CN110373402B

CN110373402B - 一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法

Info

Publication number: CN110373402B
Application number: CN201910743692.1A
Authority: CN
Inventors: 韩超; 王群青; 孙延旭; 刘梦宇
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110373402A

Abstract

本发明公开了一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法，所述方法包括：对耐热纤维素酶中保守的N‑糖基化序列N88‑E89‑T90和底物结合区中保守的非催化氨基酸Y173进行定点突变，将第90位苏氨酸突变为丙氨酸，将第173位酪氨酸突变为苯丙氨酸。本发明对耐热纤维素内切酶CTendo45保守的N‑糖基化序列和底物结合区中保守的非催化氨基酸进行了定点突变，突变后的耐热纤维素酶突变酶的酶活力大幅提升，并且在高温条件下的热稳定性明显改善。

Description

一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法。

背景技术

面对石化能源稀缺和环境污染带来的双重压力，世界各国高度重视开发和利用生物质能源替代传统能源。利用纤维素酶转化木质纤维素生物质，对解决能源危机和环境污染问题具有重要的战略意义。纤维素内切酶(EC 3.2.1.4)是一种能够随机水解纤维素链中β-1,4-糖苷键，并产生纤维寡糖的糖苷水解酶。纤维素内切酶是商品化纤维素酶制剂的主要来源。

目前，商品酶制剂主要是中温酶。但是，在高温条件下热稳定性差、易失活，导致工业生产中酶用量增加、成本提升，严重制约了纤维素酶的推广应用。由于耐热纤维素酶在高温条件下具有出色的热稳定性和高催化效率，可有效减少生产中酶的投入成本，更加适合工业开发和应用。酶活力和热稳定性是耐热酶的内在功能特征，主要取决于酶蛋白结构。以蛋白结构分析为基础的酶定向改造，是提升酶学特性最有效的方法之一。但是，由于酶蛋白空间结构极其复杂，目前成功预测重要结构域功能并有效改良酶学特性的成功率不足10％。因此，探寻一种高效可行的纤维素酶改良方法以提高酶酶活力和热稳定性，对提升耐热纤维素酶在食品加工、酿造业、造纸工业、纺织业和燃料乙醇炼制等领域的工业应用价值具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法。本发明对耐热纤维素内切酶CTendo45保守的N-糖基化序列和底物结合区中保守的非催化氨基酸进行了定点突变，突变后的耐热纤维素酶突变酶的酶活力大幅提升，并且在高温条件下的热稳定性明显改善。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法，所述方法包括：对耐热纤维素酶中保守的N-糖基化序列N88-E89-T90和酶底物结合区中保守的非催化氨基酸Y173进行定点突变，将第90位苏氨酸突变为丙氨酸，将第173位酪氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明的第二方面，提供上述方法在制备耐热纤维素酶突变体中的用途；所述耐热纤维素酶突变体的酶活力和热稳定性均高于原始酶。

本发明的第三方面，提供一种酶活力和热稳定性提高的耐热纤维素酶突变体，所述耐热纤维素酶突变体是对嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)中第45家族的耐热纤维素内切酶CTendo45进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为第90位的Thr和第173位的Tyr。

优选的，所述第90位的Thr突变为Ala，所述第173位的Tyr突变为Phe。

优选的，所述耐热纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第四方面，提供上述耐热纤维素酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用北京全式金生物技术有限公司生产的定点突变试剂盒(FastMutagenesisSystem Kit)引入目的突变氨基酸位点，扩增得到两端带有EcoRI和NotI酶切位点的突变酶扩增产物，将突变酶扩增产物连接至已双酶切的酵母表达载体pPIC9K上，获得携带目的基因的酵母表达载体；

(2)将携带目的基因的酵母表达载体进行线性化和去磷酸化处理，然后转化酵母感受态细胞，获得酵母工程菌；

(3)将酵母工程菌进行诱导培养，培养液离心，收集上清粗酶液；将上清粗酶液进行沉淀、透析和分离纯化，获得耐热纤维素酶突变体。

优选的，步骤(2)中，选择线性化限制性内切酶SacI和去磷酸化酶AP进行线性化和去磷酸化处理。

优选的，步骤(3)中，诱导培养的方法为：将活化后的酵母工程菌接种于BMGY培养基中，28℃振荡培养22-24h，离心后将菌液转移至BMMY培养基中开始诱导表达，每12h添加1mL甲醇，连续6-8d。

