CN111088202B - 一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法，所述的重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中过表达蛋白酶基因FtsH构建得到的；所述的构建方法包括如下步骤：(1)对谷氨酸棒杆菌的基因组进行PCR，扩增FtsH基因，得到扩增的FtsH基因片段；(2)将FtsH基因片段克隆到过表达质粒上，得到重组质粒；(3)将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，筛选得到过重组谷氨酸棒杆菌。有益效果：本发明构建了一株过表达蛋白酶FtsH的谷氨酸棒杆菌，加强了谷氨酸棒杆菌的成膜能力，使得谷氨酸棒杆菌固定化连续发酵的产量比游离发酵的原始菌提高了38.2％，且发酵周期缩短了26.4％。

Description

一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆 菌及其构建方法

技术领域

本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及到一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。

背景技术

L～赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，为人类和动物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，被广泛用于饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面，其中90％以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂。

生物膜广泛存在于自然界，在生物膜形成过程中，细菌自身分泌产生的的胞外聚合物(EPS)是生物膜形成的物质基础，具有分层分布的特点，对细菌的粘附及聚集特性起到了关键作用。

固定化连续发酵技术现如今已经投入到生产当中，其中用生物膜的方式进行固定化连续发酵已初见成效。然而，在谷氨酸棒杆菌中，基于生物膜的方式经行固定化连续发酵却鲜有报道。

谷氨酸棒杆菌作为重要的工业菌株，其成膜能力非常弱，难以连续化发酵，因此我们需要对该菌株进行分子改造，使其成膜效果增强，以实现后期固定化连续发酵。

连续连续在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，已知蛋白酶FtsH(EC3.4.24.-)由Ngcl 2603基因编码。FtsH(Filamentation temperature-sensitive H)属于AAA蛋白酶家族，是一种膜结合蛋白酶。在生物体内，FtsH通过寡聚化形成一个六聚环形结构，将蛋白水解活性位点埋在六聚复合体空穴中央。FtsH蛋白的保守模块包括N-端跨膜域、AAA结构、锌离子结合模块等。FtsH具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子伴侣活性，参与生物膜的形成，蛋白质质量平衡控制，还与热激、高渗、光胁迫等响应有联系。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组谷氨酸棒杆菌，以提高了谷氨酸棒杆菌的成膜能力，解决现有技术中谷氨酸棒杆菌成膜能力弱，不能用于固定化连续发酵的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组谷氨酸棒杆菌通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述的重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中过表达蛋白酶基因FtsH构建得到的。

其中，所述蛋白酶基因FtsH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13032。

其中，所述的过表达蛋白酶基因FtsH是指通过在表达载体上导入蛋白酶FtsH基因序列，提高蛋白酶FtsH的拷贝数，从而增强蛋白酶FtsH活性。

上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组进行PCR，扩增FtsH基因，得到FtsH基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)得到的FtsH基因片段克隆到过表达质粒pXMJ19上，得到重组质粒pXMJ19*FtsH；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒pXMJ19*FtsH导入谷氨酸棒杆菌中，筛选得到过重组谷氨酸棒杆菌；

步骤(1)中，扩增FtsH基因设计的引物的序列如下：引物1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

步骤(1)中，所述PCR扩增的方法为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环。

步骤(2)中，所述的过表达质粒为pXMJ19。

上述过表达蛋白酶FtsH的谷氨酸棒杆菌在产赖氨酸中的应用也在本发明的保护范围之内，其包括如下步骤：

(i)将重组谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中，培养，得到种子液；

(ii)将预处理后的固定化载体置于发酵培养基中，与发酵培养基一起灭菌，再向发酵培养基中接入种子液，批次发酵，得到发酵液。

其中，每一批发酵结束后，用新的发酵培养基替换得到的发酵液，培养至糖耗尽，结束发酵，约70h，即得到赖氨酸；其中，所述的糖为糖为葡萄糖、糖蜜和蔗糖的三种组合。

步骤(i)中，种子培养基中各组分的浓度为：蔗糖15～35g/L、蛋白胨5～15g/L、酵母粉1～10g/L、硫酸铵5～10g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、磷酸氢二钾5～15g/L、尿素1～5g/L，溶剂为水；所述的培养为在28～34℃，200～250rpm条件下培养10～14h。

