BR102014025736A2 - genes que codificam proteínas inibidoras da formação de biofilme e um método de produção de l-lisina que utiliza uma estirpe bacteriana com os genes inativados - Google Patents

Abstract

genes que codificam proteínas inibidoras ~da formaçao de biofilme e um método de produçao de l-lisina que utiliza uma estirpe bacteriana com os genes inativados". d a presente invenção refere-se a um novo gene (polinucieotídeo) isolado derivado de bactérias corynpeform, que codifica uma proteína com atividade inibitória da formaçao de biofilme, a uma estirpe produtora de l-lisina na quai o polinucieotídeo está inativado e a um métodopara a produção de l- lisina que utiliza a mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "GENES QUE CODIFICAM PROTEÍNAS INIBIDORAS DA FORMAÇÃO DE BIOFILME E UM MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L-LISINA QUE UTILIZA UMA ESTIRPE BACTERIANA COM OS GENES INATIVADOS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a novos genes isolados que codificam uma proteína com atividade inibitória da formação de biofilme e a um método para a produção de L-lisina que utiliza uma estirpe bacteriana na qual o gene se encontra inativado. 2. Descrição da Arte Relacionada [002] As bactérias competem com outros microrganismos por nutrientes ao crescerem sob diferentes condições de crescimento. Quando as condições de crescimento se tomam desfavoráveis e ameaçam a sobrevivência das bactérias, estas utilizam vários mecanismos de sobrevivência, incluindo a formação de biofilmes.

[003] Os biofilmes são arranjos de microrganismos envoltos em uma matriz autoproduzida de polímeros extracelulares, que funciona como um consórcio cooperativo. Os biofilmes servem como barreiras de proteção e permitem que em condições adversas, tais como tratamentos com antibióticos, respostas imunitárias do hospedeiro e agentes antibacterianos, as bactérias sobrevivam nos biofilmes como comunidades.

[004] É sabido que quando a massa de bactérias aumenta, o rendimento da produção de L-lisina diminui. Por conseguinte, há o problema de o rendimento de produção da L-lisina depender de alterações na massa bacteriana.

[005] Após inúmeros testes, os inventores da presente invenção conseguiram identificar um gene relacionado com a inibição da formação de biofilme em uma estirpe bacteriana produtora de L-lisina. Constataram igualmente que a taxa de crescimento da estirpe podia ser aumentada pela inativação do gene, conduzindo a um aumento na massa bacteriana. Inesperadamente, verificaram também que o rendimento na produção de L-lisina não diminuía de todo apesar do aumento na massa bacteriana, dando assim por concluída a presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO

[006] Um objeto da presente invenção é proporcionar um novo gene isolado que codifica uma proteína com uma atividade inibitória da formação de biofilme em uma estirpe produtora de L-lisina, uma estirpe produtora de L-lisina na qual o gene está inativado, e um método de produção de L-lisina que utiliza uma estirpe produtora de L-lisina na qual o gene está inativado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[007] A Fig. 1 mostra os resultados do teste permissivo de crescimento relativos aos níveis de expressão do promotor do gene NCgl0350 (SEQ ID NO: 2) após tratamento dos caldos de cultura livres de células obtidos a partir de bactérias G ram-negativas ou Gram-positivas cultivadas até à fase estacionária. As bactérias Gram-negativas utilizadas foram Âgrobacterium tumefaciens (A. I), Escherichia coli (E. c.), Pseudomonas aeruginosa (P. a.), Salmonella typhimurium (S, t.) e Vibvrio harveyi (V. h.), e as bactérias Gram-positivas foram Bacillus subtiiis (B. s.), Corynebacteríum ammoniagenes (C. a.), Mycobacterium smegmatis (M. s.), Mycobacterium sp. estirpe JC1 (MJC1), Staphylococcus aureus (S. a.) e Streptomyces natalensis (S. n.), [008] A Fig. 2(a) ilustra um processo de preparação do vetor pHS1004 para medir o nível de expressão do promotor do gene PA5238 de Pseudomonas aeruginosa que é semelhante ao gene NCgl0350, em que o vetor pHS1004 é preparado por ligação do promotor de PA5238 a montante do gene lacZ sem promotor do vetor pDN19lac Ω.

[009] A Fig. 2(b) mostra que a expressão do promotor de PA5238 foi induzida proporcionalmente à concentração do caldo de cultura livre de células. O caldo de cultura sem células foi obtido a partir da solução de cultura em fase estacionária, em que Pseudomonas aeruginosa foi transduzida com o vetor PHS1004.

[010] A Fig. 2(c) mostra o tempo de tratamento do caldo de cultura livre de células necessário para medir a expressão do gene PA5238 em Pseudomonas aeruginosa transduzida com o vetor pHS1004.

[011] A Fig. 3 mostra que foi induzida expressão do promotor do gene PA5238 em Pseudomonas aeruginosa transduzida com o vetor pHS1004 utilizando os caldos de cultura livres de células obtidos a partir de uma solução de cultura de bactérias em fase estacionária. As bactérias induziram a expressão do promotor do gene NCgl0350 nas bactérias utilizadas na Fig. 1. As bactérias Gram-negativas utilizadas foram Escheríchia coli (E. c.) e Salmonella typhimuríum (S. t), e as bactérias Gram-positivas utilizadas foram Bacillus subtilis (B. s.), Corynebacteríum glutamicum (C. g.), Mycobacteríum smegmatis (M. s.), Mycobacteríum sp. estirpe JC1(MJC1) e Staphylococcus aureus (S. a.).

[012] A Fig. 4 mostra os resultados do teste permissivo de crescimento para a expressão do promotor do gene NCgl0350 em uma estirpe do tipo selvagem de Corynebacteríum glutamicum (C. g.) e em uma estirpe com o gene NCgi2909 inativado preparada a partir daquela.

[013] A Fig. 5 apresenta o nível de formação de biofilme em uma estirpe mutante de NCgl2909 e na estirpe do tipo selvagem de Corynebacteríum glutamicum.

