BR112016013461B1

BR112016013461B1 - Microrganismo corineforme com uma capacidade melhorada para produzir l-lisina, e método para produzir l-lisina

Info

Publication number: BR112016013461B1
Application number: BR112016013461-3A
Authority: BR
Inventors: Jun Ok Moon; Sang Hee Park; Lan Huh; Kwang Ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2023-04-04
Also published as: CN106062177A; MY179346A; EP3078737B1; JP6263641B2; US9777282B2; PL3078737T3; JP2017502688A; RU2651505C1; KR20150069340A; EP3078737A1; WO2015088204A1; EP3078737A4; CN106062177B; BR112016013461A2; KR101565770B1; US20160355830A1

Abstract

MICRORGANISMO CORINEFORME COM UMA CAPACIDADE MELHORADA PARA PRODUZIR L-LISINA, E MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA. Um microrganismo do género Corynebacterium com uma capacidade melhorada de produzir L-lisina nos quais a proteína iniciadora da formação do septo é inativada, e um método para a produção de L-lisina usando o microrganismo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente divulgação se refere a um microrganismo Corynebacterium com uma capacidade melhorada para produzir L-lisina e um método para produzir L-lisina utilizando o mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Um microrganismo do gênero Corynebacterium é uma bactéria gram positiva e é amplamente utilizada na produção de L-aminoácido. O L-aminoácido, particularmente, L-lisina, se usa na alimentação animal, medicamentos para humanos, e em campos cosméticos, e se produz por fermentação usando cepas de Corynebacterium.

[003] Tem havido uma série de tentativas para melhorar um método de produção de L-aminoácido usando cepas de Corynebacterium. Entre as tentativas, houve uma pesquisa para melhorar cepas de Corynebacterium produzindo L- aminoácidos rompendo ou atenuando a expressão de genes específicos usando tecnologia de DNA recombinante. Adicionalmente, tem havido muita pesquisa sobre os efeitos de amplificação de genes relacionados com a biossíntese de cada L-aminoácido na produção de L-aminoácido e visando a melhoria de cepas de Corynebacterium produzindo L-aminoácidos. Ademais, genes exógenos derivados de outras bactérias podem até mesmo ser introduzidos.

[004] Porém, existe ainda uma carência de cepas com uma capacidade melhorada para produzir L-lisina para além dos métodos convencionais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[005] Um aspecto provê um microrganismo corineforme com uma capacidade melhorada para produzir L- lisina.

[006] Outro aspecto provê um método para produzir L-lisina usando o microrganismo corineforme.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[007] Um aspecto provê um microrganismo corineforme com uma capacidade melhorada para produzir L- lisina no qual a proteína iniciadora de formação de septo é inativada.

[008] O termo "iniciador de formação de septo" como aqui usado se refere a um fator que é necessário para iniciar a formação do septo, i.e., uma estrutura membranosa que divide o interior de uma célula durante o processo de divisão celular de um microrganismo corineforme. A divisão celular pode ocorrer na presença do iniciador de formação de septo. Na presença do iniciador de formação de septo, o septo pode ser invaginado na porção periférica em torno do centro de uma célula para dividir o citoplasma em dois. A síntese de uma membrana externa pode ocorrer a seguir, seguida pela divisão celular. A proteína iniciadora de formação de septo pode ser uma proteína selecionada partindo das Tabelas 1 e 2. TABELA 1

TABELA 2

[009] O iniciador de formação de septo pode incluir uma proteína filamentosa sensível à temperatura (Fts). A proteína Fts é uma proteína que está envolvida na formação de divisomo, a qual pode ser necessária no processo de divisão celular de um microrganismo. A proteína Fts pode incluir FtsB, FtsA, FtsZ, FtsEX, FtsK, FtsQ, FtsW, FtsI, ou uma combinação desses, especificamente, FtsB. FtsB pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 70% de homologia com as mesmas, especificamente, 80% de homologia com as mesmas, mais especificamente 90% de homologia com as mesmas, o mais especificamente 95% de homologia com as mesmas. O termo "homologia" se refere ao grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos, que podem ser determinadas usando métodos utilizando BLAST 2.0 para calcular um parâmetro, como pontuação, identidade, ou similaridade, a qual seja amplamente conhecida desses comuns habilitados na técnica.