步骤(ii)中，所述的固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合；所述的预处理为将固定化载体剪成2～8cm×2～8cm的正方形(优选5cm×5cm)，用纯水洗净烘干后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴10～40min(优选20min)后干燥；固定化载体的用量为1～10g/500mL发酵培养基；所述的灭菌为115℃灭菌15min。

步骤(ii)中，发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80～120g/L、硫酸铵30～50g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L、糖蜜10～25g/L、玉米浆10～25g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸亚铁100～300mg/L、硫酸锰100～200mg/L、烟酰胺40～80mg/L、泛酸钙5～15mg/L、VB1 5～15mg/L、硫酸铜0.5～2mg/L、硫酸锌0.5～2mg/L、生物素0.5～2mg/L、碳酸钙10～50g/L，溶剂为水；

步骤(ii)中，每500mL的摇瓶加入50mL的发酵培养基，接入10％～30％(v/v)的种子液，在28～34℃，200～250rpm/min条件下发酵60～90h(优选72h)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势：

1、本发明发明了一种谷氨酸棒杆菌固定化发酵产赖氨酸的方法，利用纤维(棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆)作为固定化材料，固定的菌体可以反复利用，能够进行连续发酵。

2、本发明构建了一株过表达蛋白酶FtsH的谷氨酸棒杆菌，加强了谷氨酸棒杆菌的成膜能力，使得谷氨酸棒杆菌固定化连续发酵的产量比游离发酵的原始菌提高了38.2％，且发酵周期缩短了26.4％。

附图说明

图1为pXMJ19/*FtsH质粒琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为原始质粒pXMJ19，泳道2为重组质粒pXMJ19/*FtsH，泳道3为Marker。

图2为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032原始菌和重组菌的电镜图。

图3为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032原始菌和重组菌发酵周期图。

图4为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032原始菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量的实验数据。

图5为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032原始菌和重组菌固定化批次发酵与游离发酵的赖氨酸产量对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例使用的质粒pXMJ19从武汉淼灵生物科技有限公司购买。如无特别说明，所有酶均从TAKARA购买，质粒提取及胶回收试剂盒从天根购买。

实施例1：构建蛋白酶FtsH过表达质粒。

使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体进行PCR，扩增FtsH基因。

具体而言，使用下述引物1和引物2，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环：扩增了2614bp的基因片段(SEQ ID NO.2)

扩增的序列含有FtsH编码序列，以及20bp与载体同源的序列。此外，引物1具有BamHI的限制酶识别位点，引物2具有BamHI的限制酶识别位点。BamHI限制酶识别位点用粗体标出。

表1

引物1	5’～gcctgcaggtcgactctagaggatccatgaaaaacaagaaatacct～3’(SEQ ID NO.3)
		引物2	5’～aattcgagctcggtacccggggatccttatccacggttgtctcctt～3’(SEQ ID NO.4)

将获得的多核苷酸与用限制酶BamHI处理的pXMJ19质粒进行一部克隆，得到用于过表达蛋白酶FtsH基因的重组质粒pXMJ19/*FtsH，琼脂糖凝胶电泳见图1，泳道1是原始pXMJ19质粒，泳道2是构建好的质粒pXMJ19/*FtsH，泳道3是Marker。其中，原始的pXMJ19质粒大小为6601bp，而重组质粒pXMJ19/*FtsH的大小为9169bp。从图中可以看出FtsH基因片段已经插入表达质粒pXMJ19。

实施例2：构建蛋白酶FtsH过表达菌株

将得到的pXMJ19/*FtsH重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞中，在含有6.5ug/mL氯霉素的LB平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子，然后进行菌落PCR验证，得到过表达蛋白酶FtsH的重组菌株。使用引物3和引物4进行PCR，以证实基因是否插入到重组质粒中。

表2

引物3	5’～ggaattgtgagcggataaca～3’(SEQ ID NO.5)
		引物4	5’～gtatcaggctgaaaatcttc～3’(SEQ ID NO.6)

改造菌株构造成功后进行96孔板以及SEM电镜实验。电镜照片见图2，可以直观具体的看出重组菌生物膜比原始菌生物更多。成膜效果提升之后进行固定化连续发酵。

实施例3：重组菌赖氨酸发酵实验(重组菌固定)

