteínas providas no presente documento ou as proteínas em combinação. Consequentemente, o microrganismo recombinante pode ter produtividade de L-aminoácido melhorada em comparação com o caso em que a atividade das proteínas não é inativada, e, assim, o microrganismo recombinante pode ser adequadamente utilizado para a finalidade de produzir o L-aminoácido.

[0019] O microrganismo recombinante pode ser um microrganismo do gênero Escherichia, gênero Enterobacter, gênero Erwinia, gênero Serratia, gênero Providencia, gênero Corynebacterium, e o gênero Brevibacterium. Por exemplo, o microrganismo recombinante pode ser um microrganismo do gênero Escherichia. O microrganismo da gênero Escherichia pode ser Escherichia coli (E. Coli), por exemplo, KCCM11501P. KCCM11501P é uma cepa KCCM10910PΔnfrAB preparada usando uma cepa produtora de treonina (KCCM10910P) como uma cepa mãe e realizando deleção de ambos os genes e nfrA nfrB. No presente documento, a capacidade de consumo de açúcar em E. coli KCCM11501P é verificada como a mais elevada que na cepa mãe (KCCM10910P). KCCM11501P foi denominada "E. coli CA03- 8253P" e, em seguida, foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (doravante, referido como "KCCCM") em 13 de dezembro de 2013 de acordo com o Tratado de Budapeste.

[0020] De acordo com outro aspecto da presente invenção, um método de produção do L-aminoácido é divulgado, o método incluindo: a cultura do microrganismo recombinante produzindo o L-aminoácido; e coleta do L- aminoácido a partir do produto de cultura.

[0021] O microrganismo recombinante que produz o L- aminoácido é definido como o mesmo como descrito acima.

[0022] O L-aminoácido pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em L-leucina, L-fenilalanina, L- lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser L- treonina ou L-triptofano. A cultura do microrganismo recombinante pode ser obtida de acordo com um meio de cultura e condições de cultura apropriadas que são bem conhecidos na técnica. Além disso, um versado na técnica comum pode ajustar adequadamente um meio de cultura e condições de cultura de acordo com o microrganismo selecionado. O método de cultura pode incluir uma cultura de batelada, uma cultura contínua, uma cultura alimentada em bateladas, ou uma combinação dos mesmos.

[0023] O meio de cultura pode incluir uma variedade de fontes de carbono, fontes de nitrogênio, e os ingredientes de oligoelementos.

[0024] As fontes de carbono podem incluir, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras, tais como, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcool, tal como o glicerol e o etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ou uma combinação dos mesmos. A cultura do microrganismo recombinante pode ser realizada através da utilização de glicose como fonte de carbono. As fontes de nitrogênio podem incluir, por exemplo, fontes de nitrogênio orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho (CSL), e farinha de soja; e fontes inorgânicas de nitrogênio, tais como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; ou uma combinação dos mesmos. O meio de cultura pode incluir como fonte de fósforo um fosfato, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de potássio. Além disso, o meio de cultura pode incluir tiras contendo sódio correspondente à fonte de fósforo, e sais de metal, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, o meio de cultura pode incluir aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Os ingredientes do meio ou individuais do meio podem ser adicionados ao meio de cultura em bateladas ou de modo contínuo.

[0025] Além disso, compostos, tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amoníaco, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio de cultura durante a cultura do microrganismo recombinante de um modo adequado, de modo a ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, agentes antiespuma tais como éster de poliglicol de ácido graxo, podem ser usados durante a cultura do microrganismo recombinante, de modo a suprimir a produção de bolhas de ar. De modo a manter condições aeróbicas do meio de cultura, o oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado no meio de cultura. No presente documento, a temperatura do meio de cultura pode estar, tipicamente, em uma faixa de cerca de 20°C a cerca de 45°C. Um período de cultura do microrganismo recombinante pode durar até se obter uma quantidade desejada de o L-aminoácido, e, por exemplo, a cultura do microrganismo recombinante pode durar cerca de 10 horas a cerca de 160 horas.