本发明的第五方面，提供上述耐热纤维素酶突变体在饲料加工、食品行业、酿造业、制酒工业、新能源领域、造纸行业和纺织业中的应用。其中：

饲料加工：可作为饲料用的添加剂，分解饲料中结构复杂的纤维素，产生易于动物消化和吸收的寡糖，提高饲料消化率；添加纤维素酶突变体后的饲料能够改善动物胃中微生态平衡，提高动物对蛋白质的吸收能力、提高饲料效果、增强抗病力，从而提高禽畜增重、产乳量和产蛋量。

食品行业：可用于果蔬汁的提取，果汁的澄清，马铃薯中淀粉类的有效分离等；也可改善食品质量，增加食品的营养成分，提高细胞内含物的提取率，并简化食品加工难度。

酿造业：可在食醋酿造过程中将其与糖化酶混合使用，提高原料利用率和出品率；在酱油酿造过程中，在入池发酵时将其加入，可使大豆等原材料的细胞膜膨胀软化破坏，释放包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物，并将原料中天然纤维素分解为寡糖，成为有益微生物的碳源，从而提高酱油浓度；又可缩短生产周期，提高产率，并使酱油的氨基酸和糖分含量提升，从而改善酱油质量，提升色泽。

制酒工业：生产白酒的原料大多数为玉米高粱木薯等富含淀粉和纤维素的粮食作物，在进行酒精发酵时添加纤维素酶突变体，可以更好的分解原料植物的细胞壁，加速淀粉释放；同时，纤维素酶突变体可以将淀粉和纤维素转化为寡糖，供酿酒酵母使用，从而提高原料利用率和出酒率。

新能源领域：生物乙醇主要采用淀粉为原材料，生产成本高。木质纤维素生物质是地球上含量最大的、并且是唯一可以转化为液体燃料的可再生资源，将生物质转化为液体燃料能够弥补石油、煤炭和天然气等化石燃料的不足，而且有助于保护生态环境。利用纤维素酶突变体可以更好的将木质纤维素生物质降解生成还原糖，通过进一步发酵产生燃料乙醇，对解决人类可持续发展问题具有重大战略意义。

造纸行业：利用纤维素酶突变体预处理造纸浆料，能够有效降低打浆能耗、改善纤维形态、提高纸张柔软性和溶解浆的反应性能；利用纤维素酶突变体进行酶法废纸脱墨，改变纤维表面或油墨离子附近的连接键，促使油墨分离，从而提升脱墨率，并降低造纸能耗，减轻环境污染。

纺织业：纤维素酶突变体可使织物表面纤维弱化，再通过机械搅拌，将绒毛去除，达到生物抛光的效果，从而改善织物柔软性，提高色泽；利用纤维素酶突变体对牛仔面料表面纤维素进行剥蚀，以磨损面料表面、剥离染料，达到水洗石磨的外观效果；通过纤维素酶突变体水解棉籽壳附着在织物上的微小纤维，使棉籽降解为可自由漂浮的壳屑，再加以漂洗，可去除织物上的棉籽。

本发明的有益效果：

本发明首次提出了一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法，即同时改变N-糖基化序列(T90A)和底物结合区中非催化氨基酸(Y173F)。通过对嗜热毛壳菌第45家族耐热纤维素内切酶CTendo45的突变酶CTendo45-T90A/Y173F酶学性质的研究，发现突变酶的酶活力大幅度提升，并且在高温条件的热稳定性明显改善。因此，本发明在对纤维素酶定向改造和提升耐热纤维素酶工业应用价值等方面具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1：CTendo45蛋白结构图。

图2：CTendo45氨基酸序列比对图。选取与CTendo45高同源性的内切纤维素酶进行序列比对，内切纤维素酶的来源包括Magnaporthiopsispoae ATCC 64411(KLU88048,相似度77％)，Madurella mycetomatis(KXX82926，相似度78％)，Thielavia terrestris NRRL8126(XP_003652266,相似度78％)，Coniochaeta ligniaria NRRL 30616(OIW24112,相似度78％),Gaeumannomyces tritici R3-111a-1(XP_009223899，相似度76.5％)andRosellinia necatrix(GAP84246,相似度72％)，括号中为酶蛋白的GenBank登录号，本实验突变的CTendo45中保守氨基酸T90和Y173用阴影标出。