活化培养基成分如下：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。

所述种子培养基是：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。

发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20g/L、玉米浆20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙40g/L。

每50mL离心管加5mL活化培养基，接入重组菌，在30℃，220rpm条件下活化20h。

活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm条件下培养12h。

每500mL的摇瓶倒入50mL的发酵培养基，将载体也放入发酵培养基中一起灭菌，115℃，15min。

向在发酵培养基中接入5mL种子液，在30℃，220rpm条件下发酵72h。

固定化连续发酵：在发酵过程中，第一批时菌体已经吸附到固定化载体上，此时摇瓶培养已经过约72h，第二批时倒掉发酵液，留下吸附着菌的固定化载体，再倒入新的50mL发酵培养基，培养至糖耗尽，糖为葡萄糖、糖蜜、和蔗糖三种的组合，约60h，测得发酵周期数据，见图3；赖氨酸产量见图5。随后批次固定化连续发酵均采用此法。

棉纤维载体材料的预处理：将棉纤维载体剪成5cm×5cm的正方形，用纯水洗净烘干后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗2遍后沸水浴20min后放入烘箱烘干，称重1.5g，然后放入倒有发酵液的摇瓶当中一起灭菌，115℃，15min。

对比例1：原始菌固定

将实施例3中接入的重组菌更换为原始出发菌(谷氨酸棒状杆菌ATCC13032)，其余步骤同实施例3，得发酵周期数据见图3；赖氨酸产量见图5。

对比例2：重组菌的游离发酵(重组菌)

发酵培养基中不加入载体，其余步骤同实施例3，测得发酵周期数据见图3；赖氨酸产量见图5。

对比例3：原始菌的游离发酵(原始菌)

将实施例3中接入的重组菌更换为原始出发菌(谷氨酸棒状杆菌ATCC13032)，发酵培养基中不加入载体，其余步骤同实施例3，测得发酵周期数据见图3；赖氨酸产量见图5。

从图3可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵的周期均缩短，其中，重组菌固定化发酵周期比原始菌缩短26.4％；从图5可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵所得赖氨酸的产量均有提升，且重组菌固定化产量比原始菌高38.2％。上述发酵周期的缩短以及赖氨酸产量的提高均是因为采用固定化发酵和重组菌加强了谷氨酸棒杆菌的成膜能力。

实施例4：还原糖的测定方法

运用DNS(二硝基水杨酸)在碱性条件下，与还原糖发生氧化还原反应，生成3～氨基～5～硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例，用紫外分光光度计(OD₅₄₀)测定还原糖含量。

样品适当稀释后，使预计含糖量在0.1～1.0mg/mL之间，取稀释后的0.5mL样品于10mL刻度试管中，再加入0.5mL DNS，沸水煮沸5min，立即冷却5min，加8mL纯水混匀，另设0.5mL纯水和0.5mL DNS样品为空白样。事先做好本次实验使用的DNS还原糖含量标准曲线，用紫外分光光度计在540nm波长下检测吸光值，作为还原糖含量的量度。

实施例5：赖氨酸含量的测定

每瓶发酵液取样100μL用0.1M盐酸溶液稀释50倍，再将每个样品分别取400μL稀释液，接着进行PITC柱前衍生，用RP～HPLC法进行赖氨酸含量检测，计算出每个样品的赖氨酸浓度。

利用出发菌和本发明构建的重组菌进行固定化连续发酵实验，通过10批次发酵实验，发酵结果见表3。从图5可以看出，改造后的菌株固定化连续发酵的赖氨酸产量比游离发酵的原始菌高出38.2％。从图3可以看出，改造后的菌株固定化发酵周期比原始菌缩短26.4％。

表3固定化菌株连续发酵10次的赖氨酸的产量(g/L)

实施例6：结晶紫染色法半定量测生物膜量

在无色96孔板中加入200uL发酵培养基(不加固定化载体与碳酸钙)，再分别加入20uL的原始菌与重组菌，培养到12h、24h、36h、48h时用结晶紫染色法和酶标仪测OD 570nm。从图4中可以看出过表达蛋白酶FtsH的重组菌成膜能力明显提高。