[0026] O termo "produto de cultura", tal como empregado no presente documento se refere a um caldo de cultura contendo o microrganismo recombinante, um sobrenadante de cultura a partir do qual uma célula microbiana é removida, ou uma solução diluída do produto de cultura. O meio de cultura pode ainda incluir um ingrediente para o aumento da produtividade do L- aminoácido. Por exemplo, a composição pode ainda incluir fontes de carbono, fontes de nitrogênio, ou ingredientes de oligoelementos.

[0027] A coleta do L-aminoácido a partir do produto de cultura pode ser realizada por métodos de cultura adequados conhecidos na técnica, tais como uma cultura em bateladas, uma cultura contínua, ou uma cultura alimentada em bateladas, de modo a recolher ou recuperar o L- aminoácido produzido no produto de cultura.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0028] De acordo com um aspecto, um microrganismo tendo removido ou diminuído a atividade de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína NfrA, uma proteína NfrB, uma proteína Tsx, e uma proteína FhuA pode ser utilizada para produzir um L- aminoácido.

[0029] De acordo com outro aspecto, um método de produção de um L-aminoácido pode ser usado para produzir um L-aminoácido de uma maneira eficiente.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0030] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos que se seguem. Estes exemplos são para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando receptor de fato inativado por emprego de KCCM10910P

[0031] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que apresenta um receptor de fago inativado, uma cepa KCCM10910P (Patente Coreana No: 10-0966324) foi utilizada como uma cepa mãe. Em seguida, um cassete para a inativação de um gene para cada receptor de fago foi preparado e, em seguida, foi utilizado para permitir a transformação genética.

1-1. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene nfrA inativado

[0032] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que tem um gene nfrA inativado, foi preparado um cassete para inativar o gene nfrA. O cassete utilizou um método de inativação de uma etapa, que é uma técnica de construção de um mutante usando lamBda Red recombinase desenvolvido por Datsenko KA e outros (Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97:6640-6645). Para confirmar a inserção do cassete no gene, um gene resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC foi empregado como um marcador (Publicação de Patente Coreana Aberta ao Público: 2009-007554).

[0033] Fragmento de DNA de 1,1 kb incluindo uma parte de uma sequência do gene nfrA (SEQ ID NO: 39) e uma parte de uma sequência de bases do gene resistente à cloranfenicol de um pUCprmfmloxC foi obtida usando um conjunto de iniciadores de SEQ ID NOS: 2 e 3. No presente documento, uma reação em cadeia da polimerase (doravante referida como "PCR") foi realizada usando um kit de pré- mistura de PCR (isto é, um produto da empresa Bioneer, a seguir, o mesmo produto foi utilizado) sob as seguintes condições: 27 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 56°C durante 30 segundos, e alongamento a 72°C durante 1 minuto. O produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, e, em seguida, eluído. Em seguida, a PCR foi realizada de novo, utilizando o produto eluído como um molde e um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 1 e 4, nas mesmas condições acima descritas, resultando em um fragmento de DNA de cerca de 1,2 kb. O fragmento de DNA foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, eluído e, em seguida, foi finalmente usado para preparar o cassete para inativar gene nrfA.

[0034] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina apresentando o gene nfrA inativado, uma cepa produtora de treonina (KCCM10910P), que foi transformada com um plasmídeo pKD46 de acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA e outros (Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97: 6640-6645), foi preparada como uma cepa competente. Em seguida, o DNA do cassete preparado para inativar o gene nfrA foi introduzido na cepa para permitir a transformação.

[0035] A cepa obtida foi selecionada sobre uma placa de LB com resistência ao cloranfenicol. Isto é, um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 5 e 6, que têm uma sequência de DNA que se situa fora de duas extremidades da sequência homóloga de nfrA do cassete para inativação genômica, foi usada para, desse modo selecionar colônias em que o tamanho do produto de PCR resultante foi reduzido de 2,8 kb para 1,5 kb.