[010] Um gene codificando uma proteína Fts pode ser um ácido nucleico codificando ftsA, ftsB, ftsZ, ftsEX, ftsK, ftsQ, ftsW, ftsI, ou uma combinação desses.

[011] O gene ftsB envolvido na divisão celular de um microrganismo coriniforme pode formar divisomo assim como ftsZ, ftsEX, ftsK, ftsQ, ftsW, e classe B de Peso Molecular Elevado (HMW)-PBPs. O gene ftsB pode ser um ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. O gene ftsB pode ser, por exemplo, um número de registro NCBI do gene NCg10936. O termo "Um número de registro NCBI do gene NCg10936" se refere a um gene tendo uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 derivado de cepas de Corynebacterium glutamicum. Adicionalmente, o gene pode estar presente em microrganismos do gênero Corynebacterium e produzindo substancialmente o mesmo produto como faz um número de registro NCBI do gene NCg10936. A expressão "substancialmente a mesma" como aqui usado significa a mesma atividade e mecanismo de controle como esses do produto de um número de registro NCBI do gene NCg10936.

[012] O termo "inativação" como aqui usado significa nenhuma exibição de um nível de atividade de células ou enzimas, as quais podem ser medidas no mesmo tipo de células ou enzimas originais comparáveis com elas. O mesmo tipo de células comparáveis com essas podem ser células que não tenham sido manipuladas tais como por recombinação ou modificação. No microrganismo, a inativação de uma proteína iniciadora de formação de septo pode referir ter sido removida uma atividade de polipeptídios, os quais codificam o iniciador de formação de septo. Para além disso, no microrganismo, a proteína iniciadora de formação de septo pode ser inativada até um grau suficiente para produzir L- lisina.

[013] A inativação pode ser causada por um método de recombinação. O método de recombinação pode incluir método de recombinação homóloga. O método de recombinação homóloga podendo ser realizado por transformação de um vetor incluindo uma porção de sequências do gene a um microrganismo e cultivando o microrganismo na presença do produto de um marcador seletivo, e, portanto, a porção de sequências do gene e os genes endógenos no microrganismo podem sofrer recombinação homóloga. O vetor pode ser um vetor pDZ-ΔftsB W140* incluindo um número de registro NCBI do fragmento de gene NCg10936 representado pela SEQ ID NO: 4 ou um vetor pDZ- ftsB W140* o fragmento de gene de registro NCBI NCg10936 representado pela SEQ ID NO: 6. Através da recombinação homóloga, os genes endógenos no microrganismo podem ser recombinados, e de entre os genes de recombinação, recombinantes incluindo o marcador podem ser selecionados pelo marcador seletivo. Pelo método de recombinação homóloga, um microrganismo do gênero Corynebacterium, no qual um número de registro NCBI do gene NCg10936 endógeno é inativado, pode ser obtido.

[014] No microrganismo, a inativação da atividade de proteína pode ser causada por deleção, substituição, adição, inversão, ou uma combinação desses de uma base, um nucleosídeo, um nucleotídeo, ou uma combinação de um gene desses. Em detalhe, exemplos de um método para ativar a atividade de proteína pode ser a abordagem nocaute de gene, a tecnologia antisentido, ou a tecnologia de RNAi. O método de inativação da atividade de proteína pode incluir ainda a deleção da cópia inicial de cada gene, substituindo a cópia inicial com um mutante, ou expressando a cópia inicial partindo de um promotor fraco. Adicionalmente, a substituição de um promotor de um gene codificando a proteína, transferência de mutação randomizada ou mutagênese direcionada a sítio, ou disrupção de gene ou nocaute podem ser também usados. Ademais, métodos de introdução de elementos instáveis ao mRNA ou aberração do sítio de ligação a ribossomo (RBS) de RNA por modificação de gene podem ser também usados.

