JP2023530535A - 新規なプロモーター及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本出願は、新規なプロモーター及びこれを用いた目的物質の生産方法に関し、より詳しくはプロモーター活性を有する新規なポリヌクレオチド、これを含む遺伝子発現カセット及び宿主細胞、及び上記微生物を用いた目的物質の生産方法に関する。
Description
本出願は、新規なプロモーター及びこれを用いた目的物質の生産方法に関し、より詳しくはプロモーター活性を有する新規なポリヌクレオチド、それを含むベクター及び宿主細胞、及び上記微生物を用いた目的物質の生産方法に関する。
微生物において目的物質（例えば、アミノ酸）を生産する工程は、環境にやさしく安全な生産方法で多様な研究が進められてきており、そのうち、コリネバクテリウム属微生物において目的物質を多量に生産するための研究が持続的に行われてきた。コリネバクテリウム(Corynebacterium sp.)属微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)は、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多用されているグラム陽性の微生物である。上記Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質を生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。
コリネバクテリウム属微生物で生産される代表的な物質であるＬ－リシンは、動物飼料、ヒトの医薬品及び化粧品産業に使われており、コリネバクテリウム菌株を利用した発酵により生成されている。Ｌ－リシンの生合成関連の遺伝子が強化された微生物及びこれを用いたＬ－リシン生産方法などが知られている(KR 10-0924065B1)。
また、Ｌ－スレオニンは必須アミノ酸の一種であり、飼料及び食品添加剤として広く使用され、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料としても使用される。Ｌ－スレオニンは、植物性タンパク質に少なく入っており、動物飼料用添加剤として有用に用いられている。Ｌ－スレオニンは、主に人工変異法または遺伝子組み換え方法により開発された大腸菌またはコリネバクテリウム微生物などを利用した発酵法で生産される。代表的に、大腸菌由来のスレオニンオペロンをスレオニン生産菌株であるブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)に導入してL-スレオニンを生産する、遺伝子組み換え菌株を利用する方法(TURBA E、et al、Agric.Biol. Chem.53:2269～2271、1989)などが知られている。
Ｏ－アセチルホモセリンは、メチオニン生産の前駆体として使われる物質であり、メチオニン生合成経路上にある中間体である(WO2008/013432)。Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンは、ホモセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ(O-acetyl transferase)によりL-ホモセリン及びアセチル－ＣｏＡを基質として合成される。
Ｌ－イソロイシンは、他の分岐鎖アミノ酸であるＬ－バリン、Ｌ－ロイシンと主な生合成経路を共有している。Ｌ－イソロイシンの生合成経路を見ると、解糖過程(Glycolysis)で生成されるピルビン酸(pyruvate)とアスパラギン酸(Aspartate;Aspartic acid)由来のアミノ酸であるＬ－スレオニンから生成された２－ケト酪酸(2-ketobutyrate)が前駆体として使われる。二つの前駆体からアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase、AHAS)という酵素の作用を通じて２－アセト－２－ヒドロキシ酢酸(2-aceto-2-hydroxyacetate)が合成された後、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)を通じて２，３－ジヒドロキシ－３－メチル吉草酸(2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)が生成される。その後、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(dihydroxy acid dehydratase)を通じて２－ケト－３－メチル吉草酸(2-keto-3-methylvalerate)を経て、アミノトランスフェラーゼ(aminotransferase)の反応を通じて最終的にL-イソロイシンが生産される。また、上記アセトヒドロキシ酸シンターゼはピルビン酸(pyruvate)のデカルボキシル化(decarboyxlation)と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒してバリン及びロイシンの前駆体であるアセト乳酸を生産する。
Ｌ－トリプトファンは必須アミノ酸の一つであり、飼料添加剤など、または輸液剤などの医薬品原料及び健康食品素材などとして広く使われてきた。現在は微生物を用いた直接発酵法がＬ－トリプトファン生産に主に用いられている。
Ｌ－チロシンはアミノ酸の一つであり、薬品原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤などの重要素材として使われる。上記Ｌ－チロシン及びその他の有用物質を生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための多様な研究が行われている。微生物のＬ－チロシン生産過程は、５炭糖回路の中間物質であるＥ４Ｐ(Erythrose-4-Phosphate)と解糖過程(glycolysis)の中間物質であるPEP(Phosphoenolpyruvate)が重合反応して作られるＤＡＨＰ(3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)から始まる。その後、ＤＡＨＰは芳香族共通生合成経路を経て、コリスミ酸(chorismate)からプレフェン酸(prephenate)を経て、Ｌ－チロシン生合成経路を通じて最終的にＬ－チロシンに転換される。この過程でコリスミ酸はＬ－トリプトファンに、プレフェン酸はＬ－チロシンまたはＬ－フェニルアラニンに分岐することがある。したがって、Ｌ－チロシン生産量を増やすために芳香族共通生合成経路を強化する場合、Ｌ－トリプトファンとＬ－フェニルアラニンの生産も同時に増えることが予想できる。即ち、Ｌ－チロシンを生産しようとする場合、副産物としてフェニルアラニンとトリプトファンが共に生産されるため、遺伝子組換え及び精製などの多様な研究が伴わなければならない。一方、Ｌ－トリプトファンは、微生物が生産するＬ－トリプトファンの濃度によりリプレッサー(repressor)とアテニュエーター(attenuator)がその生産を同時に調節することが知られている(韓国登録特許10-0792095 B1)。
Ｌ－フェニルアラニンは、甘味剤であるＬ－アスパルチル－Ｌ－フェニルアラニンメチルエステルの出発物質である。
特定の有用物質に制限されない汎用的なプロモーターを開発する場合、多様な有用物質の生産に活用できるものと期待される。
このような背景の下で、本発明者らはコリネバクテリウム属微生物において高生産性で目的物質を製造できる新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを開発し、これを微生物に導入すれば目的とする物質の生産性を増加させることを確認し、本出願を完成した。
TURBA E、et al、Agric.Biol. Chem.53:2269～2271、1989
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本発明者らは、新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを製造するために鋭意努力した結果、目的遺伝子プロモーターを塩基置換を通じて改良させ、改良されたプロモーターがこれと作動可能に連結された遺伝子の発現を調節させることを確認することにより本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、上記ポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、上記ポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、上記宿主細胞を培地で培養する段階；及び上記培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての用途を提供する。
本出願の新規プロモーターは、目的物質を生産する微生物に導入され、微生物の目的物質生産量を増加させることができる。向上した生産収率により、産業的な面で生産の利便性と共に製造原価の節減などの効果が期待できる。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用できる。即ち、本出願で開示された様々な要素のすべての組合せが本出願の範疇に属する。また、下記の具体的な叙述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用し、本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知したり、確認することができる。また、このような等価物は本出願に含まれることが意図される。
本出願の一つの形態は、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
具体的には、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列に一つ以上のヌクレオチド置換を含む、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)で一定の長さ以上のDNA鎖である。
本出願において用語「プロモーター」はポリメラーゼ(polymerase)に対する結合部位を含み、プロモーター目的遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始の活性を有する、コード領域の上流(upstream)の非解読のヌクレオチド配列、即ち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域を意味する。上記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置することができる。
本出願において用語、「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、後に作動可能に連結させる遺伝子、即ち、目的遺伝子の発現のためにＲＮＡポリメラーゼまたはエンハンサーなどが結合する部位を含む目的遺伝子の転写させる部位の近くに存在するＤＮＡ領域を意味する。本出願の目的上、上記ポリヌクレオチドは汎用的プロモーターとして利用されてもよく、上記ポリヌクレオチドは、細胞内において、既存のプロモーターまたは細胞内在プロモーターと比較し、これと作動可能に連結された目的遺伝子の発現、上記目的遺伝子によりコードされるタンパク質の生産及び／又は活性が調節（例えば、増加または減少）されるものであってもよく、上記タンパク質が生産に関与する目的産物（生物学的活性物質として、例えば、アミノ酸、核酸、ビタミン、タンパク質、脂肪酸及び有機酸などからなる群から選択された１種類以上）の生産及び／又は活性を調節（例えば、増加または減少）させたものであってもよいが、これに制限されない。
例えば、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、トランスケトラーゼ（Transketolase，tkt）活性を有するポリペプチドの発現を強化させるプロモーターとして使用可能である。また、上記ポリヌクレオチドは、目的物質、具体的には、リシン、スレオニン、Ｏ－アセチルホモセリン、イソロイシン、トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニンの生産、または生産量を増加させるのに関与するポリヌクレオチドであってもよい。
本出願のポリヌクレオチドは、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列であれば制限なく含まれてもよい。
一具現例として、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むものであってもよい。具体的には、本出願において、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列に１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、または７以上のヌクレオチド置換を含む、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。上記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、本願において「変異型プロモーター」と混用されてもよく、本明細書では上述の用語がいずれも使用可能である。