[014] A Fig. 6 ilustra o nível de formação de biofilme de uma estirpe mutante de PA5309 de Pseudomonas aeruginosa tendo homologia com NCgl2909 de Corynebacteríum glutamicum, e de uma estirpe mutante do gene PA5238 de Pseudomonas aeruginosa tendo homologia com o gene NCgl0350 de Corynebacteríum glutamicum, que foi comparado com aqueles da estirpe do tipo selvagem e de um grupo controle negativo (estirpe mutante pitA).

[015] A Fig. 7 mostra os inicíadores e os codões de iniciação utilizados na clonagem da região promotora de PA5238 de Pseudomonas aeruginosa. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

PREFERENCIAIS

[016] Uma forma de realização da presente invenção proporciona um novo polinucleotídeo isolado (NCgl2909), representado pela sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, que codifica uma proteína com uma atividade inibitória da formação de biofilme bacteriano, ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína de atividade equivalente.

[017] O polinucleotídeo (NCgl2909) representado pela SEQ ID NO: 1 é um gene que codifica uma subunidade da D-aminoácido-desidrogenase em bactérias Coryneform e está localizado a montante do gene da aciltransferase (NCgl0350) representado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo (NCgl2909) regula a expressão do gene da aciltransferase (NCgl0350) e de um seu promotor. Em particular, o polinucleotídeo (NCgl2909) representado pela SEQ ID NO: 1 inibe a formação de biofilme através da expressão do gene da aciltransferase na presença de um caldo de cultura livre de células de bactérias replicadas até à fase estacionária.

[018] Como aqui empregue, o termo "um gene (polinucleotídeo) que codifica uma proteína com atividade inibitória da formação de biofilme" refere-se a um gene que codifica uma proteína envolvida no mecanismo de inibição da formação de biofilme. Além disso, poderão ser incluídos um gene inibidor da expressão de um gene que codifica uma substância necessária para a formação de biofilme, um gene que codifica uma substância necessária para a dispersão de células a partir do biofilme, um gene que codifica uma proteína envolvida na regulação para induzir a expressão do gene ou a modificação de metabolitos extracelulares ou intracelulares acompanhada da formação de biofilme.

[019] Como aqui empregue, o termo "polinucleotídeo que codifica uma proteína de atividade equivalente" inclui um seu equivalente funcional desde que mantenha a atividade da proteína codificada pelo polinucleotídeo, e pode incluir variantes preparadas pela deleção, substituição, inserção ou combinação de uma sequência nucleotídica parcial do polinucleotídeo, ou pela modificação artificiai, ou um fragmento funcional do poiinucleotídeo que executa a mesma ação, [020] Como aqui empregue, o termo "bactérias Coryneform" inclui microrganisrnos pertencentes ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium. As bactérias Coryneform podem incluir Corynebacterium glutamicum] outras estirpes de tipo selvagem que se sabe serem estirpes adequadas do gênero Corynebacterium, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes (C. thermoaminogenes), Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum (B. lactofermentum) e mutantes produtoras de L-aminoácido ou estirpes daí preparadas. Por exemplo, as bactérias poderíam ser Corynebacterium glutamicum KCCM11016P e Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, mas não lhes estando limitadas.

[021] Especificamente, a bactéria pode ser pelo menos uma selecionada do grupo constituído por Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes e Corynebacterium thermoaminogenes entre as bactérias corineformes.

[022] Mais especificamente, as bactérias podem ser bactérias com uma maior produtividade de L-lisina entre as bactérias Coryneform, nas quais um ou mais genes relacionados com a biossíntese da lisina foram melhorados.

[023] Como aqui empregue, o termo "caldo de cultura livre de células" refere-se a um caldo de cultura preparado pela cultura das bactérias até à fase estacionária, centrifugação da solução de cultura e filtração do sobrenadante através de um filtro, tal como um filtro de acetato de celulose, para remover as bactérias.

[024] O caldo de cultura livre de células inclui caldos de cultura livres de células de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Especificamente, no que diz respeito ao caldo de cultura de bactérias livre de células, as bactérias podem ser selecionadas do grupo que consiste de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacteríum sp. estirpe JC1 e Staphylococcus aureus. ~ ' [025] Como aqui empregue, o termo "fase estacionária" refere-se ao ponto em que as bactérias deixam de replicar após o crescimento bacteriano atingir um determinado nível. .

[026] O caldo de cultura livre de células das bactérias cultivadas até à fase estacionária inclui um autoindutor como mediador da perceção de quórum.

[027] Como aqui empregue, o termo "autoindutor" refere-se a um mediador da perceçáo de quórum, ou seja, uma molécula específica sintetizada por bactérias para sinalização em resposta a mudanças ambientais entre células exportadas ou importadas para fins de comunicação. Como autoindutores, podem referir-se autoindutores à base de acil-homoserina lactonas, à base de peptídeos e à base de furanona.

[028] Além disso, uma forma de realização da presente invenção proporciona bactérias Coryneform, em que o gene NCgl2909 (SEQ ID NO: 1), o gene NCgl0350 (SEQ ID NO: 2), ou o gene NCgl2909 e o gene NCgl0350 que codificam uma proteína com atividade inibitória da formação de biofilme bacteriano está/estão inativados.

[029] Especificamente, a bactéria Coryneform pode ser pelo menos uma selecionada do grupo constituído por Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes e Corynebacterium thermoaminogenes.

[030] Mais especificamente, as bactérias Coryneform podem ser quaisquer bactérias entre as bactérias Coryneform com maior produtividade de L-lisina, em que um ou mais genes relacionados com a biossíntese de lisina foram melhorados.

[031] O gene relacionado com a biossíntese da lisina pode incluir lysA (gene codificante da diaminopimelato-descarboxilase), lysC (gene codificante da aspartato-quinase), lysE (gene codificante do veículo de exportação da lisina) , dapA (gene codificante da di-hidrodipicolinato- sintase), dapB (gene codificante da di-hidrodipieoíinato-redutase), pyc (gene codificante da piruvato- carboxilase), asd (gene codificante da aspartato-semialdeído-desidrogenase), aspB (gene codificante da aspartato-aminotransferase) ou semelhantes. As bactérias onde o gene relacionado com a biossíntese da lisina se encontra melhorado podem ser bactérias Coryneform com a produtividade da L-lisina aumentada pelo aumento das atividades das enzimas codificadas por um ou mais genes selecionados entre os genes relacionados com a biossíntese da lisina.