图3：CTendo45和突变酶CTendo45-T90A/Y173F的电泳图；泳道M为低分子量蛋白标准，泳道1为纯化的CTendo45，泳道2为纯化的突变酶CTendo45-T90A/Y173F；原始酶分子量为30kDa，突变酶因去掉连接的N-糖链，分子量降低为26kDa，为正常现象。

图4：酶活力测定图。

图5：酶热稳定性测定图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术中所介绍的，现有的纤维素内切酶在高温条件下热稳定性差、易失活，导致工业生产中酶用量增加、成本提升，严重制约了纤维素酶的推广应用。基于此，本发明对现有的纤维素内切酶进行了改造，所获得的突变酶在酶活力和热稳定性上均有明显改善，对提升纤维素酶的工业应用价值具有重要意义。

对天然酶分子进行改造的方法主要有化学修饰、定点突变、定向进化和基因融合等，其中，酶的定点突变是在已知的DNA序列中替换、插入或缺失一定长度碱基，从而改变酶催化性质的一种方法，该方法的突变成功率高、重复性好，但前提是需要清楚蛋白质的空间结构，明确蛋白质结构与功能之间的关系，当对酶空间三维结构不清楚，酶分子高级结构和酶功能之间的关系不了解时，定点突变就难以确定突变位点。目前，成功预测重要结构域功能并有效改良酶学特性的成功率不足10％。

最新研究表明，N-糖基化在糖苷水解酶酶学特性方面发挥重要作用，改变酶蛋白糖基化能够显著影响常温酶的酶活力和热稳定性，但N-糖基化对耐热纤维素酶功能的影响尚未有报道。N-糖基化的序列特征为N-X-T/S(X≠Pro)，只要满足此序列即可在N位点上发生N-糖基化，而CTendo45中存在唯一的N-糖基化序列，即N88-E89-T90。因此，将T90变为A90能够改变N-糖基化序列，从而去掉CTendo45中N-糖基化，结果发现单位点突变酶T90A的热稳定性和酶活力较原始酶显著提升。此外，我们在前期研究中发现，CTendo45底物结合区中保守的非催化氨基酸具有调节酶水解功能的作用，去除Y173上苯酚基团的羟基后，酶活力和热稳定性明显提升，其原因是氢键的减少促使酶催化中心结构疏松，从而降低酶催化中心在高温条件下的结构域熵值，并且相对疏松的构象有利于加快酶促反应速率，提高纤维素酶水解活力。基于此，本方面结合两种提升酶活力和热稳定性的突变方法，即将T90变为A90，Y173变为F173，获得双位点突变酶T90A/Y173F，其酶活力和热稳定性较原始酶和单位点突变酶大幅度提升。

第90位氨基酸T突变为A，是为了破坏N-糖基化的特征序列N-X-T/S(X≠Pro),消除原始酶中的N-糖基化；将第173位氨基酸Y突变为F，是为了去掉Y173氨基酸中苯酚基团上连接的羟基，从而降低催化中心的熵值，提升构象的疏松度，从而提升高温条件下的酶活力和热稳定性。

在本发明的一种实施方案中，本发明以嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)中第45家族的耐热纤维素内切酶CTendo45为材料，利用蛋白结构分析和同源序列比对，发现保守的N-糖基化序列N88-E89-T90和底物结合区中保守的非催化氨基酸Y173对酶活性和热稳定性有重要作用。利用定点突变的方式，将T90变为A90，Y173突变为F173，突变基因经毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达和酶蛋白亲和层析后，获得了双突变酶CTendo45-T90A/Y173F。利用3,5-二硝基水杨酸法比色法，以羧甲基纤维素(CMC)为底物，检测到CTendo45-T90A/Y173F的酶活力显著提升，为原始酶CTendo45的2.58倍；突变酶的热稳定性也有明显改善，在80℃和90℃预处理300min后，剩余活性分别为75％和39％，并且突变酶在90℃的半衰期达到165min，较原始酶(半衰期35min)提升了4.71倍。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中所采用的方法中未做详细说明的均为本领域现有技术。

本发明实施例中所采用的培养基及其组分如下：

MD培养基：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖

YPD培养基：1％(w/v)Yeast Extract(酵母膏)、2％(w/v)Peptone(蛋白胨)、2％(w/v)Dextrose(glucose)(葡萄糖)、2％(w/v)琼脂粉；以上均为质量/体积比，单位为g/100mL。