本出願において、配列番号１のポリヌクレオチド配列は、トランスケトラーゼのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドの一例として挙げられる。また、プロモーター活性を有する限り、配列番号１のポリヌクレオチド配列において特定ヌクレオチドが置換されたポリヌクレオチドもトランスケトラーゼのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。配列番号１のポリヌクレオチド配列は変異の位置を表示するための代表的なポリヌクレオチド配列であってもよく、プロモーター活性を有するこれに相応する他のポリヌクレオチド配列も変異を導入できる配列に含まれる。例えば、トランスケトラーゼ(Transketolase、tkt)あるいはそれに相応する活性を有するポリペプチドのプロモーターの役割を果たせるポリヌクレオチド配列であれば、本出願の変異を導入できる配列の範囲に制限なく含まれてもよい。
上記配列番号１のヌクレオチド配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋでその配列を確認することができ、上記トランスケトラーゼのプロモーターの役割を果たせる配列として、上記配列番号１に相応する配列はコリネバクテリウム(Corynebacterium sp.)由来であってもよく、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)の配列であってもよいが、上記ポリヌクレオチドと同等またはそれ以上の活性を有する配列は、本出願のプロモーターに制限なく含まれてもよい。
本出願の上記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは既存のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列において、特異的位置のヌクレオチドが置換されてプロモーター活性が強化したものであってもよい。
一具現例として、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むものであってもよい。具体的には、配列番号１のヌクレオチド配列の一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるものであってもよい。上記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、本願において「変異型プロモーター」と混用され得る。
一具現例として、上記変異型プロモーターは配列番号１の２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドからなる群から選択されるいずれか一つ以上のヌクレオチドの他のヌクレオチドへの置換を含む、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、上記変異型プロモーターは上記位置でいずれか一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上または七つの位置すべて、またはこれらに相応する位置で他のヌクレオチドに置換されたものであってもよい。
上記「他のヌクレオチド」は置換前のヌクレオチドと異なるものであれば、制限されない。例えば、「配列番号１～２１８番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された」と記載する場合、シトシン（Ｃ）を除いたアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）に置換されることを意味する。また、特に表示しなくても、本出願において、あるヌクレオチドが「置換された」と記載する場合、置換前のヌクレオチドと異なるヌクレオチドに置換されることを意味する。
一方、当業者であれば、当業界において知られた配列アライメントを通じて任意のポリヌクレオチド配列において本出願の配列番号１の２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番、２２７番のヌクレオチドに相応する位置のヌクレオチドを把握することができ、本出願において別途に記載しなくても「特定配列番号において特異的位置のヌクレオチド」を記載する場合、任意のポリヌクレオチド配列においてそれと「相応する位置のヌクレオチド」まで含む意味であることは自明である。したがって、プロモーター活性を有する任意のポリヌクレオチド配列内で配列番号１のポリヌクレオチド２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番に相応する位置のヌクレオチドで構成された群から選択されるいずれか一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチド配列も本出願の範囲に含まれる。
一例として、配列番号１のポリヌクレオチドの２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番に相応する位置中、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、または７個のヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換する場合、非置換の（非変形の）プロモーター配列より高い活性を有するプロモーターを提供することができる。
具体的には、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、上記配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
具体的には、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、上記配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
具体的な例として、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に、２１９番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、２２０番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）に、２２１番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に、２２２番のヌクレオチドであるチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に、２２５番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）に、２２７番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）に置換されたポリヌクレオチドであってもよい。
より具体的な例として、配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、本出願においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むか、（必須に）構成されるものであってもよい。
また、前述の具現例に制限されず、プロモーター活性を大きく減少させない範囲でポリヌクレオチド配列に、多様な変形も含むことができる。例えば、本出願のヌクレオチド配列は、従来知られた突然変異誘発法、例えば、指向性進化法（direct evolution）及び部位特異的突然変異法(site-directed mutagenesis)などにより変形されてもよい。
この時、上記用語「変異」は、遺伝的または非遺伝的に安定的な表現型的変化を意味し、本明細書において「変形」または「突然変異」と混用して命名され得る。
したがって、本出願においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号２、または上記配列番号１または配列番号２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するポリヌクレオチド配列であってもよい。相同性または同一性を有するヌクレオチド配列は、上記範疇中、１００％の同一性を有する配列は除外されたり、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。
一方、本出願において「特定の配列番号で記載されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」、「特定の配列番号で記載されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」と記載されていても、当該配列番号のヌクレオチド配列で構成されたポリヌクレオチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも本出願で使用できることは自明である。
例えば、上記ポリヌクレオチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、当該配列番号のヌクレオチド配列の内部や末端に無意味な配列が付加され、あるいは当該配列番号のヌクレオチド配列の内部や末端の一部の配列が欠失されたポリヌクレオチドも本願の範囲内に属することが自明である。
相同性(homology)及び同一性(identity)は、二つの与えられた塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表示することができる。
用語、相同性と同一性は、しばしば相互交換的に利用できる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップのペナルティが共に利用できる。実質的に、相同性を有したり(homologous)または同一な(identical)配列は、一般に、配列の全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％により中間または高いストリンジェントな条件(stringent conditions)でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションはポリヌクレオチドにおいてコドンの代わりに縮退コドンを含むポリヌクレオチドも考慮される。
任意の二つのポリヌクレオチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al(1988)[Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85]:2444でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice et al.，2000，Trends Genet. 16: 276-277)(バージョン5.0または以降のバージョン)で行われるような、ニードルマン－ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48: 443-453)を使用して決定することができる（GCGプログラムパッケージ(Devereux，J.，et al，Nucleic Acids Research 12: 387 (1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA (Atschul，[S.] [F.,] [ET AL，J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers，Martin J. Bishop，[ED.,] Academic Press，San Diego,1994,及び[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Smith and Waterman、Adv.Appl.Math(1981)2:482に公知となった通り、例えば、Needleman et al.(1970)、J Mol Biol.48:443のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、二配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する)及びSchwartz and Dayhoff、eds.、Atlas Of Protein Sequence And Structure、National Biomedical Research Foundation、pp.353-358(1979)により開示された通り、Gribskov et al(1986)Nucl. Acids Res.14:6745の加重比較マトリックス(またはEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。したがって、本願で使用されたものとして、用語「相同性」または「同一性」は配列間の関連性（relevance）を示す。
また、公知の遺伝子配列から製造できるプローブ、例えば、前述のポリヌクレオチド配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件の下、ハイブリダイズし、同一な活性を有するポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含むことができる。上記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(例えば、J. Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989; F.M. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York)に具体的に記載されている。例えば、相同性(homology)または同一性(identity)が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