[032] As atividades das enzimas codificadas pelos genes podem ser melhoradas pelo aumento do número de cópias do gene, pela substituição ou modificação de uma sequência de controle da expressão do gene, ou pela introdução de uma mutação em ORF. O aumento do número de cópias do gene pode incluir o aumento do número de cópias pela introdução de um gene exógeno, bem como a introdução adicional do gene endógeno. A substituição ou modificação da sequência de controle da expressão do gene pode consistir na inserção de um promotor forte exógeno a jusante do códão de iniciação do gene, ou na introdução de uma mutação para aumentar a atividade do promotor, ou na introdução de uma mutação para uma operação eficiente da sequência SD. A introdução de uma mutação no ORF do gene pode ser realizada por um ou mais métodos selecionados do grupo constituído por deleção, substituição e inserção de uma parte da sequência nucleotídica. A inserção, deleção e substituição de uma sequência nucleotídica no cromossoma do gene pode ser realizada por qualquer método conhecido na arte, por exemplo, recombinação homóloga.

[033] Exemplos de bactérias Coryneform com uma produtividade de L-lisina melhorada através do aumento da atividade das enzimas codificadas pelos genes podem incluir a estirpe Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, preparada .pela inserção de duas cópias dos genes aspB, lysC, asd, dapA, dapB e lysA em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que é uma estirpe produtora de lisina preparada por mutação artificial utilizando Corynebacterium glutamicum ATCC13Q32 do tipo selvagem como estirpe parental, a estirpe Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-CJ5, preparada pela inserção de duas cópias dos genes aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA e AJF na mesma. Confirmou-se que Corynebacterium glutamicum KCCM10770P apresentava um aumento na produção de L-lisina de cerca de 7% em comparação com a estirpe produtora de lisína Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, e a estirpe Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-CJ5 exibia um aumento de cerca de 8% na produção de L-lisina em comparação com a Corynebacterium glutamicum KCCM11016P {Patente Coreana n.° 100924065).

[034] Além disso, as bactérias Coryneform com uma maior produtividade de L-lisina podem ser a estirpe produtora de lisina Corynebacterium glutamicum KFCC1G750 (Patente Coreana n. 0 10-0073610) (n.° de registro KCCM11347), preparada por mutação artificial com ATCC13032 como estirpe parental, a Corynebacterium glutamicum CJ3P com capacidade de produção de L-lisina, preparada pela introdução das conhecidas mutações pyd(P458S), /7om(V59A), /ysC(T311i) em três tipos de genes e utilizando ATCC13032 como estirpe parental (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), ou a estirpe Corynebacterium glutamicum KCCM11085P com uma maior produtividade de L-lisina, preparada por um aumento na produção de NADPH pela via das pentoses-fosfato através da atenuação da atividade da gluconato-quinase (Publicação Disponível ao Público da Patente Coreana n.° 10-2012-0007965).

[035] Como aqui empregue, o termo "inativação de um gene" refere-se à redução ou eliminação da atividade da proteína codificada pelo gene devido à redução ou eliminação da expressão do gene através de uma mutação induzida por um ou mais métodos selecionados do grupo constituído por: deleção de todo ou de uma parte do gene correspondente, substituição de uma parte da sequência nucleotídica, ou inserção de um ou mais pares de bases na sequência nucleotídica.

[036] Como uma forma de realização da presente invenção, um vetor recombinante, incluindo uma parte do(s) gene(s) NCgl2909 (SEQ ID NO: 1) ou NCgl0350 (SEQ ID NO: 2), ou NCgI2909 e NCgl0350 é/são introduzidos em um microrganismo para induzir a inativação do gene endógeno, deste modo preparando-se um microrganismo no qual o mecanismo inibitório da síntese de biofilme se encontra inibido.

[037] Concretamente, os microrganismos podem ser preparados por um método que inclui: 1) obtenção de um fragmento polinucleotídico contendo uma parte de ambas as extremidades do gene; 2) construção de um vetor recombinante, introduzindo o fragmento polinucleotídico obtido no vetor capaz de realizar a recombinação homóloga no cromossoma das células do hospedeiro; 3) preparação de recombinantes homólogos pela introdução do vetor recombinante obtido em células hospedeiras capazes de produzir L-lísina; e 4) seleção de uma estirpe a partir dos recombinantes homólogos, na qual o(s) gene(s) NCgl2909 ou NCgl0350, ou NCgl2909 e NCgl0350 é/estão inativados.

[038] O vetor utilizado pode incluir um vetor pDZ e vetores baseados em pBR, em pUC, em pBluescriptll, em pGEM, em pTZ, em pCL e em pET, mas não lhes estando limitado. Especificamente, os genes atrás podem ser inativados utilizando um vetor pDZ (Patente Coreana n.° 10-0924065), que não se autorreplica em Corynebacterium glutamicum.

[039] Na presente invenção, a partir do vetor pDZ preparou-se um derivado com uma parte do gene codificante NCgl2909. O derivado de pDZ foi designado pDZ-ANCgl2S09 e transformado em uma estirpe de Corynebacterium glutamicum a fim de se preparar uma estirpe recombinante com o gene NCgi2909 inativado. A estirpe recombinante foi designada ATCC13032::ANCgl2909 ou KCCM11016P::ANCgl2909. De igual modo, um derivado de pDZ com uma parte do gene NCgl0350 foi preparado e designado pDZ-ANCgl0350. O pDZ-ANCg!0350 foi transformado em uma estirpe de Corynebacterium glutamicum a fim de se preparar uma estirpe recombinante com o gene NCg10350 eliminado. A estirpe recombinante foi designada KCCM11016p:ANCgl0350. Além disso, KCCM11016P::ANCgl2909 foi transformada com o plasmídeo recombinante pDZ-ANCgl0350 a fim de se preparar uma estirpe com ambos os genes codificantes NCgl2909 e NCgl0350 inativados, e a estirpe foi designada CA01-2270 (KCCM11016P::ANCgl2909ANCgl0350).