[0036] A cepa recombinante primária que tem resistência ao cloranfenicol foi removida do plasmídeo pKD46, e, em seguida, introduzida com um plasmídeo pJW168 para remover o gene marcador de cloranfenicol a partir de células microbianas (Gene, (2000) 247,255-264). Em seguida, PCR utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 5 e 6 foi realizada para se obter o produto de DNA de 0,4 kb, indicando que a cepa finalmente obtida tinha um tamanho de DNA reduzido. Por conseguinte, foi preparada a cepa produtora de L-treonina possuindo o gene nfrA inativado (KCCM10910PΔnfrA).

1-2. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene nfrB inativado

[0037] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina apresentando um gene nfrB inativado (SEQ ID NO: 41), um cassete para inativação de um gene nfrB foi preparado da mesma maneira que na preparação do cassete para inativar o gene nfrA do Exemplo 1-1. O fragmento de DNA de 1,1 kb foi obtido usando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 8 e 9, e, em seguida, 1,2 kb de fragmento de DNA foi preparado utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 7 e 10.

[0038] Um método para preparação de uma cepa produtora de treonina apresentando o gene nfrB foi realizado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 foi empregado para confirmar o tamanho do produto da PCR resultante. Por conseguinte, a cepa produtora de L-treonina possuindo um gene nfrB inativado (KCCM10910PΔnfrB) foi finalmente preparada.

1-3. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando o gene nfrAB inativado

[0039] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que apresenta uma gene nfrA inativado (SEQ ID NO: 43), uma cassete para inativar um gene nfrAB foi preparado da mesma maneira que na preparação do cassete para inativação do gene nfrA do Exemplo 1-1. O fragmento de DNA 1,1 kb foi obtido usando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 2 e 9, e, em seguida, 1,2 kb fragmento de DNA foi preparado utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: SEQ ID NO: 1 e 10.

[0040] Um método de preparação de uma cepa produtora de treonina tendo um gene nfrAB inativado foi realizado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 5 e 12 foi usada para confirmar o tamanho do produto da PCR resultante. Por conseguinte, a cepa produtora de L-treonina apresentando um gene nfrAB inativado (KCCM10910PΔnfrAB) foi finalmente preparada.

1-4. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene tsx inativado

[0041] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que apresenta um gene tsx inativado (SEQ ID NO: 44), um cassete para inativar o gene tsx foi preparado da mesma maneira que na preparação do cassete para inativar o gene nfrA do Exemplo 1-1. Fragmento de DNA de 1,1 kb foi obtido utilizando um conjunto iniciador das SEQ ID NOS: 13 e 14, e, em seguida, um fragmento de DNA de 1,2 kb foi preparado utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 15 e 16.

[0042] Um método para preparar a cepa produtora de treonina tendo um gene tsx inativado foi realizado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 17 e 18 foi empregado para confirmar o tamanho do produto de PCR resultante. Por conseguinte, a cepa de produção de L-treonina apresentando gene tsx inativado (KCCM10910PΔtsx) foi finalmente preparada.

1-5. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene fhuA inativado

[0043] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que tem um gene fhuA inativado (SEQ ID NO: 46), um cassete para inativar um gene fhuA foi preparado de acordo com o método de uma etapa de inativação de uma etapa descrito acima. A fim de se obter um fragmento de DNA com uma sequência de base que tem homologia com uma sequência do gene fhuA, um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 19 e 20 e um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 21 e 22 foram empregados, resultando na produção de produtos de PCR. Além disso, a fim de se obter um fragmento de DNA com uma sequência de base que tem resistência ao cloranfenicol, um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 23 e 24 foi utilizado, resultando na produção de um produto da PCR. Deste modo, estes três produtos de PCR resultantes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, e, em seguida, eluídos. A PCR foi realizada usando estes três produtos da PCR eluiu como moldes e um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 19 e 22, para preparar um cassete para inativar o gene fhuA.