また、公知の遺伝子配列から製造できるプローブ、例えば、前述のポリヌクレオチド配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件の下、ハイブリダイズし、同一な活性を有するポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含むことができる。上記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(例えば、J. Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989; F.M. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York)に具体的に記載されている。例えば、相同性(homology)または同一性(identity)が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、配列全体に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節され得る。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野においてよく知られている (Sambrook et al.，supra，9.50-9.51，11.7-11.8を参照)。
本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、標準分子生物学技術を用いて分離または製造することができる。例えば、自動化されたＤＮＡ合成機を利用する標準合成技術を用いて製造することができるが、これに制限されるものではない。
本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、プロモーターとして利用されてもよい。
上記プロモーターは、ｍＲＮＡへの転写開始部位の５’部位に位置することができる。
上記プロモーターは従来のプロモーターに比べて増加または減少したプロモーター活性を有することができる。即ち、宿主細胞において目的遺伝子の発現だけでなく、目的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現及び／または活性を増加または減少させることができる。本出願の目的上、生産しようとする産物に応じて発現の強化または弱化のための目的遺伝子が変更されてもよく、上記プロモーターは、目的遺伝子の強化又は弱化のための汎用的プロモーターとして使用されてもよい。
本出願のもう一つの形態は、上記ポリヌクレオチド及び目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを提供する。
本出願のポリヌクレオチドは、前述の通りである。
本出願において用語「遺伝子発現カセット」とは、プロモーターと目的遺伝子を含んでおり、プロモーターの下流に作動可能に連結されている目的遺伝子を発現させ得る単位カセットを意味する。このような遺伝子発現カセットの内部又は外部には、上記目的遺伝子の効率的な発現を助ける多様な因子が含まれ得る。上記遺伝子発現カセットは、通常、上記目的遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター（promoter）以外に転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができるが、これに制限されない。
上記「目的遺伝子」は、本出願の目的上、本出願のプロモーター配列により発現を調節しようとする遺伝子を意味する。上記目的遺伝子によりコードするタンパク質は「目的タンパク質」と表現することができ、上記「目的タンパク質」をコードする遺伝子は「目的遺伝子」と表現することができる。
また、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退性(degeneracy)により、または上記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチド配列を変化させない範囲内でコード領域に、多様な変形が行われてもよい。ポリヌクレオチド配列に関する説明は、前述の通りである。
一具現例として、上記目的タンパク質は、トランスケトラーゼ(Transketolase、tkt)活性を有するポリペプチドであってもよい。即ち、上記プロモーターの目的遺伝子は、トランスケトラーゼ(Transketolase、tkt)活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
本出願において「トランスケトラーゼ(Transketolase、tkt)」は、五炭糖リン酸経路に影響を及ぼす酵素であり、Ｄ－キシルロース－５－リン酸とＤ－リボース－５－リン酸からＤ－セドヘプツロース－７－リン酸とＤ－グリセルアルデヒド－３－リン酸を生成し、その活性調節を通じて、リシン、スレオニン、Ｏ－アセチルホモセリン、イソロイシン、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンなどの有用物質の生産性向上の効果を得ることができる。
トランスケトラーゼをコードする遺伝子の例としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｔｋｔ遺伝子（ＮＣｇｌ１５１２）などがあってもよいが、これに制限されるものではない。当業者は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）で、トランスケトラーゼをコードする遺伝子情報を容易に得ることができる。
また、上記トランスケトラーゼを構成するアミノ酸配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋでその配列を得ることができる。一例として、コリネバクテリウム・グルタミクム由来であってもよい。
また、本出願の「トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチド」は、トランスケトラーゼの野生型、非変異形あるいは自然型だけでなく、これと同じ活性を有するか、これより活性が強化した変異体も含む。
本出願において、「変異型ポリペプチド」は、「変異体(variant)」と同じ意味であり、一つ以上のアミノ酸が保存的置換(conservative substitution)及び/または変形(modification)において上記列挙された配列(the recited sequence)と異なるが、上記タンパク質の機能(functions)または特性(properties)が維持されるタンパク質を指す。
変異体は、数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により識別される配列(identified sequence)と異なる。このような変異体は、一般に、上記タンパク質のアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸を変形し、上記変形されたタンパク質の特性を評価して識別できる。即ち、変異体の能力は、本来タンパク質(native protein)に比べて増加することがある。また、一部の変異体は、N末端リーダー配列または膜転移ドメイン(transmembrane domain)のような一つ以上の部分が除去された変異体を含むことができる。
上記用語「変異体」は、変異型、変形、変異タンパク質、変異などの用語（英語表現ではmodification，modified protein，modified polypeptide，mutant，mutein，divergent，variantなど)が使用でき、変異した意味で使用される用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、上記変異体は、天然の野生型または非変形タンパク質に比べて変異されたタンパク質の活性が増加したものであってもよいが、これに制限されない。
本出願において用語「保存的置換(conservative substitution)」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び/または化学的性質を有するもう一つのアミノ酸に置換させることを意味する。上記変異体は、一つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば一つ以上の保存的置換を有することができる。このようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/または両親媒性(amphipathic nature)における類似性に基づいて発生することがある。
また、変異体は、ポリペプチドの特性と2次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含むことができる。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に(co-translationally)または翻訳後に(post-translationally)タンパク質の移転(transfer)に関与するタンパク質N末端のシグナル(またはリーダー)配列とコンジュゲートすることができる。また、上記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製、または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートすることができる。
本出願のトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は「tkt遺伝子」と称することができる。
上記遺伝子は、コリネバクテリウム属微生物由来、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム由来であってもよい。
本出願において「tkt遺伝子」、即ち、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退性(degeneracy)により、または上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。
本出願のトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、変異体の配列も含み、具体的にはトランスケトラーゼの強化した活性を示すように変異したタンパク質の変異体も含むことができる。
本出願のもう一つの形態は、上記ポリヌクレオチドを含んだり、上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む組換えベクターを提供する。
本出願のポリヌクレオチド、目的タンパク質及び遺伝子発現カセットは、前述の通りである。
一具現例として、上記目的タンパク質はトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。
本出願において用語「ベクター」は、適合した宿主内で目的遺伝子を発現させるように遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であり、具体的には、これに作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。
本出願において用語「作動可能に連結された」(operatively linked)は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが目的遺伝子の転写を開始及び媒介するように上記遺伝子配列と機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知となった遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを使用して製作してもよいが、これに制限されない。
本出願の目的上、上記調節配列には、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが含まれてもよい。
一方、上記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列などの構成を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは関係なく複製されたり、機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本出願で使用されるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば、特に制限されず、当業界において知られた任意のベクターを用いて宿主細胞を形質転換させることができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態及び組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルスやパクテリオファージが挙げられる。
例えば、ファージベクター、またはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用してもよいが、これに制限されない。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用してもよいが、これに制限されない。また、上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は当業界において知られた任意の方法、例えば、相同組換えにより行われることができる。