本发明提供了一种过表达蛋白酶FtsH的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和在产赖氨酸中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2562

<212> DNA

<213> 蛋白酶(FTSH)

<400> 1

atgaaaaaca agaaatacct gcagttcggc ggtatcgcag ccgtaatcct catcgttctg 60

ttcttggtgt ccctgtttag cagtgacacc aggaacttcc aggaggtcga tacctctgtt 120

gcgatggcac agcttgacgc cggaaacgtc gccgaagctc aaatcgatga cagggaacag 180

cgcgtccgac tgaccttgcg tgaacccatc acggtggatg aacgcgaagg cgttgaagag 240

atcctcgcgc agtacccagc tcgtaccgcg ccagcgatct ttgagaaggt ggaagcatcc 300

aacactgatt cctataccac caatgtgacg caggagagct tcctgatgtc catgctgagc 360

ttcatcctgc cgatggtgat catcttcggt ttgctgatgt tcttcctcac ccgcatgcag 420

ggtggtggca tgtttggcat cggtggatcc aaggccaagc agctgaccaa ggatatgccc 480

accaacacct tcgcggatgt tgctggcgct gaagaagcag tggatgaact ccatgagatc 540

aaggacttcc tggaagaccc cacccgctac gaagccctcg gagcgaaaat ccctcgtggt 600

gtgctgcttt acggccctcc cggtactggt aaaaccctgc tggctcgtgc cgtagctggt 660

gaggctggcg tgccgttcta ctcaatttcc ggttctgact ttgtggaaat gttcgtcggt 720

gttggtgcct cgcgtgtgcg tgatctgttt aagcaggcca aggaaaacag tccctgcatc 780

atcttcgtcg atgagatcga tgcggttggt cgcgcccgtg gctcaggaat gggtggcgga 840

cacgatgagc gtgaacagac cctgaaccag ttgctcgttg agatggatgg ctttggtgat 900

cgtcaaggcg tcattctgat ggctgctacc aaccgcccag atgttcttga cccagcgctg 960

ctgcgtcctg gccgtttcga ccgccagatc ccagtcacca accctgacct acgcggccgt 1020

gaacagatcc tggaagttca cgccaagggt aagcctttcg cacccgatgc agatatcaag 1080

gcattggcaa agcgcaccgc cggcatgtcc ggcgctgacc tggcaaacgt gcttaacgaa 1140

gccgcgctgc taaccgcccg cgtgggtggc aacgtgatca ccgccgacgc tctggaagaa 1200

gcaaccgacc gcgttgtcgg tggaccacgt cgctccggca aggtgatttc cgagaaggaa 1260

aagaaggtca ccgcctacca cgaaggtgga cacaccctgt ccgcatgggc gttggaagac 1320

atcgagcgcg tctacaaggt caccatcttg gcccgcggtc gcaccggcgg tcacgccatg 1380

actgcccaag aagatgacaa gggcatgtac aaccgcaacg aattgttcgc ccgcctggtc 1440

tttgccatgg gtggacgctc cgcggaagaa ctagtcttcg gcgaacccac caccggcgcc 1500

tccgccgata ttgaaatggc caccaagatc gcccgatcca tggtgaccga atatggcatg 1560

tccccagctg tcggcatggt gaaatacggc caagaacagg gcgacccatt ctccggacgc 1620

ggtggcggtg gaaacttgga ccactcccaa gaagtcgcag caaccatcga caccgaagtc 1680

cagttcctcc tggacaaagc ccatgaagtg tcctactcca tcctggctga ataccgcgac 1740

cacctggacc gcctcgcgga aaaactcctg gaaaaggaaa ccctgcgacg cccagacctc 1800

gaagcgcttt tcgacgacat cgtcccacgc aaggtcgccg aagtcttccc cgacgagtcc 1860

acacgattcc ctcgccaaga aaaccgcgaa ccagtaaaaa ccccagtgga gctcgcactg 1920

gaacgtggcg aagaaccacc aaagaagttc tccattcttg aggcctcccg cgcaacccgc 1980

gaacgccgtc gcaaggaatt ggaagctcag ggtaagttgc cggtgcagcc tgcgtcttct 2040

gccggcgtgg cacctgcggc cggagcagct gccggatcct atggcacccc acctccagct 2100

gattggagcg tgcccggttc cgctggaaag caccgctcac gtgcagaaga acagccagct 2160

gagcagggct tcccggctca gaccccggca caagctcctg agcagtcccc tgattcaagt 2220

ggcggccgcc ccaaccctta cgcgactcca accgcatccg gtgagcaccc tggtatgaag 2280

gcctatggct tcggcgattc cgaactcatg gaccaatcaa caggtgcgga acatacccca 2340

ggtaacgttt cacaggaatc cccaaccgaa atgatcgggt tccgtttgcc ggatcatgaa 2400

cgttcggact acccagaaaa ggcgcaaaaa gagtcggtgc tggatgcttc tgaaaccaca 2460

gaaatgcctg tcgttccaga tcagcccatc gatggtgatt ccgggaagtc cgctgagggc 2520

acacaggaga atccggaaaa tgaaggagac aaccgtggat aa 2562

<210> 2

<211> 2614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga aaaacaagaa atacctgcag ttcggcggta 60