[015] A inativação de genes pode ser alcançada por transformação de um vetor incluindo uma porção de um gene de número de registro NCBI NCg10936 e um marcador seletivo para um microrganismo do gênero Corynebacterium, seguido pelo cultivo na presença de antibióticos e seleção.

[016] O marcador seletivo pode ser para selecionar as células transformadas com o vetor. O marcador seletivo pode ser um marcador conferindo um fenótipo selecionável, tal como resistência a fármaco, auxotrofia, resistência a fármacos citotóxicos, ou expressão de proteínas de superfície.

[017] O microrganismo corineforme pode ser selecionado partindo do grupo consistindo de Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium pseudogenitalium, Corynebacterium genitalium, Corynebacterium accolens, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium casei, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium paurometabolum, e L-lisina produzindo mutantes produzidos partindo de um tipo selvagem dos mesmos. Especificamente, o microrganismo corineforme pode ser Corynebacterium glutamicum. O Corynebacterium glutamicum pode ser um Corynebacterium glutamicum com o No. de Registro KCCM11016P, KCCM10770P, KCCM11347P, ou CJ3P.

[018] O termo "microrganismo corineforme" como aqui usado se refere a um microrganismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir L-lisina. Exemplos do microrganismos corineformes podem incluir um microrganismo do gênero Corynebacterium com uma capacidade melhorada para produzir L-lisina ao qual uma mutação é introduzida para a inativação de um gene codificando uma proteína iniciadora de formação de septo por causa de melhoria da capacidade para produzir L-lisina. A expressão "com e/ou a capacidade para produzir L-lisina" significa, quando o microrganismo é cultivado em um meio, o microrganismo tem a capacidade de produzir e secretar L- lisina no meio. O microrganismo corineforme pode ser um microrganismo que pode produzir e acumular L-lisina em uma grande quantidade em um meio de cultivo, se comparado com um tipo selvagem dos mesmos ou uma cepa mãe.

[019] De acordo com uma modalidade de realização, um gene codificando a proteína iniciadora de formação de septo por exemplo, FtsB em um microrganismo corineforme é inativada, desse modo a divisão celular do microrganismo corineforme pode ser inibida, enquanto que a capacidade para produzir L-lisina pode ser melhorada, relativamente.

[020] Um outro aspecto provê um método para produzir L-lisina, o método incluindo cultivar um microrganismo de acordo com a presente invenção de modo a para produzir L-lisina em um meio de cultivo; e recuperando L-lisina a partir do microrganismo ou do meio de cultivo. O microrganismo é o mesmo como descrito acima.

[021] O cultivo do microrganismo podendo ser realizado em um meio apropriado sob condições de cultivo que são bem conhecidos na técnica. Esse processo de cultivo pode ser facilmente ajustado dependendo do microrganismo a ser selecionado. O método de cultivo pode incluir pelo menos, um selecionado a partir do grupo consistindo em cultura descontínua, cultura contínua, e da cultura descontínua com alimentação.

[022] O meio utilizado na cultura pode cumprir os requisitos de um microrganismo específico. O meio pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em fontes de carbono, fontes de nitrogênio, elementos vestigiais, e uma combinação desses.

[023] A fonte de carbono pode ser selecionada partindo do grupo consistindo de carboidratos, lipídios, ácidos gordos, álcoois, ácidos orgânicos, e uma combinação desses. O carboidrato pode ser glucose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose, ou uma combinação desses. O lipídio pode ser óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, óleo de coco, ou uma combinação desses. O ácido gordo pode ser o ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ou uma combinação desses. O álcool pode ser glicerol ou etanol. O ácido orgânico pode incluir ácido acético.

[024] A fonte de nitrogênio pode incluir uma fonte de nitrogênio orgânico, uma fonte de nitrogênio inorgânico, ou uma combinação desses. A fonte de nitrogênio orgânico pode ser selecionada partindo do grupo consistindo de peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de milho (CSL), farinha de soja, e uma combinação desses. A fonte de nitrogênio inorgânico pode ser selecionada partindo do grupo consistindo de ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, e uma combinação desses.