本出願のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入され得るため、上記染色体挿入有無を確認するための選別マーカー(selection marker)を追加で含むことができる。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願において用語「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現することができれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり染色体外に位置したりに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、上記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含み、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態で導入されるものでも構わない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態またはこれを含むベクターの形態で宿主細胞に導入することができる。
上記形質転換する方法は、上記目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入するすべての方法を含み、宿主細胞により当分野において公知となったように適合した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、微細注入法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
本出願のもう一つの様態は、上記ポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞を提供する。
具体的には、上記宿主細胞はコリネバクテリウム属微生物、より具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であってもよいが、これに制限されるものではない。
具体的には、上記宿主細胞はコリネバクテリウム属微生物、より具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であってもよいが、これに制限されるものではない。
上記ポリヌクレオチド、目的タンパク質は前述の通りである。
本出願において用語「微生物」は野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化または弱化されるなどの原因により特定の機序が弱化または強化された微生物を全て含む概念である。具体的には、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドと目的タンパク質を含む微生物であってもよい。
上記目的タンパク質は、トランスケトラーゼ(Transketolase,tkt)活性を有するポリペプチドであってもよい。本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、目的タンパク質、トランスケトラーゼ(Transketolase、tkt)活性を有するポリペプチド、及びベクターについては前述した通りである。
上記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であってもよい。
上記微生物は、トランスケトラーゼを発現する微生物、またはトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する微生物、またはトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドが導入された微生物であってもよいが、これに制限されない。
本出願において、上記微生物は本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むことができ、具体的には、ポリヌクレオチド及び/またはポリヌクレオチドと作動可能に連結され、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。または、上記微生物は、上記ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含んでもよいが、これに制限されない。また、上記ポリヌクレオチド、上記目的タンパク質をコードする遺伝子及びベクターは形質転換により上記微生物に導入されてもよいが、これに制限されない。さらに、上記微生物は、上記遺伝子が発現できるものであれば、上記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子が、染色体上に位置したり、染色体外に位置することとは無関係である。
本出願において用語、タンパク質が「発現されるように/される」は、目的タンパク質、例えば、トランスケトラーゼあるいはその変異体が微生物内に導入されたり、微生物内で発現されるように変形された状態を意味する。上記目的タンパク質が微生物内に存在するタンパク質である場合、内在的又は変形前に比べてその活性が強化された状態を意味することができる。
具体的には、「タンパク質の導入」は、微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性を示すこと、もしくは当該タンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すことであってもよい。例えば、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されたり、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入され、その活性が示されることであってもよい。
また、「活性の強化」は、微生物が有する特定のタンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したものであってもよい。「内在的活性」は、自然的、または人為的要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味するものであってもよい。
本出願の目的上、上記活性の強化は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列を目的タンパク質の発現調節配列として使用して行われるものであってもよい。上記目的タンパク質は、前述のように、自然型もしくは変異型であり得るため、上記発現調節配列は、タンパク質の変異体をコードする遺伝子の発現調節配列であるか、染色体上の自然型タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列であってもよい。
その外に、他の活性の強化方法も組み合わせて使用することができる。例えば、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列を目的タンパク質の発現調節配列として使用する以外にも、目的タンパク質をコードする遺伝子の細胞内のコピー数の増加、染色体上の自然型タンパク質をコードする遺伝子を上記タンパク質の変異体をコードする遺伝子で交換する方法、上記タンパク質変異体の活性が強化するように、上記タンパク質をコードする遺伝子に変異を追加的に導入させる方法、及び微生物にタンパク質の変異体を導入する方法からなる群から選択されるいずれか一つ以上の方法を使用してもよいが、これに制限されない。
本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを微生物で目的タンパク質の発現調節として使用することにより、目的タンパク質の活性が強化されてもよい。
例えば、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型や非変形微生物菌株におけるタンパク質の活性または濃度を基準にして一般に、少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語「非変形微生物」は、微生物に自然に発生しうる突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然型の菌株自体であるか、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含まない微生物、または本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物も含む。
本出願において「目的物質を生産する微生物」は、自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化するなどの原因により特定の機序が弱化または強化された微生物であり、目的とする物質生産のための遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本出願の目的上、上記目的物質を生産する微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、野生型や非変形微生物と比較して目的とする物質を過量で生産できる微生物を意味することができる。
上記「目的物質を生産する微生物」は、「目的物質生産微生物」、「目的物質生産能を有する微生物」、「目的物質生産菌株」、「目的物質生産能を有する菌株」などの用語と混用され得る。
上記目的物質は、アミノ酸、具体的には、リシン、スレオニン、Ｏ－アセチルホモセリン、イソロイシン、トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニンであってもよい。より具体的な例として、上記リシンはＬ－リシン、上記スレオニンはＬ－スレオニン、上記Ｏ－アセチルホモセリンはＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン、上記イソロイシンはＬ－イソロイシン、上記トリプトファンはＬ－トリプトファン、上記チロシンはＬ－チロシン、上記フェニルアラニンはＬ－フェニルアラニンであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願の目的上、上記目的物質を生産する微生物は、目的物質、具体的には、リシン、スレオニン、Ｏ－アセチルホモセリン、イソロイシン、トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニンの生産能が向上したものであってもよい。
一方、上記目的物質生産微生物は野生型微生物であってもよく、または組換え微生物であってもよい。上記組換え微生物は前述の通りである。上記微生物は、さらに目的物質生産能の増加のための生合成経路の強化、フィードバック阻害解除、分解経路あるいは生合成経路を弱化させる遺伝子不活性化などの変異を含んでもよく、このような変異は、人工的に、例えば、ＵＶ照射により起こってもよいが、自然なものを排除するものではない。
具体的には、上記目的物質の生産微生物は、上記目的物質を生産できるように変異したものであってもよい。例えば、目的物質の生産能がない微生物を目的物質の生産能を有するように変異したり、生産能を強化させた微生物であってもよい。一例として、野生型微生物に目的物質を生産できるように生合成経路に関与するタンパク質またはその変異体が導入された微生物であってもよい(KR 10-2011994，KR 10-1947959)。
本出願の微生物は、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含まない微生物に比べて少なくとも１％、５％、１０％、１３％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、または２５％以上の目的物質生産能を有するものであってもよい。
本出願のもう一つの様態は、上記宿主細胞を培地で培養する段階；及び上記培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供する。
上記宿主細胞、目的物質は前述の通りである。
本出願において用語「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願において上記ポリヌクレオチドを含む微生物を用いて目的物質を生産する方法は、当業界において広く知られている方法を用いて行うことができる。具体的には、上記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程(fed batch or repeated fed batch process)で連続式で培養できるが、これに制限されるものではない。培養に使用される培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知となっている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981）。
培地中で使用できる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は個別にまたは混合物として使用でき、これに制限されるものではない。
使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別にまたは混合物として使用でき、これに制限されるものではない。
使用可能なリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。最後に、上記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用できる。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。上記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加することができる。
上記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例、空気）を注入することができる。
培養物（培地）の温度は、通常２０℃～４５℃、具体的には、２５℃～４０℃であってもよい。培養時間は、所望の目的物質の生成量が得られるまで継続できるが、具体的には１０～１６０時間であってもよい。