[040] A Corynebacterium glutamicum ATCC13032::ANCgl2909 da presente invenção apresentou uma capacidade de formação de biofilme 4 a 5 vezes superior à do tipo selvagem. Além disso, a bactéria corineforme, na qual o(s) gene(s) NCgl2909 ou NCgl0350, ou NCgl2909 e NCgl0350 está/estão inativados, é caracterizada pelo facto de a produção de L-lisina não ser menor apesar de a massa de bactérias ser maior, ao contrário das bactérias corineforme convencionais produtoras de L-lisina.

[041] Além disso, uma forma de realização da presente invenção proporciona um método de produção de L-lisina que utiliza bactérias corineformes, nas quais o(s) gene(s) NCgl2909 ou NCgl0350, ou NCgl2909 e NCgl0350 está/estão inativados.

[042] O método de produção de L-lisina inclui a cultura de bactérias corineformes, em que o(s) gene(s) NCgl2909 ou NCg!0350, ou NCgl2909 e NCgl0350 está/estão inativados em uma solução de cultura; e recuperação da L-lisina das bactérias cultivadas ου da sua solução de cultura.

[043] O método de cultura da bactéria corineforme, na qual o(s) gene(s) NCgl2909 ou NCglQ350, ou NCgl2909 e NCgl0350 está/estão inativados, pode ser levado a cabo por um método amplamente conhecido na arte. Especificamente, um processo descontínuo, um processo descontínuo alimentado, ou um processo descontínuo alimentado repetido podem ser utilizados de modo contínuo, mas a presente invenção não lhes está limitada.

[044] O meio ou solução de cultura deve satisfazer os requisitos de uma específica estirpe. É bem conhecida solução de cultura para estirpes de Corynebacterium (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D.C., USA, 1981). As fontes de carbono utilizadas podem incluir sacáridos e carboidratos como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e lipídios, tais como o óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos gordos como o ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico; álcoois tais como glicerol e etanoi; e ácidos orgânicos como o ácido acético. Estes materiais podem ser usados separadamente ou em combinação. As fontes de azoto podem incluir peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, farelo de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, por exemplo, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de azoto podem ser utilizadas separadamente ou em combinação. As fontes de fósforo podem incluir hidrogenofosfato dipotássico, di-hidrogenofosfato de potássio e correspondentes sais de sódio. Além disso, a solução de cultura pode conter sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou de sulfato de ferro, necessários para o crescimento. Por último, nutrientes essenciais como aminoácidos e vitaminas podem ser utilizados adicionalmente. Além disso, precursores adequados podem ser adicionados à solução de cultura. Estes materiais podem ser adicionados corretamente à cultura durante a cultura em modo descontínuo ou contínuo. No entanto, a presente invenção não está limitada aos mesmos [045] O pH da solução de cultura pode ser ajustado com um composto básico como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amónia, ou um composto ácido como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A formação de espuma pode ser contida com um agente antiespuma, tal como éster de poliglicol de ácido gordo. A solução de cultura pode ser mantida em condições aeróbias, com introdução de oxigênio ou de um gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na mesma. A temperatura de cultura é normalmente de 20° C a 45° C, e especificamente de 25° C a 40° C. A cultura continua até se produzir a máxima quantidade de L-lisina, ou seja, pode ser completada ao fim de 10 a 160 horas. Depois de produzida, a L-íísina pode ser exportada para o meio de cultura ou pode permanecer dentro das células.

[046] O método de recuperação da L-iisina a partir dos microrganismos ou da solução da cultura é affiplamente conhecido na arte. Como exemplos do método de recuperação de L-lisina podem referir-se filtração, cromatografia de permuta iónica, cristalização e HPLC, mas não lhes estando limitados.

[047] Os inventores da presente invenção selecionaram o polinucleotídeo PA5238 (SEQ ID NO: 3) de Pseudomonas aeruginosa com base no polinucleotídeo NCgl0350 que é regulado por um autoindutor segregado por bactérias corineformes divulgadas na concedida Patente Coreana n.° ΙΟ1134700 anteriormente apresentada pelos presentes inventores. Além disso, pesquisaram polinucieotídeos localizados a montante de PA5238, que funcionam como reguladores, e selecionaram o polinucleotídeo PA5309 (SEQ ID NO: 4). Por outro lado, com base em PA5309, selecionaram um polinucleotídeo semelhante NCgl2909 (SEQ ID NO: 1) em bactérias Coryneform. , ‘ [048] Em seguida, prepararam-se as estirpes de tipo selvagem com os genes selecionados representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 4 e as respetivas estirpes mutantes Com os genes inativados. Os efeitos observados na formação de biofilme confirmaram que as estirpes mutantes apresentavam uma formação de biofilme cerca de 4 vezes superior à das estirpes do tipo selvagem com os genes das SEQ ID NOs: 1 a 4.

[049] Por conseguinte, confirmou-se que os genes representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 4 podem inibir a formação de biofilme ou podem estar envolvidos no mecanismo de inibição da formação de biofilme.

[050] Além disso, os presentes inventores examinaram a produtibilidade da L-lisina de acordo com a proliferação da estirpe produtora de L-lisina em que o gene representado pelas SEQ ID NOs: 1 ou 2, ou os genes representados pelas SEQ íb NOs: 1 e 2 está/estão inativados. Verificou-se que o seu rendimento de produção de L-lisina não diminuiu, apesar de o rendimento de produção de L-lisina normalmente diminuir com o aumento da massa bacteriana. Confirmou-se assim que uma grande quantidade de L-lisina pode ser produzida em um curto período de tempo por esta estirpe, em comparação com a estirpe convencional.

[051] A seguir, a presente invenção será descrita em mais pormenor com referência a exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Indução da expressão do promotor do gene (NCql0350) da aciltransferase de bactérias Corvneform na presença de caldos de cultura livres de células obtidos a partir de várias bactérias <1 ~1 > Cultura de células na presença de caldo de cultura livre de células [052] Procedeu-se à cultura de Gorynebacteríum glutamicum ATCC13032 e de Corynebacterium ammoniagenes, sob agitação, em um meio MB (0,4% de extrato de levedura; 1% de triptona; 0,4% de Soytone; e 0,5% de NaCI; todos em p/v), a 30°C e durante 36 horas.

[053] Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacteríum smegmatis, Mycobacterium sp. estirpe JC1, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptomyces natalensis e Salmonella typhimurium foram cultivadas sob agitação em meio LB (0,5% de extrato de levedura; 1% de triptona; e 1% de NaCI; todos em p/v), a 37°C, durante 36 horas.