BMGY培养基：酵母粉：1.0g，蛋白胨：2.0g，YNB：1.34g，0.1mol/LpH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，甘油：1.0mL，加蒸馏水到100mL。

BMMY培养基：酵母粉：1.0g，蛋白胨：2.0g，YNB：1.34g，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，高温灭菌后每100mL培养基中加入1mL甲醇。

实施例1：突变酶的构建与扩增

(1)酵母表达载体的构建

取10μL含有pPIC9K质粒的大肠杆菌菌液于含卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养8h，按质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒。

(2)质粒的双酶切

选择限制性内切酶EcoRI和NotI进行质粒的双酶切以暴露片段连接末端。若反应完全则将剩余反应液电泳后凝胶回收酶切产物。

根据Ligation-Free Cloning System试剂盒说明书构建完整的表达载体，将两端带有EcoRI和NotI酶切位点的突变酶扩增产物连接至已双酶切的酵母表达载体pPIC9K。

突变酶扩增产物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

突变酶扩增产物是通过如下方式得到：分别设计T90A和Y173F的突变引物，首先以原始酶的表达质粒pPIC9K/ctendo45为模板，根据T90A的突变引物，利用定点突变试剂盒(Fast Mutagenesis System Kit)进行PCR得到突变质粒pPIC9K/ctendo45-T90A；再根据Y173F的突变引物，利用定点突变试剂盒进行PCR，最终获得双突变质粒pPIC9K/ctendo45-T90A-Y173F。

T90A的突变引物的序列如下：

T90A-F：TGGGCGCTGAACGAGGCACTCTCGTAC(SEQ ID NO.3)；

T90A-R：CCTCGTTCAGCGCCCAGGGCGATTGG(SEQ ID NO.4)。

Y173F的突变引物的序列如下：

Y173F-F：CAAACGGCTGGGGTGAGCGGTTCGGCGGGATCCGCTC(SEQ ID NO.5)；

Y173F-R：AACCGCTCACCCCAGCCGTTTGGAGGGGCGCCGTAT(SEQ ID NO.6)。

挑取生长的单菌落于1mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养6h，吸取1.5μL菌液作为模板进行PCR验证并送产物测序，若序列结果正确即获得携带目的基因的酵母表达载体。

PCR选用反应体系，各组分的成分如下：

表中，Primer1表示正向引物；Primer2表示反向引物。

实施例2：表达载体的构建及转化

(1)表达载体的线性化与去磷酸化

吸取10μL含有实施例1中制备的酵母表达质粒pPIC9K/ctendo45-T90A-Y173F的大肠杆菌菌液于15mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，按照质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒并测定浓度。选择线性化限制性内切酶SacI及去磷酸化酶AP，参照限制性内切酶试剂盒说明书进行反应。

(2)电击转化

电击转化前需获得可用的GS115菌株并制备新鲜的酵母感受态细胞。将制备好的酵母感受态细胞每管80μL分装，加入已线性化的表达载体质粒轻轻混匀，冰浴5min。将混合体系转入预冷的电转杯中，300V电击15ms，立即加入冰浴的1mol/L山梨醇溶液混匀，28℃孵育60min，每300μL涂于MD培养基，28℃培养2-3d。

(3)酵母工程菌的筛选及验证

挑单菌落至含有150μg/mL和180μg/mL卡那霉素的YPD培养基上进行筛选。选择在两个浓度平板上均生长迅速的菌落，用5’AOX1和3’AOX1作引物进行PCR验证并送产物测序，若片段大小与测序结果均正确则该菌可作为发酵工程菌。

其中，5’AOX1引物序列：GACTGGTTCCAATTGACAAGC(SEQ ID NO.7)，

3’AOX1引物序列：GCAAATGGCATTCTGACATCC(SEQ ID NO.8)。

实施例3:原始酶与突变酶的真核表达与分离纯化

(1)工程菌的发酵

将筛选鉴定的工程菌于YPD培养基上划线培养，28℃/2d后挑取活化好的工程菌接种于BMGY培养基中。28℃/200rpm振荡培养22-24h。4200rpm离心后将菌液转移至BMMY培养基中开始诱导表达。每12h添加1mL甲醇，连续7d后4℃/8000rpm/15min收集上清粗酶液。