培養物（培地）からの目的物質の回収は、当業界において知られた常法により分離して回収されてもよい。このような分離方法には、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が利用できる。例えば、培養物を低速遠心分離し、バイオマスを除去して得られた上澄液を、イオン交換クロマトグラフィーを通じて分離できるが、これに制限されるものではない。
上記回収段階は精製工程をさらに含むことができる。
本出願のもう一つの様態は、配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての用途を提供する。
上記ポリヌクレオチドについては前述の通りである。
以下、本出願を実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１．新規プロモーターの目的遺伝子発現誘導活性の確認
実施例１－１．ランダム突然変異法を用いたｔｋｔプロモーター変異ライブラリの製作
まず、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)を根拠にして野生型(wild type)コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｔｋｔ遺伝子(NCBI登録番号NCgl1512)のプロモーター部位を含む塩基配列（配列番号１）を確保した。配列番号１の塩基配列からなるｔｋｔ遺伝子のプロモーター(Pntkt)を鋳型にDiversify PCR Random Mutagenesis Kit(takara)を用い、配列番号３及び４のプライマーを用いてメーカーのマニュアル通りにランダムに突然変異を誘発させて配列が異なるｔｋｔプロモーター変異ＰＣＲ産物(Pmtkt)を得た。また、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ(Open Reading Frame)はｐＧＦＰｕｖベクター(clontech、米国)を鋳型に、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、ＧＦＰのＯＲＦを含む遺伝子断片を得た。
実施例１－１．ランダム突然変異法を用いたｔｋｔプロモーター変異ライブラリの製作
まず、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)を根拠にして野生型(wild type)コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｔｋｔ遺伝子(NCBI登録番号NCgl1512)のプロモーター部位を含む塩基配列（配列番号１）を確保した。配列番号１の塩基配列からなるｔｋｔ遺伝子のプロモーター(Pntkt)を鋳型にDiversify PCR Random Mutagenesis Kit(takara)を用い、配列番号３及び４のプライマーを用いてメーカーのマニュアル通りにランダムに突然変異を誘発させて配列が異なるｔｋｔプロモーター変異ＰＣＲ産物(Pmtkt)を得た。また、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ(Open Reading Frame)はｐＧＦＰｕｖベクター(clontech、米国)を鋳型に、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、ＧＦＰのＯＲＦを含む遺伝子断片を得た。
上記増幅産物であるｔｋｔプロモーター変異ＰＣＲ産物(Pmtkt)及びＧＦＰをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断して準備した大腸菌－コリネバクテリウムシャトルベクター(shuttle vector)であるｐＣＥＳ２０８(J.Microbiol. Biotechnol. 18:639-647，2008)と混合して、ギブソン・アッセンブリー(DG Gibson et al.，NATURE METHODS，VOL.6 NO.5，MAY 2009，NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、各ベクターはｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ１ｔｋｔ＿ｇｆｐからｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ５０ｔｋｔ＿ｇｆｐまでと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
ｔｋｔプロモーター変異ライブラリの活性を確認するための対照群としては、野生型ｔｋｔ遺伝子のプロモーター（配列番号１）とＧＦＰが連結されている組換えベクターを使用した。野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型に、配列番号３及び４のプライマーを用いて野生型ｔｋｔ遺伝子のプロモーター遺伝子(Pntkt)を得た。また、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦはｐＧＦＰｕｖベクターを鋳型に、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、ＧＦＰのＯＲＦを含む遺伝子断片を得た。
上記増幅産物であるｔｋｔ野生型プロモーターＰＣＲ産物(Pntkt)及びＧＦＰをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断して準備したｐＣＥＳ２０８と混合し、ギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、これをｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
実施例１－２．形質転換菌株の製作
ベクターｐＣＥＳ２０８と上記実施例１－１で製作された組換えベクターライブラリｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ１ｔｋｔ＿ｇｆｐからｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ５０ｔｋｔ＿ｇｆｐ及びｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐをコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)で形質転換した後、カナマイシン(kanamycin)２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換した菌株を選別し、これをそれぞれＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ１ｔｋｔ＿ｇｆｐからＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ５０ｔｋｔ＿ｇｆｐ及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐと命名した。
ベクターｐＣＥＳ２０８と上記実施例１－１で製作された組換えベクターライブラリｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ１ｔｋｔ＿ｇｆｐからｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ５０ｔｋｔ＿ｇｆｐ及びｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐをコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)で形質転換した後、カナマイシン(kanamycin)２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換した菌株を選別し、これをそれぞれＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ１ｔｋｔ＿ｇｆｐからＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ５０ｔｋｔ＿ｇｆｐ及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐと命名した。
実施例１－３．ｔｋｔプロモーター変異選別
ｔｋｔプロモーター変異体の活性を確認するために、上記実施例１－２で獲得した形質転換菌株を以下の方法で培養し、ＧＦＰの活性を測定した。
ｔｋｔプロモーター変異体の活性を確認するために、上記実施例１－２で獲得した形質転換菌株を以下の方法で培養し、ＧＦＰの活性を測定した。
具体的には、培地（ブドウ糖２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１５０μｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ（蒸留水１Ｌ基準）、ｐＨ７．２）２５ｍｌが含まれたフラスコに形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株をそれぞれ接種し、３０℃で２０時間振とう培養した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１５分）を通じて培養液から菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液で懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビード（glass bead）を添加した後、ビードビーター（bead beater）を用いて、６分間菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）を通じて上層液を回収、ブラッドフォード方法によるタンパク質濃度を定量した。同一量の菌体抽出物に対してＬａｕｒｅ Ｇｏｒｙらの方法（FEMS Microbiology Letters 194，127-133，2001）を用いて４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍ発出光をＬＳ－５０Ｂ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Perkin-Elmer）機器を用いて測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現程度を測定した。その結果、対照群ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＥＳ２０８＿Ｐｎｔｋｔ＿ｇｆｐ 菌株のＧＦＰ遺伝子発現程度と比較し、最もＧＦＰ遺伝子発現程度が高い菌株１種を選別した（表１）。
上記表１に示されたように、Ｐｍ４ｔｋｔプロモーターはコリネバクテリウム・グルタミクムでプロモーター活性を示し、野生型ｔｋｔプロモーターより高い蛍光感度を示すことを確認した。
上記で選別されたＰｍ４ｔｋｔプロモーターに導入された変異を確認するために、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、配列分析を行った。野生型ｔｋｔプロモーター配列である配列番号１と比較し、これを通じて変異型ｔｋｔプロモーターの配列を確認し、その配列は下記表２の通りである（表２）。
実施例２．Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異導入ベクターの製作
実施例２－１．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異導入ベクターの製作
上記Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に導入するためのベクターを製作するために、配列番号９及び１０と配列番号１３及び１４のプライマーセットを用いてそれぞれ野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型にｔｋｔプロモーターアップストリーム(upstream)領域とｔｋｔのＯＲＦ一部を含むダウンストリーム(downstream)領域を得た。また、配列番号１１及び１２を用いてｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｇｆｐのベクターを鋳型としてプロモーター変異に該当するＰＣＲ産物を得た。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、それぞれのＰＣＲ産物を得た。上記三増幅産物をあらかじめＳｍａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＣＭ２ベクター(韓国公開番号第10-2020-0136813号)と混合してギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
実施例２－１．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異導入ベクターの製作
上記Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に導入するためのベクターを製作するために、配列番号９及び１０と配列番号１３及び１４のプライマーセットを用いてそれぞれ野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型にｔｋｔプロモーターアップストリーム(upstream)領域とｔｋｔのＯＲＦ一部を含むダウンストリーム(downstream)領域を得た。また、配列番号１１及び１２を用いてｐＣＥＳ２０８＿Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｇｆｐのベクターを鋳型としてプロモーター変異に該当するＰＣＲ産物を得た。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、それぞれのＰＣＲ産物を得た。上記三増幅産物をあらかじめＳｍａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＣＭ２ベクター(韓国公開番号第10-2020-0136813号)と混合してギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