[0044] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina apresentando o gene fhuA o cassete para inativação do gene fhuA foi preparado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 25 e 26 foi empregado para confirmar a o tamanho dos produtos da PCR resultantes. Por conseguinte, a cepa produtora de L-treonina-possuindo o gene fhuA inativado (KCCM10910PΔfhuA) foi finalmente preparada.

1-6. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene lamB inativado

[0045] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina que tem um gene lamB inativado (SEQ ID NO: 48), um cassete para a inativação de um gene lamB foi preparado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1. 1,11 kb de fragmento de DNA foi obtido utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 27 e 28, e, em seguida, 1,2 kb fragmento de DNA foram preparados utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 29 e 30.

[0046] Um método de preparar a cepa produtora de treonina tendo o gene lamB inativado foi realizado pelo mesmo processo descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 31 e 32 foi usada para confirmar o tamanho do produto da PCR resultante. Por conseguinte, a cepa produtora de L-treonina apresentando o gene lamB inativado (KCCM10910PΔlamB) foi finalmente preparada.

1-7. Preparação da cepa produtora de treonina apresentando gene btuB inativado

[0047] A fim de preparar uma cepa produtora de treonina apresentando um gene btuB inativado (SEQ ID NO: 50), um cassete para inativar o gene btuB foi preparado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1. Um fragmento de DNA de 1,1 kb foi obtido utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 33 e 34, e, em seguida, fragmento de DNA de 1,2 kb foi preparado utilizando um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 35 e 36.

[0048] Um método de preparação da cepa produtora de treonina possuindo o gene inativado btuB foi realizado pelo mesmo método descrito no Exemplo 1-1, em que um conjunto de iniciadores das SEQ ID NOS: 37 e 38 foi empregado para confirmar o tamanho do produto da PCR resultante. Por conseguinte, a cepa produtora de L-treonina apresentando o gene inativado btuB (KCCM10910PΔbtuB) foi finalmente preparada.

Exemplo 2. Comparação da produtividade de L- treonina entre os microrganismos recombinantes

[0049] Os microrganismos recombinantes preparados de acordo com o Exemplo 1 foram cultivados em um meio de titulação de treonina contendo composições mostradas na Tabela 1 abaixo, em um balão de Erlenmeyer. Em seguida, foi confirmado que os microrganismos recombinantes tinham produtibilidade de L-treonina. Tabela 1 [Tabela 1]

[0050] Uma alça de platina de cada um dos 7 tipos de cepas E. coli do Exemplo 1 e a cepa KCCM10910P que foram cultivadas durante a noite em meio sólido LB em uma incubadora a 33°C, foram inoculadas em 25 mL de um meio de titulação contendo composições apresentadas na Tabela 1 acima, e, em seguida, foi cultivada em uma incubadora a 33° C e a 200 rpm durante 48 horas.Tabela 2 [Tabela 2]

[0051] Como mostrado na Tabela 2 acima, foi confirmado que as taxas de consumo de açúcar das cepas tendo cada uma os genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx, e fhuA foram mais elevadas que a taxa de consumo de açúcar da cepa mãe (KCCM10910P). Também foi confirmado que a velocidade de produção das cepas não foi reduzida durante um período de 48 horas. Por outro lado, confirmou-se que as taxas de consumo de açúcar das cepas tendo cada uma os genes lamB e btuB inativados foram semelhantes à taxa de consumo de açúcar da cepa mãe, ou ligeiramente mais lenta que a taxa de consumo de açúcar da cepa mãe. Também foi confirmado que as concentrações de L-treonina mostradas nas cepas da cultura ao fim de 48 horas eram todas semelhantes. As cepas contendo cada uma os genes inativados nfrA, nfrB, e nfrAB apresentaram os mesmos resultados de cultura. Isto é, o caso em que um dos dois genes foi deletado e o caso em que ambos os genes foram deletados geraram os mesmos resultados.