(2)粗酶液的硫酸铵沉淀与透析

往粗酶液中加入烘干的硫酸铵粉至80％饱和度后4℃静置过夜。4℃/8000rpm/15min离心，弃上清后加入5mL PBS(pH＝7.4)缓冲液，待沉淀蛋白全部溶解后转移至透析袋中，于PBS缓冲液中透析12h。4℃/8000rpm/15min离心收集上清。

(3)蛋白酶的分离纯化

HisTrap FF crude(镍柱)填料中所带正电镍离子对组氨酸有亲和作用，从而能够吸附含有6×His tag的目的蛋白。通过UNICORN5.11仪器将透析后去除盐离子的蛋白粗酶溶液进行分离纯化。将收集的蛋白酶溶液由去离子水透析后分装，-80℃冷冻储存或4℃近期使用。

实施例4：突变酶表达纯化的鉴定

进行酶的SDS-PAGE电泳

以SDS-PAGE变性电泳检测蛋白酶的分子量。操作步骤及染色脱色过程参照凝胶制备试剂盒说明书。电泳完成后将无用的浓缩胶切除，分离胶部分进行染色及脱色。脱色完成后，将凝胶置于胶片观察灯上进行观察并分析所需要的酶是否表达、分离纯化成功。

实施例5：原始酶与突变酶的酶学性质测定及对比

(1)酶的浓度测定

在分光光度计上设置好相应参数(消光系数与相对分子量)，先吸取1.5μL的纯净水进行调零，吸取1.5μL纯化好的酶液进行蛋白质浓度测定。结果显示，突变酶T90A/Y173F的蛋白浓度为3835μg/mL，相比原始酶CTendo45(3244μg/mL)有所提升，说明毕赤酵母表达系统成功表达突变酶，且突变相应氨基酸对酶蛋白的表达没有明显影响。

(2)酶的最适PH

将酶液在不同pH条件(pH 3-11)下反应40min，加入等体积的DNS煮沸8min，离心后进行测定、分析。结果显示，突变酶T90A/Y173F的最适反应pH为4，与原始酶的最适反应pH(pH＝4)一致。

(3)酶的最适温度

将酶液在不同的温度下(30℃-90℃)反应＝40min，加入等体积的DNS煮沸8min，离心后进行测定、分析。结果显示，突变酶T90A/Y173F的最适反应温度为60℃，与原始酶的最适反应温度(60℃)一致。

(4)DNS法测定酶活力

在测定出酶的最适反应条件后以150μL反应体系(50μL底物+50μL最适pH的Buffer+50μL酶液)在最适温度下反应40min。加入150μL等量的DNS沸水浴8min，冷却至室温，分光光度法测定OD540值，与葡萄糖标曲比对计算酶活力。本研究所分析数据均至少由三次独立重复试验获得。酶活力单位是根据某种酶在最适条件下,单位时间内被酶作用的底物的减小量或产物的生成量来规定的。1961年国际酶学委员会统一的规定：在标准条件下，一分钟内催化1μmoL底物转化的酶量为一个酶活力单位，即国际单位(IU)。以Sigma-Aldrich公司生产的羧甲基纤维素(CMC)为底物，货号C4888-500G，1％浓度(m/v)，分别测定突变酶和原始酶的酶活力，结果发现相比原始酶的酶活力2.07±0.14IU/mg，突变酶的酶活力提升了2.58倍，达到5.34±0.61IU/mg。

(6)酶的热稳定性

将酶液预先在30℃-90℃的温度梯度中孵育300min后以150μL反应体系孵育40min，加入等体积的DNS煮沸8min，离心后进行测定、分析。结果显示，原始酶在80℃处理300min后的剩余酶活为26％，90℃处理300min后酶活性完全丧失。突变酶经80℃和90℃预处理300min后，剩余活性分别为75％和39％，较原始酶的热稳定性显著提升。

(7)酶的半衰期

将酶液在最适条件下进行反应测得初始活性记为A，置于80℃与90℃的高温条件下反应，当反应后活性为A/2时的孵育时间即为半衰期。经测定，原始酶的在80℃和90℃的半衰期分别为150min和35min，而突变酶的半衰期达到640min和165min，较原始酶分别提升了4.27倍和4.71倍，说明突变酶的热稳定性较原始酶大幅度提升。

综上所述，双突变酶较原始酶的酶活力和热稳定性均显著提高，因此，此双突变酶作为可一种耐高温纤维素酶在工业生产中发挥重要的作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120>一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法