[054] Vibvrio harveyi foi cultivado sob agitação em meio LB contendo 3% de NaCI, a 37° C e durante 36 horas.

[055] As soluções de cultura dos 11 tipos de estirpes, exceto da Corynebacterium glutamicum ATCC13032, foram centrifugadas a 10 000 χ g durante 10 minutos e cada sobrenadante foi filtrado através de um filtro de acetato de celulose (0,2 pm) para se obter cada um dos caldos de cultura livre de células das estirpes.

[056] A estirpe Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi recuperada da solução de cultura, cuja cultura continuou do mesmo modo até a D.0.6oo ter atingido 1,8, e em seguida foi suspensa em meio MB preparado pela mistura de caldo de cultura livre de células e um meio novo, na proporção de 1:1, e a cultura continuou a 30°C durante É4 horas. <1-2> Indução da expressão do promotor do gene da aciltransferase na presença de caldo de cultura livre de células [057] A fim de examinar a expressão do promotor do gene NCgl0350 na presença de caldo de cultura livre de células, os presentes inventores utilizaram um método (doravante referido como 'teste permissivo de crescimento”) sugerido na concedida Patente Coreana n.° 10-1134700.

[058] Esse método será descrito mais detalhadamente como segue.

[059] A região promotora (SEQ ID NO: 1 da concedida Patente Coreana n.° 10-1134700) do gene NCgl0350 de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi amplificada. Esta região promotora amplificada foi inserida em um vetor T&A (Real Biotech Corporation), digeriu-se com Pstl e clonou-se em um vetor pSK1 CAT digerido com a mesma enzima, a fim de se preparar o vetor pHS09004 com a região promotora do NCg10350 inserida.

[060] O vetor PSK1 CAT utilizado na preparação do vetor pHS09004 é um vetor sem promotor que contém o gene CAT codificante da cloranfenicol-acetiltransferase, a qual confere resistência ao cloranfenicol em bactérias Gram-positivas.

[061] O vetor SK1CAT e o vetor pHS09004 foram transformados respetivamente em Corynebacterium glutamicum ATCC13032 do tipo selvagem e as respetivas estirpes transformantes C3 e C6(P0350:CAT) foram preparadas.

[062] As estirpes transformantes C3 e C6 foram cultivadas em meio MB contendo 30 pg/ml de canamicina, a 30°C, durante a noite.

[063] O caldo de cultura da estirpe foi diluído em uma relação de 1:2000, utilizando 2 ml de meio de análise preparado pela mistura de caldo de cultura livre de células e MB com cloranfenicol, em uma relação de 1:1 (v/v). Como grupo de controle utilizou-se 2 ml de meio MB contendo cloranfenicol. As estirpes transformantes foram cultivadas no meio de análise e no meio de controle a 30°C, durante 24 horas. O valor de D.O.eoo foi medido com um espectrofotómetro (SmartSpee 3000, Bio-Rad Laboratories, EUA) para observação do crescimento da estirpe.

[064] Como se pode ver na Fig. 1, as estirpes transformantes não cresceram no meio MB contendo cloranfenicol, enquanto apenas a estirpe C6(P0350:CAT) cresceu no meio de cloranfenicol preparado pela mistura do caldo de cultura livre de células e meio MB, na proporção 1:1.

[065] Estes resultados sugerem que a expressão do promotor do gene da aciltransferase é induzida na presença de caldos de cultura livres de células obtidos a partir de várias bactérias, exceto de Agrobacteríum tumefaciens, Vibvrio harveyi, Bacillus subtilis e Streptomyces natalensis.

Exemplo 2: indução da expressão do promotor do provável gene (PA5238) da antiaénio O-acetilase de Pseudomonas aeruainosa na presença de caldos de cultura livres de células [066] <2-1 > Construção do vetor de expressão contendo o promotor [067] No Exemplo 1, confirmou-se que a expressão do promotor do gene NCgl0350 aumentava na presença de caldo de cultura livre de células de Pseudomonas aeruginosa, Com base nestes resultados, a fim de construir um sistema de avaliação utilizando Pseudomonas aeruginosa, pesquisou-se um gene semelhante ao NCgl0350 em Pseudomonas aeruginosa, Como resultado, selecionou-se um provável gene (PA5238) da antigénio O-acetilase, representado pela SEQ ID NO: 3, com uma homologia de 36% e semelhança de 51%.

[068] A fim de examinar a expressão do gene PA5238 na presença de caldo de cultura livre de células, um vetor de expressão do promotor do gene PA5238 foi construído como se mostra na Fig. 2(a).

[069] Mais especificamente, isolou-se o DNA genómico de Pseudomonas aeruginosa PAK e, em seguida, a região promotora de PA5238, representada pela SEQ ID NO: 7, foi amplificada com um par de iniciadores de PCR para clonagem (5238F/5238R) conforme se mostra na Tabela 1 (Fig. 7).

Tabela 1 Iniciador Sequência nucleotídica SEQ ID NO: PA5238F 5’-GTGGTCATCCTGCTCGACTCCATCACC-3’ 5 PA5238R 5’-CGAGGCGAACATCGTCTGGTAACGCAC-3’ 6 [070] A região promotora assim amplificada foi inserida no vetor T&A (Real Biotech Corporation), digeriu-se com Kpnl e clonou-se em um vetor pDN19lacQ previamente digerido com a mesma enzima a fim de se obter um vetor pHS1004 com o promotor de PA5238 inserido (Fig. 2(a)).

[071] O vetor pDN19lacQ utilizado na preparação do vetor pHS1004 é um vetor sem promotor, que inclui ó gene lacZ codificante da B-galactosidase envolvida no desenvolvimento de cor com X-Gal ou ONPG em Pseudomonas aeruginosa Pak <2-2> Indução da expressão do promotor do provável gene (PA5238) da antigénio O-acetilase na presença de caldos de cultura livres de células [072] O vetor pDN19lacQ e o vetor pHS1Q04 foram transformados em Pseudomonas aeruginosa PAK do tipo selvagem a fim de preparar os respetivos transformantes P19 e P18 (P5238:lacZ).