tcgcagccgt aatcctcatc gttctgttct tggtgtccct gtttagcagt gacaccagga 120

acttccagga ggtcgatacc tctgttgcga tggcacagct tgacgccgga aacgtcgccg 180

aagctcaaat cgatgacagg gaacagcgcg tccgactgac cttgcgtgaa cccatcacgg 240

tggatgaacg cgaaggcgtt gaagagatcc tcgcgcagta cccagctcgt accgcgccag 300

cgatctttga gaaggtggaa gcatccaaca ctgattccta taccaccaat gtgacgcagg 360

agagcttcct gatgtccatg ctgagcttca tcctgccgat ggtgatcatc ttcggtttgc 420

tgatgttctt cctcacccgc atgcagggtg gtggcatgtt tggcatcggt ggatccaagg 480

ccaagcagct gaccaaggat atgcccacca acaccttcgc ggatgttgct ggcgctgaag 540

aagcagtgga tgaactccat gagatcaagg acttcctgga agaccccacc cgctacgaag 600

ccctcggagc gaaaatccct cgtggtgtgc tgctttacgg ccctcccggt actggtaaaa 660

ccctgctggc tcgtgccgta gctggtgagg ctggcgtgcc gttctactca atttccggtt 720

ctgactttgt ggaaatgttc gtcggtgttg gtgcctcgcg tgtgcgtgat ctgtttaagc 780

aggccaagga aaacagtccc tgcatcatct tcgtcgatga gatcgatgcg gttggtcgcg 840

cccgtggctc aggaatgggt ggcggacacg atgagcgtga acagaccctg aaccagttgc 900

tcgttgagat ggatggcttt ggtgatcgtc aaggcgtcat tctgatggct gctaccaacc 960

gcccagatgt tcttgaccca gcgctgctgc gtcctggccg tttcgaccgc cagatcccag 1020

tcaccaaccc tgacctacgc ggccgtgaac agatcctgga agttcacgcc aagggtaagc 1080

ctttcgcacc cgatgcagat atcaaggcat tggcaaagcg caccgccggc atgtccggcg 1140

ctgacctggc aaacgtgctt aacgaagccg cgctgctaac cgcccgcgtg ggtggcaacg 1200

tgatcaccgc cgacgctctg gaagaagcaa ccgaccgcgt tgtcggtgga ccacgtcgct 1260

ccggcaaggt gatttccgag aaggaaaaga aggtcaccgc ctaccacgaa ggtggacaca 1320

ccctgtccgc atgggcgttg gaagacatcg agcgcgtcta caaggtcacc atcttggccc 1380

gcggtcgcac cggcggtcac gccatgactg cccaagaaga tgacaagggc atgtacaacc 1440

gcaacgaatt gttcgcccgc ctggtctttg ccatgggtgg acgctccgcg gaagaactag 1500

tcttcggcga acccaccacc ggcgcctccg ccgatattga aatggccacc aagatcgccc 1560

gatccatggt gaccgaatat ggcatgtccc cagctgtcgg catggtgaaa tacggccaag 1620

aacagggcga cccattctcc ggacgcggtg gcggtggaaa cttggaccac tcccaagaag 1680

tcgcagcaac catcgacacc gaagtccagt tcctcctgga caaagcccat gaagtgtcct 1740

actccatcct ggctgaatac cgcgaccacc tggaccgcct cgcggaaaaa ctcctggaaa 1800

aggaaaccct gcgacgccca gacctcgaag cgcttttcga cgacatcgtc ccacgcaagg 1860

tcgccgaagt cttccccgac gagtccacac gattccctcg ccaagaaaac cgcgaaccag 1920

taaaaacccc agtggagctc gcactggaac gtggcgaaga accaccaaag aagttctcca 1980

ttcttgaggc ctcccgcgca acccgcgaac gccgtcgcaa ggaattggaa gctcagggta 2040

agttgccggt gcagcctgcg tcttctgccg gcgtggcacc tgcggccgga gcagctgccg 2100

gatcctatgg caccccacct ccagctgatt ggagcgtgcc cggttccgct ggaaagcacc 2160

gctcacgtgc agaagaacag ccagctgagc agggcttccc ggctcagacc ccggcacaag 2220

ctcctgagca gtcccctgat tcaagtggcg gccgccccaa cccttacgcg actccaaccg 2280