<130> 2019

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 耐热纤维素酶突变体

<400> 1

Met His Leu Ser Gln Leu Ala Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala

1 5 10 15

His Ala Gln Gly Ala Gln Gly Thr Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp

20 25 30

Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Ser Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Pro Val Gln Thr Cys Asn Ala Gln Asp Gln Pro Leu Asn Asp Gly Gly

50 55 60

Asn Thr Arg Ser Gly Cys Asp Ser Gly Gly Ser Ala Phe Met Cys Ser

65 70 75 80

Asn Gln Ser Pro Trp Ala Leu Asn Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Trp Ala

85 90 95

Ala Val Arg Ile Ala Gly Gln Ser Glu Phe Asn Trp Cys Cys Ala Cys

100 105 110

Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Ile

115 120 125

Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp

130 135 140

Ile Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Gln

145 150 155 160

Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Glu Arg Phe Gly Gly Ile

165 170 175

Arg Ser Arg Ser Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Ala Gly

180 185 190

Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Leu Gly Ala Asp Asn Pro Asp Val

195 200 205

Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Lys

210 215 220

Cys Val Arg Gln Arg Asp Val Ile Asp Gln Thr Pro Thr Gly Pro Glu

225 230 235 240

Ile Val Pro Thr Trp Thr Pro

245

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcatctct ctcagcttgc cctccccttg ctcctcgctg cgggtgctca cgcccaaggt 60

gcccaaggca ccggcagaac aacccgctac tgggattgct gtaagccctc atgcgcctgg 120

cccggaaagt ccaacgccct gcaaccagtg caaacttgca atgcgcagga ccagcccctg 180

aacgatgggg gcaacacgcg ctccggctgc gactcgggcg gcagcgcttt catgtgctca 240

aaccaatcgc cctgggcgct gaacgaggca ctctcgtacg gctgggcggc ggttaggatc 300

gcgggccaga gtgaattcaa ctggtgctgt gcgtgttatg aattgacttt taccagtggg 360

ccggtggcgg ggaagaagat gattgtgcaa gcgacgaata cgggcgggga tttggggagt 420

aatcattttg atattgctat ccctggtggt ggtgttggta tcttcaatgc ctgcacccaa 480

caatacggcg cccctccaaa cggctggggt gagcggttcg gcgggatccg ctcgcgcagc 540

gagtgcgaca gcttccccga ggcgctcaaa gccggctgct actggcgttt cgactggttc 600

ctgggtgccg acaacccgga cgtctctttc aagcaggtgg cttgcccggc agccatcacg 660

gccaagagca agtgcgtgcg acagcgggat gtcatcgacc agacgccgac tggaccggag 720

attgtcccga cttggactcc ctaa 744

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggcgctga acgaggcact ctcgtac 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcgttcag cgcccagggc gattgg 26

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaacggctg gggtgagcgg ttcggcggga tccgctc 37

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaccgctcac cccagccgtt tggaggggcg ccgtat 36

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

1.一种酶活力和热稳定性提高的耐热纤维素酶突变体，其特征在于，所述耐热纤维素酶突变体是对嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)中糖苷水解酶第45家族的耐热纤维素内切酶CTendo45进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为第90位的Thr和第173位的Tyr，所述第90位的Thr突变为Ala，所述第173位的Tyr突变为Phe；

所述耐热纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的耐热纤维素酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用定点突变试剂盒引入目的突变氨基酸位点，扩增得到两端带有EcoRI和NotI酶切位点的突变酶扩增产物，将突变酶扩增产物连接至已双酶切的酵母表达载体pPIC9K上，获得携带目的基因的酵母表达载体；

(2)将携带目的基因的酵母表达载体进行线性化和去磷酸化处理，然后转化酵母感受态细胞，获得酵母工程菌；选择线性化限制性内切酶SacI和去磷酸化酶AP进行线性化和去磷酸化处理；

(3)将酵母工程菌进行诱导培养，培养液离心，收集上清粗酶液；将上清粗酶液进行沉淀、透析和分离纯化，获得耐热纤维素酶突变体；诱导培养的方法为：将活化后的酵母工程菌接种于BMGY培养基中，28℃振荡培养22-24h，离心后将菌液转移至BMMY培养基中开始诱导表达，每12h添加1mL甲醇，连续6-8d。

3.权利要求1所述的耐热纤维素酶突变体在饲料加工、食品行业、酿造业、制酒工业、新能源领域、造纸行业和纺织业中的应用。