実施例２－２．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ導入ベクターの製作
上記Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異（配列番号２）を有するｔｋｔ遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９に１ｃｏｐｙ導入するためのベクターを製作した。
上記Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異（配列番号２）を有するｔｋｔ遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９に１ｃｏｐｙ導入するためのベクターを製作した。
染色体上の相同組換え(Homologous recombination)が発生する位置にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のａｒｏＰ(Gamma-aminobutyrate permease，GenBank Accession No. WP_060564335.1)位置を欠損しながら目的遺伝子を挿入するベクターを製作した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８のプライマーセットを用いて染色体上の相同組換えが発生するａｒｏＰのアップストリーム(upstream)領域とダウンストリーム(downstream)領域の遺伝子断片をＰＣＲの遂行を通じて得た。重合酵素は、Ｓｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
増幅されたａｒｏＰアップストリームとダウンストリーム領域、そしてＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＣＭ２ベクターとギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
ＰＣＥＳ２０８＿Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｇｆｐを鋳型として配列番号１９及び２０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異を有する遺伝子断片をＰＣＲを通じて得た。また、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号２１及び２２のプライマーを用いてｔｋｔ遺伝子のＯＲＦを得た。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
増幅されたＰｍ４ｔｋｔ、ｔｋｔ遺伝子、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰは、ギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
また、Ｐｍ４ｔｋｔプロモーターとの比較のためにｔｋｔ遺伝子の自己プロモーター（Ｐｎｔｋｔ）の形態でｔｋｔ遺伝子を１ｃｏｐｙ追加させるためのベクターを製作した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１９及び２２のプライマーを用いてＰＣＲを遂行し、ｔｋｔ遺伝子の自己プロモーターを有するｔｋｔ遺伝子を得た。これを上記製作したＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体の形質転換用ベクターｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰとギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
実施例２－３．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異導入ベクターの製作
ａｒｏＰ位置に既に導入された自己プロモーターのｔｋｔ遺伝子のプロモーターをＰｍ４ｔｋｔプロモーター変異体で交換するために実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを鋳型として配列番号２３及び２４を用いてＰＣＲを行い、Ｐｍ４ｔｋｔ配列が含まれた遺伝子断片を得た。これをＳｍａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＣＭ２のベクターと混合してギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
ａｒｏＰ位置に既に導入された自己プロモーターのｔｋｔ遺伝子のプロモーターをＰｍ４ｔｋｔプロモーター変異体で交換するために実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを鋳型として配列番号２３及び２４を用いてＰＣＲを行い、Ｐｍ４ｔｋｔ配列が含まれた遺伝子断片を得た。これをＳｍａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＣＭ２のベクターと混合してギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
実施例３．目的産物生産能の評価
３－１．リシン生産能の評価
３－１－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＬ－リシン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体が形質転換された菌株を製作した。このため、Ｌ－リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ(US 9556463 B2)菌株に上記ベクターを形質転換させ、染色体内にｔｋｔプロモーター変異体の配列を導入した。ＣＪ３Ｐ菌株は、既に公知となった技術に基づいて野生株に３種の変異（ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）を導入してＬ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクム菌株である。
３－１．リシン生産能の評価
３－１－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＬ－リシン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体が形質転換された菌株を製作した。このため、Ｌ－リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ(US 9556463 B2)菌株に上記ベクターを形質転換させ、染色体内にｔｋｔプロモーター変異体の配列を導入した。ＣＪ３Ｐ菌株は、既に公知となった技術に基づいて野生株に３種の変異（ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）を導入してＬ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクム菌株である。
具体的には、上記実施例２－１で製作したベクターを電気穿孔法でＣＪ３Ｐ菌株に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ（ＣＭ０３－１６６１）と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２１年４月５日付で寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２９７１Ｐの付与を受けた。
３－１－２．ｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株のＬ－リシン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ菌株及び実施例３－１－１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－リシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ菌株及び実施例３－１－１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－リシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は、以下の通りである。
＜種培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ（蒸留水１リットルを基準）
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－リシンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ、ＣＪ３Ｐ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＬ－リシン濃度及び濃度増加率は、下記表３の通りである。
上記表３に示すように、ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＣＪ３Ｐ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株が、親株であるＣＪ３Ｐに比べてＬ－リシンの濃度が２３．８２％増加することを確認した。
実施例３－２．スレオニン生産能の評価
３－２－１．Ｌ－スレオニン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体で形質転換した菌株を製作するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株を基盤にｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体(韓国登録特許第10-2011994号)とｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）変異体(韓国登録特許第10-1947959号)を導入したＬ－スレオニン生産菌株を製作した。
３－２－１．Ｌ－スレオニン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体で形質転換した菌株を製作するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株を基盤にｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体(韓国登録特許第10-2011994号)とｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）変異体(韓国登録特許第10-1947959号)を導入したＬ－スレオニン生産菌株を製作した。
具体的には、Ｌ－スレオニン生産菌株を製作するために、まず、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を導入するためのベクターを製作した。ベクターを製作するために、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。上記増幅産物をＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体の形質転換用ベクターｐＤＣＭ２のベクターとギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）と命名した。クローニングは、ギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
上記で製作したｐＤＣＭ２－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株を配列番号２９及び３０のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）と命名した。
また、ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型として配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。重合酵素は、Ｓｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。上記増幅産物をＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体の形質転換用ベクターｐＤＣＭ２のベクターとギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）と命名した。クローニングは、ギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子の断片を計算されたモル数で混合後、５０℃で１時間保存することにより行った。