catccggtga gcaccctggt atgaaggcct atggcttcgg cgattccgaa ctcatggacc 2340

aatcaacagg tgcggaacat accccaggta acgtttcaca ggaatcccca accgaaatga 2400

tcgggttccg tttgccggat catgaacgtt cggactaccc agaaaaggcg caaaaagagt 2460

cggtgctgga tgcttctgaa accacagaaa tgcctgtcgt tccagatcag cccatcgatg 2520

gtgattccgg gaagtccgct gagggcacac aggagaatcc ggaaaatgaa ggagacaacc 2580

gtggataagg atccccgggt accgagctcg aatt 2614

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物1(DNA)

<400> 3

gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga aaaacaagaa atacct 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物2(DNA)

<400> 4

aattcgagct cggtacccgg ggatccttat ccacggttgt ctcctt 46

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物3(DNA)

<400> 5

ggaattgtga gcggataaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物4(DNA)

<400> 6

gtatcaggct gaaaatcttc 20

Claims (8)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌在产赖氨酸中的应用，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中过表达蛋白酶基因FtsH构建得到的；所述蛋白酶基因FtsH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13032。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括如下步骤：

(1)对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组进行PCR，扩增FtsH基因，得到扩增的FtsH基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)得到的FtsH基因片段克隆到过表达质粒上，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，筛选得到重组谷氨酸棒杆菌；

步骤(1)中，扩增FtsH基因设计的引物的序列如下：引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的方法为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的过表达质粒为pXMJ19。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(i)将重组谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中，培养，得到种子液；

(ii)将预处理后的固定化载体置于发酵培养基中，与发酵培养基一起灭菌，再向发酵培养基中接入种子液，批次发酵，得到发酵液；

其中，每一批发酵结束后，用新的发酵培养基替换得到的发酵液，培养至糖耗尽，结束发酵，即得到赖氨酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(i)中，种子培养基中各组分的浓度为：蔗糖15～35g/L、蛋白胨5～15g/L、酵母粉1～10g/L、硫酸铵5～10g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、磷酸氢二钾5～15g/L、尿素1～5g/L，溶剂为水；所述的培养为在28～34℃，200～250rpm条件下培养10～14h。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(ii)中，所述的固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合；所述的预处理为将固定化载体剪成2～8cm×2～8 cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡，再用纯水清洗后沸水浴10～40min后干燥；固定化载体的用量为1～10g/500mL发酵培养基。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(ii)中，发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80～120g/L、硫酸铵30～50g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L、糖蜜10～25g/L、玉米浆10～25g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸亚铁100～300mg/L、硫酸锰100～200mg/L、烟酰胺40～80mg/L、泛酸钙5～15mg/L、VB1 5～15mg/L、硫酸铜0.5～2mg/L、硫酸锌0.5～2mg/L、生物素0.5～2mg/L、碳酸钙10～50g/L，溶剂为水；所述的发酵为在28～34℃，200～250rpm条件下发酵60～90h。

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