[073] Os transformantes P19 e P18 foram cultivados em meio LM contendo cada 100 pg/ml de espeetinomieina e estreptomicina respetivamente, a 37° C e durante a noite, [074] O caldo de cultura livre de células de Pseudomonas aeruginosa foi misturado com meio LB em várias proporções (v/v) como indicado na Fig, 2(b) a fim de preparar 2 ml de meio de análise e, em seguida, o meio de análise foi utilizado para incubação durante 6 horas. Mais especificamente, o caldo de cultura livre de células e meio LB foram misturados na proporção de 0,25 ml:1,75 ml, 0,5 ml:1,5 ml, 0,75 ml:1,25 ou 1,0 ml:1,0 ml afim de preparar 2 ml de meio de análise de cada vez. Como grupo de controle utilizou-se apenas 2 ml de meio LB.

[075] As estirpes transformantes foram misturadas na proporção de 1,0 ml:1,0 ml como na Fig. 2(c) a fim de se obter um total de 2 ml de meio de análise, e foram cultivadas em meio de análise para diferentes tempos de tratamento, a 37°C.

[076] Os níveis de expressão da B-galactosidase foram detetados por análise da β-galactosidase com um espectrofotómetro (SmartSpec 3000, BioRad Laboratories, EUA).

[077] Como se pode ver na Fig. 2 (b), os níveis de expressão não aumentaram no grupo de controle, ao passo que a estirpe P18(P5238:lacZ) mostrou um aumento na expressão da β-galactosidase de acordo com a concentração do caldo de cultura livre de células de Pseudomonas aeruginosa.

[078] Além disso, confirmou-se que a expressão da β-galactosidase aumentava proporcionalmente ao tempo de tratamento do caldo de cultura livre de células, e que era particularmente necessário um tempo de pelo menos 6 h de tratamento. , [079] Estes resultados confirmaram que a expressão do promotor do provável gene (PA5238) da antigénio O-acetilase pode ser induzido na presença de caldo de cultura livre de células de Pseudomonas aeruginosa. Exemplo 3: Indução da expressão do promotor do provável gene (PA52381 da antiaénio O-acetilase de Pseudomonas aeruginosa na presença de caldos de cultura livres de células obtidos a partir de várias bactérias [080] Caldos de cultura livres de células foram preparados a partir de várias bactérias, do mesmo modo que em <1-1 > do Exemplo 1, e os níveis de expressão da Β-galactosidase nos caldos de cultura livres de células foram avaliados por análise da Β-galactosidase como descrito em <2-2> do Exemplo 2.

[081] Especificamente, caldos de cultura livres de células de Corynebacterium glutamiçum, Escheríchia coli, Saimonella typhimurium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis e Mycobacterium sp. estirpe JC1 foram preparados como em <1-1 > do Exemplo 1, e os níveis de expressão da Β-galactosidase foram examinados. Confirmou-se que os caldos de cultura livres de células de várias bactérias que induzem a expressão do promotor do gene NCgl0350 de bactérias corineformes tal como na Fig. 1 também aumentam a expressão do promotor do gene PA5238 de Pseudomonas aeruginosa conforme se mostra na Fig. 3.

Exemplo 4: Pesquisa para detecão do gene regulador epistático e identificação do gene detetado <4-1 > Pesquisa para deteção do gene regulador epistático [082] Ο PA5238 (SEQ ID NO: 3) de Pseudomonas aeruginosa identificado no Exemplo 3 e o seu promotor (SEQ ID NO: 7) foram usados para pesquisar o gene epistático relacionado com a sua regulação. Para a pesquisa, pBT20 (Molecular Microbiology 55(2): 368-380, 2005) com um transposão Mariner foi transformado, através de conjugação, em Pseudomonas aeruginosa contendo pHS1004.

[083] Em um pool de mutantes inserido em um transposão, os mutantes não apresentaram nenhum aumento no nível de expressão apesar do tratamento com o caldo de cultura livre de células, aparecendo assim como colônias brancas em um meio de deteção contendo X-Gal. Os genes inseridos no transposão foram analisados por PCR aleatória (Molecular Microbiology 55(2): 368-380, 2005) seguida de sequenciação.

[084] Entre os genes analisados no estudo de homologia de aminoácidos, o gene PA5309 (SEQ ID NO: 4) de Pseudomonas aeruginosa apresentava 22% de homologia e 39% de semelhança com o NCgl2909 (SEQ ID NO: 1) de bactérias Coryneform <4-2> Preparação da estirpe com o gene epistástico regulador inativado [085] A fim de preparai a estirpe com o gene NCgl2909 (SEQ ID NO: 1) inativado, pDZ, que não é replicável em Corynebacterium giutamicum, foi utilizado para se obter um derivado de pDZ com o ORF de NCgl2909 internamente eliminado.

[086] Concretamente, através do Genbank do NIH obteve-se a sequência de NCgl2909 (SEQ ID NO: 1) e com base nesta sequência os iniciadores 2909F1, 2909R1, 2909F2 é 2909R2 foram preparados. A Tabela 2 mostra a tt3 - ' _ sequência nucleotídica e ,as SEQ ID NOs: dos iniciadores utilizados na presente invenção. As sequências sublinhadas representam o local de reconhecimento para a enzima de restrição.

Tabela 2 [087] pDZ-ANCgI2909 inclui 250 pb da sequência nucleotídica a montante de NCgl2909 e 140 pb da sequência nucleotídica a jusante, e iniciadores contendo o local de reconhecimento da enzima de restrição Xbai em cada extremidade foram preparados. Além disso, pDZ-âNCgl2909 inclui a deleção interna do gene NCgl2909, tendo esta sido realizada por uma PCR cruzada com DNA genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e com os iniciadores 2909F1-2909R1 (SEQ ID NOS: 8 e 9) e 2909F2-2909R2 (SEQ ID NOS: 10 e 11).

[088] O plasmídeo recombinante foi transformado em Corynebacterium glutamicum ATCC13032 por eletroporação (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 19§9), e o plasmídeo foi incorporado no cromossoma por recombinação primária (cruzada). A seguir, o plasmídeo foi extirpado do cromossoma por recombinação secundária (cruzada) em uma placa de ágar contendo 10% de sacarose.