Exemplo 3. Preparação de cepas com a combinação de mutação eficaz e em comparação com a produtibilidade de L- treonina das mesmas 3-1. Preparação de cepas apresentando genes simultaneamente inativados nfrAB e fhuA, genes simultaneamente inativados nfrAB e genes tsx além dos genes simultaneamente inativados nfrAB, tsx e fhuA

[0052] A fim de confirmar se o caso em que a inativação combinada dos genes nfrAB, fhuA, e tsx apresentando capacidade de consumo de açúcar aumentada apresentam ainda a capacidade de consumo de açúcar nas cepas produtoras de L-treonina, foram preparadas as cepas de KCCM10910PΔnfrABΔfhuA, uma cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsx e uma cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA. A fim de preparar estas cepas, as cepas tendo cada uma os genes inativados fhuA e tsx foram preparados de acordo com a cepa KCCM10910PΔnfrAB do Exemplo 1-3, do mesmo modo como descrito no Exemplo 1 (resultando nas cepas KCCM10910PΔnfrABΔfhuA e KCCM10910PΔnfrABΔtsx) . Além disso, uma cepa com o gene fhuA inativado foi preparada de acordo com a cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsx, assim, finalmente, preparando uma cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA.

[0053] Como mostrado na Tabela 2, as cepas possuindo os genes inativos nfrA, nfrB, e nfrAB foram determinadas como tendo os mesmos efeitos uma da outra. A este respeito, na preparação de cepas com mutações combinações eficazes, as cepas possuindo os genes inativados tsx e fhuA foram preparadas usando a cepa possuindo um gene inativado nfrAB. No entanto, foram determinados os efeitos das cepas possuindo os genes inativados tsx e fhuA como sendo os mesmo que os efeitos da cepa possuindo apenas o gene inativado nfrA, apenas o gene inativado nfrB, ou simultaneamente apenas os genes inativados nfrA e nfrB.

3-2. Comparação de produtibilidade da L-treonina das cepas com combinações de mutações efetivas

[0054] A fim de comparar a produtibilidade da L- treonina das cepas com combinações de mutações efetivas preparadas acima, um meio contendo as composições apresentadas na Tabela 1 acima foi empregado para cultivar as cepas do mesmo modo como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 [Tabela 3]

[0055] Como um resultado de um teste de potência na cepa KCCM10910PΔnfrABΔfhuA, na cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsx, e na cepa KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA, cada uma preparada de acordo com a inativação combinada dos genes nfrAB, fhuA, e tsx apresentando capacidade de consumo de açúcar aumentada, foi confirmado que a cepa na qual o gene fhuA ou o gene tsx foi inativado além da mutação pelo gene nfrAB só aumentou a capacidade de consumo de açúcar. Por conseguinte, a cepa KCCM10910PΔnfrAB transformada mostrando capacidade de consumo de açúcar aumentada foi 'E. coli CA03-8253P'e , em seguida, foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) em 13 de dezembro, 2013 (Número de acesso: KCCM 11501P).

Exemplo 4. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado usando KCCM-10132 e a comparação do mesmo na produtibilidade da treonina 4-1. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado usando KCCCM-10132

[0056] Dez tipos de cepas cada uma apresentando um receptor de fago inativado foram preparados por emprego de uma cepa KCCM-10132 (vide Tabela 4 abaixo), do mesmo modo como descrito nos Exemplos 1 e 3, de acordo com os 7 tipos de cassetes de inativação do Exemplo 1. A cepa KCCM-10132 foi revelada na Patente coreana No: 10-0270510 como uma cepa com produtibilidade de treonina derivada de E. coli.