[025] O meio pode incluir um selecionado partindo do grupo consistindo de fósforo, sais de metal, aminoácidos, vitaminas, precursores, e uma combinação desses. A fonte de fósforo pode incluir dihidrogenofosfato de potássio, fosfato dipotássico, e um sal contendo sódio correspondente aos mesmos. O sal de metal pode ser sulfato de magnésio e sulfato de ferro.

[026] O meio ou componentes individuais podem ser adicionados ao meio de cultivo em uma cultura descontínua, uma cultura contínua, ou uma cultura alimentada descontínua.

[027] No método de cultivo, o pH da cultura pode ser ajustado. O ajuste do pH pode ser realizado adicionando hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico à cultura. Adicionalmente, o método de cultivo pode incluir prevenção da formação de bolhas de ar. A prevenção da formação de bolhas de ar podendo ser realizada usando um agente antiespuma. O agente antiespuma pode incluir éster poliglicólico de ácido gordo. Adicionalmente, o método de cultivo pode incluir injeção de gás em uma cultura. O gás pode incluir qualquer gás para manter a condição aeróbia da cultura. O gás pode ser oxigênio ou gás contendo oxigênio. O gás contendo oxigênio pode incluir ar. Na cultura, a temperatura da cultura pode ser em um intervalo de 20 até 45 °C, por exemplo, 22 até 42 °C, ou 25 até 40 °C. A cultura pode ser continuada até a produção de L-lisina atingir o nível desejado.

[028] Em um método de acordo com a presente invenção, a cultura pode ser de cultura contínua ou cultura descontínua, como em lotes, em lotes alimentado, e cultura descontínuas de alimentação em lotes repetidos. Esses métodos de cultivo são bem conhecidos na técnica, e podendo ser usado qualquer método adequado. O L-aminoácido pode ser separado e analisado por cromatografia de permuta aniônica e derivatização de ninidrina.

EFEITOS VANTAJOSOS DO PEDIDO

[029] De acordo com o microrganismo, em que um gene codificando uma proteína iniciadora de formação de septo é inativada, de acordo com um aspeto, a capacidade do microrganismo para produzir L-lisina pode ser melhorada.

[030] De acordo com um método para produzir L- lisina de acordo com um aspeto, a L-lisina pode ser produzida com alta produtividade.

MODO DA INVENÇÃO

[031] De aqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhe com referência aos Exemplos. Porém, esses Exemplos são somente para fins ilustrativos, e o escopo da presente invenção não pretende ser limitado por esses Exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE INATIVADO PELO GENE FTSB POR DELEÇÃO

[032] A sequência de nucleotídeos de um gene ftsB (SEQ ID NO: 2) foi obtida, com base na sequência base no GenBank do US National Institute of Health (NIH Genbank). Visando fazer um fragmento de gene em que a grelha de leitura aberta de ftsB desapareceu internamente, com base na SEQ ID NO: 2, os primers 0936F1, 09369R1, 0936F2, e 0936R2 foram construídos e chamados de SEQ ID NOs: 7 até 10, respetivamente.

[033] Visando preparar um vetor recombinante inativado devido a deleção do gene ftsB, foi usado um vetor pDZ (refere-se à Registro de Patente Coreana No. 10-0924065). Depois, como descrito acima, as moléculas de ácido nucleico construídas para inativação, tendo a sequência modificada do gene ftsB, foram inseridas em um sítio de multi-clonagem do vetor pDZ, preparando assim um vetor pDZ-ΔftsB incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. A sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4 codifica um aminoácido tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[034] O PCR foi realizado usando DNA genômico ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um modelo e usando os primers 0936F1-0936R1 e 0936F2-0936R2. Usou-se DNA polimerase de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) como uma polimerase. As condições de PCR foram as seguintes; desnaturação a 96 °C durante 30 segundos, recozimento a 58 °C durante 30 segundos, polimerização a 72 °C durante 2 minutos, e 30 ciclos.