[089] Utilizando o par de iniciadores específico para genes 2909F1-2909R2 (SEQ ID NOs: 8 e 11), uma PCR foi realizada com transformantes de Corynebacterium glutamicum em que a recombinação secundária foi completada, confirmando-se assim a deleção do gene NCgl2909. Esta estirpe recombinante foi designada ATCC13032::âNCgI2909 . <4-3> Efeito do gene epistático regulador [090] O efeito na indução da expressão do promotor de NCg!0350 foi examinado utilizando a estirpe preparada pelo teste permissivo de crescimento descrito em <1 -2> do Exemplo 1. As estirpes C3 e C6(P0350:CAT), preparadas pela transformação da Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 do tipo selvagem com cada um dos vetores pSKICAT e pHS09004, e a estirpe ATCC13032::ANCgi2909(P0350:CAT), preparada pela transformação de ATCC13032::ANCgl2909 com o vetor pHS09004, foram comparadas.

[091] O caldo de cultura livre de células obtido a partir de Corynebacteríum glutamicum foi utilizado para avaliar se a expressão do promotor do gene NCgl0350 estava ou não induzida. Como se pode ver na Fig. 4, a expressão do promotor foi induzida na estirpe transformante C6(P0350:CAT) e por isso a estirpe replicou-se no meio contendo cloranfenicol, ao passo que a estirpe ATCC13032::ANCgl2909(P0350:CAT) não cresceu. Estes resultados sugerem que o gene NCgl2909 está envolvido na indução da expressão do gene NCgl0350 na presença do caldo de cultura livre de células.

Exemplo 5: Efeito do NCql2909 na formação de biofilme [092] A formação de biofilme por Corynebacteríum glutamicum do tipo selvagem e por Corynebacteríum glutamicum ATCC13032::ANCgl2909 preparada no Exemplo 4 foi comparada. O biofilme formado sobre uma placa de microtitulação de 96 poços feita de PVC (plástico de cloreto de polivinilo) foi examinado pelo método de Fletcher (Can. J. Microbiol. 23:1-6, 1977). Concretamente, as estirpes foram cultivadas em meio MB a 30°C, durante a noite, foram diluídas em uma proporção de 1:100, e 200 pl de cada estirpe diluída foi inoculada em cada poço da placa de microtitulação de 96 poços. A placa foi incubada a 30°C durante 1 ~2 dias e em seguida foi lavada três vezes com 200 pl de água destilada. A cada poço adicionou-se 200 μΙ de violeta de cristal a 0,3%. Em seguida, a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos e lavada três vezes com 200 μΙ de água destilada. Secou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos e adicionou-se 200 μΙ de etanol a 95% a cada poço corado com violeta de cristal para a quantificação. A placa foi incubada à temperatura, ambiente durante 20 minutos e a absorbância a 540 nm foi medida.

[093] Como se mostra na Fig. 5, ATCC13032::ANCgl2909 exibiu uma formação de biofilme cerca de 4~5; vezes superior à do tipo selvagem. · ?. "r · Exemplo 6: Efeito da inativacão do gene de inibição do biofilme na produtibilidade da L-lisina <6-1 > Preparação de uma estirpe produtora de lisina com o gene de inibição do biofilme inativado [094] Uma estirpe produtora de lisina foi usada para preparar estirpes com o gene NCgl2909 ou o gene NCgl0350 inativado, ou com os genes NCgl2909 e NCgl0350 inativados, e o efeito da inativação do gene inibidor do biofilme na produtibilidade de L-lisina foi analisado nestas estirpes.

[095] Para preparar as estirpes recombinantes com o gene NCgl2909 eliminado, o plasmídeo recombinante pDZ-âNCg!2909 descrito em <4-2> do Exemplo 4 foi usado. pDZ-ANCgI2909 foi introduzido na estirpe produtora de lisina Corynebacteríum glutamicum KCCM11016P a fim de selecionar uma estirpe transformada. Esta estirpe foi designada KCCM11016P::ANCgl2909.

[096] Para preparar as estirpes com o gene NCgi0350 (SEQ ID NO: 2) inativado, um derivado de pDZ com o ORF de NCgl0350 internamente eliminado foi preparado pelo método descrito em <4-2> do Exemplo 4 e foi designado pDZ-ANCgl0350 (Fig. 9). A Tabela 3 apresenta a sequência nucleotídica e as SEQ ID NOs dos iniciadores usados na presente invenção. Tabela 3 [097] O plasmídeo recombinante pDZ-ANCgl0350 foi introduzido em Corynebacteríum glutamicum KCCM11G16P para se preparar uma estirpe transformada, que foi designada KCCM11016P::ANCgl0350 .

[098] Por outro lado, para' preparar uma estirpe com NCgl2909 e NCgl0350 inativados, o -plasmídeo recombinante pDZ-ANCgl0350 foi introduzido em KCCM11016P::âNCgl2909 de maneira idêntica à anterior a fim de se obter uma estirpe com NCgi2909 e NCgl0350 inativados. A estirpe foi designada CA01-2270 (KCCM11016P::ANCgI2909âNCgl0350) e depositada em 12 de junho de 2013 no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, sob o número de registro KCCM11431P. <6-2> Produtibilidade de L-lisina da estirpe com o gene inibidor do biofilme inativado [099] As estirpes Corynebacterium glutamicum produtoras de L-lisina, KCCM11016P::ANCgi2909, KCCM11016P::ANCgl0350 e CA01-2270, foram cultivadas para a produção de L-lisina, como segue.

[100] A estirpe parente' Corynebacterium glutamicum KCCM11016P e os três tipos anteriores de estirpes recombinantes foram inoculadas respetivamente em frascos de 250 ml com deflectores nos cantos e contendo 25 ml do meio de inoculação descrito adiante. Procedeu-se à cultura a 30°C, sob agitação a 200 rpm, durante 20 horas. Inoculou-se 1 mL do caldo de cultura resultante em um balão de 250 ml com defletores nos cantos, contendo 24 ml do meio de produção descrito a seguir, e procedeu-se à cultura a 30° C, sob agitação (200 rpm), durante 120 horas. As composições do meio de inoculação e do meio de produção descrevem-se a seguir.