ｐＤＣＭ２－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）ベクターを上記で製作したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｈｏｍ遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株を配列番号３５及び３６のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）と命名した。
３－２－２．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＬ－スレオニン生産菌株の製作
上記実施例２－１で製作したｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）菌株に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
上記実施例２－１で製作したｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）菌株に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－２－３．ｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株のＬ－スレオニン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）、実施例３－２－２で製作されたＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－スレオニン生産能を評価するために下記の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）、実施例３－２－２で製作されたＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－スレオニン生産能を評価するために下記の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は下記の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ （蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ （蒸留水１リットルを基準）
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－スレオニンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＬ－スレオニン濃度及び濃度増加率は下記表４の通りである。
上記表４に示すように、ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株が親株であるＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）に比べてＬ－スレオニンの濃度が４１．３０％増加することを確認した。
実施例３－３．Ｏ－アセチルホモセリン生産能の評価
３－３－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＯ－アセチルホモセリン生産菌株の製作
上記実施例２－１で製作したｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを電気穿孔法で野生型菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え過程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－３－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＯ－アセチルホモセリン生産菌株の製作
上記実施例２－１で製作したｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを電気穿孔法で野生型菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え過程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－３－２．ｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、実施例３－３－１で製作されたＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能を評価するために、下記の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、実施例３－３－１で製作されたＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能を評価するために、下記の方法で菌株を培養した後、分析した。
下記の培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を白金耳接種し、３３℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、尿素３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ペプトン２．５ｇ、ＣＳＬ（Corn steep liquor，Sigma）５ｇ（１０ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、尿素３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ペプトン２．５ｇ、ＣＳＬ（Corn steep liquor，Sigma）５ｇ（１０ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットルを基準）
培養終了後、ＨＰＬＣでＯ－アセチルホモセリンの生産能を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＯ－アセチルホモセリン濃度及び濃度増加率は下記表５の通りである。
上記表５に示すようにｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＡＴＣＣ１３０３２：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株が、親株である野生型の菌株ＡＴＣＣ１３０３２に比べてＯ－アセチルホモセリンの濃度が４６．４３％増加することを確認した。
実施例３－４．イソロイシン生産能の評価
３－４－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＬ－イソロイシン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体が形質転換した菌株を製作するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１(韓国登録特許第10-1996769号)菌株に上記ベクターを形質転換させ、染色体内にｔｋｔプロモーター変異体の配列を導入した。その後、既に公知となったＬ－スレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase)をコードするｉｌｖＡ遺伝子の３２３番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに変異されたｉｌｖＡ遺伝子（Ｖ３２３Ａ）(Appl. Enviro. Microbiol.，Dec. 1996，p.4345-4351)を含むベクターを追加で導入してＬ－イソロイシン生産菌株を製作した(韓国登録特許第10-1996769号)。
３－４－１．ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＬ－イソロイシン生産菌株の製作
実施例２－１で製作されたｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを用いてｔｋｔプロモーター変異体が形質転換した菌株を製作するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１(韓国登録特許第10-1996769号)菌株に上記ベクターを形質転換させ、染色体内にｔｋｔプロモーター変異体の配列を導入した。その後、既に公知となったＬ－スレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase)をコードするｉｌｖＡ遺伝子の３２３番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに変異されたｉｌｖＡ遺伝子（Ｖ３２３Ａ）(Appl. Enviro. Microbiol.，Dec. 1996，p.4345-4351)を含むベクターを追加で導入してＬ－イソロイシン生産菌株を製作した(韓国登録特許第10-1996769号)。
具体的には、上記実施例２－１で製作したｐＤＣＭ２－Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターを電気穿孔法でＣＪＰ１菌株に導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え課程(cross-over)で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株を配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて選別し、上記選別された菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
上記製作されたＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株とＣＪＰ１菌株にｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）ベクター（韓国登録特許第10-1996769号）をそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得、上記選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）、ＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）と命名した。
３－４－２．ｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株のＬ－イソロイシン生産能の評価
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）、ＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株のＬ－イソロイシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）、ＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株のＬ－イソロイシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は下記の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ （蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖４５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４ ０．４５ｍｇ （蒸留水１リットルを基準）
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－イソロイシンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＰ１／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）、ＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株に対する培養液中のＬ－イソロイシン濃度及び濃度増加率は、下記表６の通りである。
上記表６に示すように、ｔｋｔプロモーター変異体が導入されたＣＪＰ１：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株がＣＪＰ１／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株に比べてＬ－イソロイシンの濃度が５７．３５％増加することを確認した。
実施例３－５．トリプトファン生産能の評価
３－５－１．Ｌ－トリプトファン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９菌株を基盤にＬ－トリプトファン生産菌株を製作した。
３－５－１．Ｌ－トリプトファン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９菌株を基盤にＬ－トリプトファン生産菌株を製作した。
具体的には、Ｌ－トリプトファン生合成遺伝子のオペロン(operon)をプロモーター強化を通じて発現を向上させた。また、ＴｒｐＥタンパク質のフィードバック制限(feedback inhibition)の解消のためｔｒｐＥの３８番のアミノ酸であるセリン(Serine)をアルギニン(Arginine)に置換した(JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Nov. 1987，p. 5330-5332)。