4-2. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado por emprego de KCCM-10132 e comparação da produtibilidade de treonina no mesmo

[0057] Os 10 tipos de cepas, tendo cada um o receptor de fago inativado que foram preparados utilizando a cepa KCCM-10132 do Exemplo 4-1 e a cepa mãe (KCCM-10132) foram cultivados em um meio contendo as composições apresentadas na Tabela 1 pelo mesmo método como descrito no Exemplo 2. Em seguida, as cepas cultivadas foram avaliadas por comparação da produtibilidade de treonina das mesmas.Tabela 4 [Tabela 4]

[0058] Como mostrado na Tabela 4 acima, foi confirmado que as taxas de consumo de açúcar das cepas tendo cada uma os genes inativados nfrA, nfrB, nfrAB, tsx, e fhuA foram mais elevadas que a taxa de consumo de açúcar da cepa mãe (KCCM-10132). Também foi confirmado que a velocidade de produção das cepas não foi reduzida em um período de 48 horas. Por outro lado, confirmou-se que as taxas de consumo de açúcar das cepas tendo cada uma os genes inativados lamB e btuB foram semelhantes à taxa de consumo de açúcar da cepa mãe, ou ligeiramente mais lentas que a taxa de consumo de açúcar da cepa mãe. Também foi confirmado que as concentrações de L-treonina mostradas nas cepas da cultura ao fim de 48 horas eram todas semelhantes. Também foi confirmado que as cepas possuindo os genes simultaneamente inativados nfrAB, fhuA, nfrAB e tsx e os genes simultaneamente inativados nfrAB, tsx, e fhuA aperfeiçoaram as taxas de consumo de açúcar em comparação com a taxa de consumo de açúcar da cepa apresentando apenas o gene inativado nfrAB.

Exemplo 5. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado por emprego de KCCM11166P e comparação da produtibilidade de treonina dos mesmos 5-1. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado empregando KCCM11166P

[0059] Sete tipos de cepas produtoras de triptofano, tendo cada um receptor de fago inativado foram preparados usando um KCCM11166P (Patente Coreana número: 10-1261147) da mesma forma como descrito no Exemplo 1, de acordo com os 7 tipos de cassetes de inativação do Exemplo 1.

5-2. Preparação da cepa apresentando receptor de fago inativado empregando KCCM11166P e comparação com a produtibilidade de treonina da mesma

[0060] A fim de avaliar a produtibilidade dos 7 tipos de cepas produtoras de triptofano, tendo cada uma o receptor fago inativado preparado usando a cepa KCCM11166P do Exemplo 5-1, as composições contendo um meio apresentadas na Tabela 5 a seguir foi utilizado. Isto é, as células microbianas foram inoculadas por uma alça de platina e, em seguida, foram cultivadas durante a noite em meio LB sólido. Em seguida, uma alça de platina de cada uma das células microbianas foi inoculada em 25 mL de meio de titulação contendo as composições apresentadas na Tabela 5 a seguir, e, em seguida, foi cultivada em uma incubadora a 37°C e a 200 rpm durante 48 horas. Os resultados obtidos a partir destes são apresentados na Tabela 6 abaixo.Tabela 5 [Tabela 5]

Tabela 6 [Tabela 6]

[0061] Como mostrado na Tabela 6 acima, no caso da deleção de cada um dos genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx, e fhuA, confirmou-se que as quantidades de triptofano produzidas nas cepas tendo cada uma os genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx e fhuA inativados eram semelhantes, enquanto a taxa de consumo de açúcar das cepas cada um apresentando os genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx e fhuA inativados eram ligeiramente mais elevadas que outras. Entretanto, no caso de deleção de cada um dos genes lamB e btuB, foi confirmado que as quantidades de triptofano produzidos pelas cepas tendo cada uma os genes lamB e btuB inativados ou as taxas de consumo de açúcar das cepas tendo cada uma a inativação dos genes lamB e btuB não foram alteradas.