[101] <Meio de inoculação (pH 7.0) >

[102] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HP04, 0,5 g de MgS04.7H20, 100 pg de biotina, 1000 pg de tiamina-HCI, 2000 pg de pantotenato de cálcio, 2000 pg de amida de nicotina (em 1 litro de água destilada) <Meio de produção (pH 7.0) >

[103] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2S04, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólidos de maceração do milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PQ4, 0,5 g de MgS04.7H20, 100 pg de biotina, 1000 pg de tiamina-HCI, 2000 pg de pantotenato de cálcio, 3000 pg de amida de nicotina, 30 g de CaC03 (em 1 litro de água destilada) [104] No fim da cultura, a quantidade de L-lisina produzida foi determinada por HPLC. A massa celular e a concentração de L-lisina nos caldos de cultura de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P::ANCgl2909, KCCM11016P::ANCgl0350 e CA01-2270 apresentam-se na seguinte Tabela 4. Tabela 4 [105] Como se pode ver na Tabela 4, quando o gene ANCgl2909 ou o gene ANCgl0350 foram inativados na estirpe parental KCCM11016P, a massa de células aumentou para 24% ou 19%, respetivamente, em comparação com a estirpe parental, A estirpe CA01-2270 com ambos os genes ANCgl2909 e ANCgl0350 inativados exibiu um aumento de 33% na massa celular. Em contraste, todas as três estirpes apresentaram uma produtividade de L-lisina equivalente à da estirpe parental (Tabela 4). Estes resultados indicam que a massa celular pode ser aumentada pela inativação do gene NCgl2909 e/ou do gene NCgi0350, e que o rendimento de L-lisina não diminui apesar do aumento na massa celular. Por conseguinte, é possível produzir L-lisina com um rendimento mais elevado face a um aumento da massa de células <6-3> O efeito em diferentes estirpes produtoras de L-lisina [106] Com base nos resultados anteriores, prepararam-se estirpes com os genes NCgl2909 e NCgl0350 inativados utilizando três tipos de estirpes diferentes da estirpe produtora de lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P. Em seguida, avaliou-se se as estirpes apresentavam os mesmo efeitos.

[107] As estirpes com os genes NCgl2909 e NCgl0350 inativados foram preparadas pelo método descrito em <6-1 >. Três tipos de estirpes com os dois genes inativados foram preparadas usando três tipos diferentes de estirpes produtoras de lisina, nomeadamente Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, KFCC10750 (n.° de registro KCCM1137P) e CJ3P. As estirpes foram designadas KCCM10770P::áNCgI2909ANCgl0350, KFCC10750::ANCgl2909ANCgl0350 e CJ3P::ANCgl2909ANCgl0350, respetivamente.

[108] Os três tipos de estirpes e as estirpes originais respetivas foram cultivadas como em <6-2>. A massa das células e a concentração de L-lisina nos caldos de cultura foram determinadas e apresentam-se na Tabela 5. TabelaS

[109] Conforme se pode ver na Tabela 5, a massa celular aumentou no caldo de cultura de cada um dos três tipos de estirpes transformadas a partir das respetivas estirpes originais. KCCM10770P::ANCgl2909ANCgl0350, KFCC10750::ANCgl2909ANCgl0350 e CJ3P::ANCgl2909ANCgl0350 apresentaram um aumento na massa celular de 18%, 15%, e 14%, respetivamente. No entanto, apresentavam uma produtividade de L-lisina equivalente à da estirpe parental.

[110] As estirpes com os genes NCgl2909 e NCgl0350 inativados preparadas a partir de três diferentes tipos de estirpes originais apresentavam o mesmo fenótipo relativamente à massa celular e à produtividade de L-lisina, demonstrando o efeito dos genes NCyl2909 e NCgl0350 na produtividade de L-lisina.

Efeito da invenção [111] O gene NCgl2909 da presente invenção com uma atividade inibitória da formação de biofilme não é único a uma particular bactéria e a sua expressão é induzida na presença de caldos de cultura livres de células obtidos a partir de bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas cultivadas até à fase estacionária. A indução da expressão tem um efeito inibitório na formação de biofilme.

[112] Além disso, uma estirpe produtora de L-lisina, na qual o gene NCgl2909 com uma atividade inibitória da formação de biofilme se encontra inatívado, não apresenta nenhuma redução na produtividade de L-lisina apesar da sua massa aumentar. ; .

[113] Por conseguinte, a L-lisina pode ser produzida com alto rendimento em um curto período de tempo utilizando uma estirpe produtora de L-lisina na qual o gene NCgl2909 ou o gene NCgl035Q, ou ambos os genes NCgl2909 e NCgl0350 codificantes de uma atividade inibitória da formação de biofilme está/estão inativados.

REIVINDICAÇÕES

Claims (7)

1. Polinucleotídeó isolado caracterizado por codificar uma proteína com uma atividade inibitória da formação de biofilme e ser representado por uma sequência nucieotídica de SEQ ID NO: 1.

2. Corynebacterium glutamicum caracterizado por um gene com uma sequência nucieotídica representada pela SEQ ID NO: 1 estar inativado.

3. Corynebacterium glutamicum caracterizado por um gene com uma sequência nucieotídica representada pela SEQ ID NO: 2 estar inativado.

4. Corynebacterium glutamicum caracterizado por os genes com as sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID NOs: 1 e 2 estarem inativados.

5. Método de produção de L-lísina caracterizado por compreender a cultura de Corynebacterium glutamicum em uma solução de cultura, em que um gene com uma sequência nucieotídica representada pela SEQ ID NO: 1 está inativado; e recuperar Usina das bactérias cultivadas ou da sua solução de cultura.

6. Método de produção de L-lisina caracterizado por compreender a cultura de Corynebacterium glutamicum em uma solução de cultura, em que um gene com uma sequência nucieotídica representada pela SEQ ID NO: 2 está inativado; e recuperar a lisina das bactérias cultivadas ou da sua solução de cultura.

7. Método de produção de L-lisina caracterizado por compreender a cultura de Corynebacterium glutamicum em uma solução de cultura, em que os genes com as sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID NOs: 1 e 2 estão inativados; e recuperar lisina das bactérias cultivadas ou da sua solução de cultura.