[035] Como resultado, foi obtido um par de fragmentos de DNA ftsB-A e ftsB-B, cada incluindo gene ftsB de 74 pb e 95 pb, respetivamente. Os produtos amplificados foram clonados no vetor pDZ usando Kit de clonagem de infusão (Invitrogen), resultando na construção de um vetor pDZ-ΔftsB. O vetor pDZ-ΔftsB inclui ambas as terminações XbaI de 135 pb ftsB e um fragmento sem 408 pb da região interna de ftsB.

EXEMPLO 2 : PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE INATIVADO PELO GENE FTSB POR INTRODUÇÃO DE CÓDON DE PARAGEM

[036] Visando preparar um vetor recombinante inativado pelo gene ftsB por introdução de códon de paragem, foi usado um vetor pDZ, e foi construído um primer para substituir o anticódon do 140° aminoácido na grelha de leitura aberta do gene ftsB, i.e., triptofano, com um códon de paragem. Usando um par de primers 0936 F1 e 0936 R3 e um par de primers 0936 F3 e 0936R2, o PCR para amplificação foi realizado do mesmo modo que no Exemplo 1, e os produtos amplificados clonados em um vetor pDZ, resultando na construção de um vetor pDZ-ftsB W140*. As sequências do par de primers 0936F3 e 0936R3 foram indicadas como SEQ ID NO: 11 e 12, respetivamente. A sequência dos aminoácidos do gene fts clonado no vetor construído foi a SEQ ID NO: 5, e a sequência dos ácidos nucleicos dos mesmos foi SEQ ID NO: 6 (sequência de nucleotídeos).

EXEMPLO 3 : CONSTRUÇÃO DA CEPA INATIVADA PELO GENE FTSB

[037] A cepa KCCM11016P de produção de L-lisina de Corynebacterium glutamicum (a (antiga) Número de registro KFCC10881, se refere ao Registro de Patente Coreana No. 100159812 e 10-0397322) foi transformada com os vetores recombinantes construídos nos Exemplos 1 e 2 por um método de pulso elétrico (usando o método de transformação de Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). Depois, a cepa possuindo o gene alvo inserido por homologia de gene no cromossoma foi selecionada a partir do meio de seleção contendo 25 mg/L de canamicina. A inserção bem-sucedida do vetor no cromossomo foi confirmada observando se a colônia era azul em meio sólido contento X-gal (5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactosideo). A cepa de inserção no cromossomo primário foi cultivada com agitação em um meio nutritivo (à temperatura de 30 °C durante 8 horas), o qual foi, em seguida, diluído de 10-4 até 10-10, seguido por sementeira no meio sólido contendo X-gal. Enquanto a maioria das colônias eram azuis, houve algumas colônias que eram brancas. Se selecionou essa baixa taxa de colônias brancas, as quais procederam à seleção da cepa na qual o gene ftsB foi inativado pelo cruzamento secundário.

[038] Visando a seleção da cepa na qual o gene ftsB foi inativado por deleção, um par de primers específicos de gene, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 10, 0936F1-0936R2 foram usados como primers para realizar o PCR. A sequência base em relação a um sítio alvo foi analisada para confirmação final, resultando na construção da cepa KCCM11016P-ΔftsB inativada devido à deleção do gene ftsB. Visando a seleção da cepa na qual o gene ftsB inativado devido à transferência do códon de paragem modificado, foi usado um par de primers, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 10, 0936F1-0936R2 como primers para realizar o PCR. A sequência base em relação ao sítio alvo foi analisada para confirmação final, resultando na construção da cepa KCCM11016P-ftsB W140* de gene inativado ftsB devido à introdução de um códon de paragem.

[039] Para examinar os efeitos em outras cepas pertencendo ao gênero Corynebacterium glutamicum, usando KCCM10770P (referente ao Registro de Patente Coreana No. 100924065), KCCM11347P (refere a Registro de Patente Coreana No. 10-1994-0001307) e CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) como cepas mães, cepas de gene ftsB eliminado e cepas de códon de paragem introduzido, i.e., KCCM10770P- ΔftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM11347P-ΔftsB, KCCM11347P- ftsB W140*, CJ3P-ΔftsB, CJ3P-ftsB W140*, foram construídas do mesmo modo que no método acima.

EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE L-LISINA EM CEPA DE GENE FTSB INATIVADO

[040] As cepas produtoras de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-Δ ftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ΔftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P- ΔftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ΔftsB, e CJ3P-ftsB W140* construídas no Exemplo 3 foram cultivadas para a produção de L-lisina, como no método seguinte.

[041] A cepa mãe Corynebacterium glutamicum e KCCM11016P-ΔftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ΔftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ΔftsB, KCCM11347P-ftsB W140*, CJ3P-ΔftsB, e CJ3P-ftsB W140* foram, cada uma, inoculadas em um frasco sem esquinas de 250 mL contendo 25 mL de meio de cultivo de sementes, seguido pelo cultivo com agitação a 30 °C durante 20 horas com 200 revoluções por minuto (rpm). Depois, 1 mL de cada um dos meios de cultivo de sementes foi inoculado em um frasco sem esquinas de 250 mL contendo 24 mL de meio de produção, seguido por cultivo com agitação a 30 °C durante 120 horas com 200 rpm. As composições do meio de cultivo de sementes e o meio de produção são como a seguir.

[042] Meio de cultivo de sementes (pH 7,0)

[043] açúcar bruto 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0,5 g, biotina 100 μg, tiamina HCl 1000 μg, pantotenato de cálcio 2000 μg, nicotinamida 2000 μg (em água destilada 1 L)

[044] Meio de Produção (pH 7,0)

[045] glucose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de soja 2,5 g, sólidos de infusão de milho 5 g, ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0,5 g, biotina 100 μg, cloridrato de tiamina 1000 μg, pantotenato de cácio 2000 μg, nicotinamida 3000 μg, CaCO3 30 g (em água destilada 1 L)

[046] Depois de completada a cultura, a produção de L-lisina foi medida através do método usando HPLC. As concentrações de L-lisina nas soluções de cultivo da cepa mãe de Corynebacterium glutamicum e KCCM11016P- Δ ftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ΔftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ΔftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ΔftsB, e CJ3P-ftsB W140* são mostradas na Tabela 3. Os resultados mostrados na Tabela 3 são o valor médio por experimento repetitivo. TABELA 3

[047] Como mostrado na Tabela 3, quando um gene ftsB foi deletado ou se introduziu um códon de paragem na cepa mãe KCCM11016P, a produção de lisina aumentou em cerca de 4% em todas elas. Estes resultados indicam que a concentração de lisina aumentou não devido a alterações estruturais do próprio gene ftsB mas devido à deleção da proteína FtsB que é um iniciador de formação de septo. Adicionalmente, as concentrações em lisina das cepas inativadas em FtsB de outras cepas mães, KCCM10770P, KCCM11347P, e CJ3P, aumentaram em cerca de 4%, se comparado com as cepas mães contendo a atividade FtsB de tipo selvagem. Por outro lado, o volume celular das cepas inativadas FtsB decresceu em cerca de 5%, se comparado com as cepas mães. Este resultado implica que a capacidade para produzir lisina pode ser melhorada controlando a quantidade de cepas devido à supressão de divisão celular das cepas produtoras de lisina. As KCCM11016P-ftsB W140* (CA01-2274) foram depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms, localizado em Urim bd., Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea em 27 de setembro, 2013 sob o Número de Registro KCCM11454P.

[048] Autoridade depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (international)

[049] Número de registro: KCCM 11454P

[050] Data de registro: 27 de setembro, 2013

Claims

1. MICRORGANISMO CORINEFORME COM UMA CAPACIDADE MELHORADA PARA PRODUZIR L-LISINA, na qual a proteína iniciadora de formação de septo é inativada, em que a proteína iniciadora de formação de septo é uma proteína B filamentosa sensível a temperatura (FtsB), em comparação com a cepa mãe, em que o microorganismo corineforme é Corynebacterium glutamicum, em que o gene é caracterizado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, e suas sequências degeneradas, codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, e pelo gene estar inativado.

2. MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA, caracterizado pelo método compreender: cultivar o microrganismo, conforme definido na reivindicação 1, para produzir L-lisina em um meio de cultivo; e recuperar a L-lisina a partir do microrganismo ou do meio de cultivo.