Exemplo 6. Preparação de cepas com a combinação de mutação eficaz e comparação na produtibilidade de L- triptofano das mesmas 6-1. Preparação de cepas de produção de L- triptofano apresentando simultaneamente os genes nfrAB e fhuA inativados, genes nfrAB e tsx simultaneamente inativados e, genes nfrAB, tsx e fhuA simultaneamente inativados

[0062] A fim de confirmar o caso em que a inativação combinada dos genes nfrAB, tsx e fhuA mostrando capacidade de consumo de açúcar aumentada ainda apresentem capacidade de consumo de açúcar nas cepas que produzem triptofano, foram preparadas uma cepa KCCM11166PΔnfrABΔfhuA, uma cepa KCCM11166PΔnfrABΔtsx e uma cepa KCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuA.

6-2. Comparação na produtibilidade de L-triptofano das cepas com combinação de mutação eficaz

[0063] A fim de comparar a produtibilidade de L- triptofano dos três tipos de cepas preparadas de acordo com o Exemplo 6-1, um meio contendo as composições apresentadas na Tabela 5 acima foi empregado para cultivar as cepas da mesma maneira como descrito no Exemplo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 [Tabela 7]

[0064] Como um resultado de um teste de potência em cepas produtoras de triptofano com combinações de mutação efetivas, confirmou-se que as cepas nas quais o gene fhuA e/ou o gene tsx foram adicionalmente inativados além da mutação pelo gene nfrAB, apenas aumentou a capacidade de consumo de açúcar.

[0065] Deve ser entendido que as modalidades exemplares descritas no presente documento devem ser consideradas no sentido descritivo apenas e não para fins de limitação. As descrições de características ou aspectos dentro de cada modalidade normalmente devem ser consideradas como disponíveis para outras funções semelhantes ou aspectos em outras modalidades. Enquanto uma ou mais modalidades da presente invenção tenham sido descritas com referência às figuras, deverá ser entendido pelos versados na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem com isso se afastar do espírito e âmbito da presente invenção como definido pelas reivindicações que se seguem.

[0066] [Número de acesso]

[0067] Instituição depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (internacional)

[0068] Número de acesso: KCCM11501P

[0069] Data de depósito: 13 de dezembro de 2013 [115] TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL Para: CJ CHEILJEDANG CORP., 330 DONGHO-RO, JUNG-GU, SEOUL, 100-400, REPÚBLICA DA CORÉIA RECEPÇÃO NO CASO DE UM ORIGINAL Emitido nos termos da Norma 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional identificada ao final dessa folha I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO Referência de identificação fornecida pela DEPOSITANTE: Escherichia coli CA03-8253P Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL: KCCM11501P II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DENOMINAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA Não preenchido III. RECEPÇÃO E ACEITAÇÃO Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado de acordo com o item I acima, que foi recebida em 13 de dezembro de 2013. (Data do depósito original)1 IV. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Denominação: Centro de cultura Coreano de microrganismos Endereço: Yurim B/D 45, Hongjenae-2ga-gil Seodaemun-gu SEOUL 120-861 - República da Coreia Assinatura (s) de pessoa (s) que representa a Autoridade Depositária Internacional Autoridade ou funcionário (s) autorizado: Data: 13 de dezembro de 2013 V. uando a Regra 6.4 (d) se aplica, tal data é a data em que o estado de autoridade depositária internacional foi adquirido; onde um depósito feito fora do Tratado de Budapeste após a aquisição do estado de autoridade depositária internacional é convertido no deposito de acordo com o Tratado de Budapeste, tal data sendo a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional.

Claims

1. Microrganismo recombinante do gênero Escherichia produzindo L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre NfrA e NfrB é inativada.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a NfrA compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 e a NfrB compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42.

3. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma de Tsx e FhuA é adicionalmente inativada.

4. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a Tsx compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e a FhuA compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.

5. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o L- aminoácido é L-treonina ou L-triptofano.

6. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante é Escherichia coli.

7. Método de produção de um L-aminoácido caracterizado por compreender: cultivar o microrganismo recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6; e coletar um L-aminoácido a partir da cultura.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-treonina ou L-triptofano.