このような遺伝子操作のために、まず、染色体上の相同組換え(Homologous recombination)が発生するｔｒｐＥプロモーターアップストリーム(upstream)領域とダウンストリーム(downstream)領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７及び３８のプライマーを用いてｔｒｐＥプロモーターアップストリーム(upstream)領域を、配列番号４１及び４２のプライマーを用いてダウンストリーム(downsteam)領域の遺伝子断片をＰＣＲを通じて得た。また、合成製作したプロモーターＳＰＬ７(韓国登録特許第10-1783170号)及びｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）配列（配列番号４３）を鋳型として配列番号３９及び４０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
上記三増幅産物をＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＣＭ２ベクターとギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）と命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することにより行った。
製作されたｐＤＣＭ２－ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）ベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９菌株に電気穿孔法で形質転換後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地で形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上でｔｒｐＥのプロモーターをより強いプロモーターであるＳＰＬ７プロモーターで交換し、ＴｒｐＥの３８番のアミノ酸がセリンからアルギニンに交換された菌株を得た。これを遺伝子が挿入された相同組換えアップストリーム領域とダウンストリーム領域を増幅できる配列番号４４及び４５を利用したＰＣＲ及びゲノムシーケンスを通じて当該遺伝的操作を確認し、これをコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）と命名した。
３－５－２．ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ挿入されたＬ－トリプトファン生産菌株の製作
トリプトファンの生産は芳香族アミノ酸代謝回路に起因し、この代謝回路はホスホエノールピルビン酸（Phosphoenolpyruvate）とエリトロース４－リン酸（Erythrose4-phosphate）の縮合反応から始まる。したがって、二前駆体の円滑な供給は、トリプトファン生産の向上に必須であり、相対的に不足していると知られているエリトロース４－リン酸の円滑な供給のためにｔｋｔ遺伝子の過発現が必須である。これに実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ，ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ及びｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔを用いてＬ－トリプトファン生産菌株を製作した。
トリプトファンの生産は芳香族アミノ酸代謝回路に起因し、この代謝回路はホスホエノールピルビン酸（Phosphoenolpyruvate）とエリトロース４－リン酸（Erythrose4-phosphate）の縮合反応から始まる。したがって、二前駆体の円滑な供給は、トリプトファン生産の向上に必須であり、相対的に不足していると知られているエリトロース４－リン酸の円滑な供給のためにｔｋｔ遺伝子の過発現が必須である。これに実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ，ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ及びｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔを用いてＬ－トリプトファン生産菌株を製作した。
実施例３－５－１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）菌株に上記三ベクターを電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地から形質転換菌株を得た。２次交差過程を経て染色体上でａｒｏＰが欠損したり、ａｒｏＰ位置にＰｎｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子とＰｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子がそれぞれ挿入された菌株を得た。これは配列番号４６及び４７を利用したＰＣＲとゲノムシーケンスにより当該遺伝的操作を確認し、製作された菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－５－３．ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ挿入された菌株のＬ－トリプトファン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）、実施例３－５－２で製作された ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－トリプトファン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）、実施例３－５－２で製作された ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－トリプトファン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で２４時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は下記の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－トリプトファンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ），ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＬ－トリプトファン濃度及び濃度増加率は、下記表７の通りである。
上記表７に示されたように、Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ導入されたＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株が対照群であるＡＴＣＣ１３８６９：：ＰＳＰＬ７＿ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）△ａｒｏＰ菌株に比べてＬ－トリプトファンの濃度が６２．５０％増加することを確認した。
実施例３－６．チロシン生産能の評価
３－６－１．Ｌ－チロシン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、Ｌ－チロシン生産菌株であるＣＭ０６－００１０（韓国登録特許第10-2134418号、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）寄託番号ＫＣＣＭ１２４８７Ｐ）菌株を親株として形質転換を進めた。
３－６－１．Ｌ－チロシン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、Ｌ－チロシン生産菌株であるＣＭ０６－００１０（韓国登録特許第10-2134418号、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）寄託番号ＫＣＣＭ１２４８７Ｐ）菌株を親株として形質転換を進めた。
具体的には、実施例２－３で製作されたｐＤＣＭ２－△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔベクターをＣＭ０６－００１０菌株に電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地で形質転換菌株を得た。２次交差過程を経て染色体上でｔｋｔ自己プロモーター（Ｐｎｔｋｔ）が染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｔｋｔプロモーター変異体で交換された菌株を得た。これは、配列番号４８及び４９を利用したＰＣＲとゲノムシーケンスを通じて当該遺伝的操作を確認し、製作された菌株をＣＭ０６－００１０△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－６－２．ｔｋｔプロモーター変異体が導入された菌株のＬ－チロシン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＣＭ０６－００１０菌株と実施例３－６－１で製作されたＣＭ０６－００１０△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－チロシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクムＣＭ０６－００１０菌株と実施例３－６－１で製作されたＣＭ０６－００１０△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－チロシン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で２４時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は下記の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－チロシンの生産量を測定した。ＣＭ０６－００１０、ＣＭ０６－００１０△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＬ－チロシン濃度及び濃度増加率は下記表８の通りである。
上記表８に示すように、ｔｋｔ遺伝子の自己プロモーターがＰｍ４ｔｋｔ変異体で交換されたＣＭ０６－００１０△Ｐｎ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株が対照群であるＣＭ０６－００１０の菌株に比べてＬ－チロシンの濃度が４２．２９％増加することを確認した。
実施例３－７．フェニルアラニン生産能の評価
３－７－１．Ｌ－フェニルアラニン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９の菌株を基盤にＬ－フェニルアラニン生産菌株を製作した（韓国登録特許第10-2134418号を参照）。
３－７－１．Ｌ－フェニルアラニン生産菌株の製作
Ｐｍ４ｔｋｔプロモーター変異体の効果を確認するために、まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９の菌株を基盤にＬ－フェニルアラニン生産菌株を製作した（韓国登録特許第10-2134418号を参照）。
具体的には、Ｌ－チロシンによるフィードバック調節を受けるｔｙｒＡ遺伝子を強いプロモーターであるｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック調節を受けない変異型ｔｙｒＡで交換した。大腸菌由来のｔｙｒＡタンパク質は５３番のメチオニン（Methionine）がイソロイシン（Isoleucine）に、３５４番のアラニン（Alanine）がバリン（Valine）に変異されれば、フィードバックが解除されることが知られており、この形態（配列番号５０）を使用した（Appl. Microbiol. Biotechnol. 75，103-110 (2007)）。
上記遺伝子操作のために、まずｔｙｒＡ遺伝子を交換挿入するｔｙｒＡアップストリーム（upstream）とダウンストリーム（downstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５１及び５２のプライマーを用いてｔｙｒＡアップストリーム領域を、配列番号５３及び５４のプライマーを用いてダウンストリーム領域の遺伝子断片を得た。また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５５及び５６のプライマーを用いてｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲの遂行を通じて得、大腸菌由来の変異ｔｙｒＡは合成ＤＮＡを鋳型（配列番号５０）として配列番号５７及び５８のプライマーを用いて大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子断片をＰＣＲの遂行を通じて得た。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
増幅されたｔｙｒＡアップストリームとダウンストリーム領域、ｇａｐＡプロモーター、大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子断片、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体の形質転換用ｐＤＣＭ２のベクターをギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することにより行った。
製作されたｐＤＣＭ２－ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９菌株に電気穿孔法で形質転換後、２次交差過程を経て、ｔｙｒＡ遺伝子を欠損するとともにｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子が挿入された菌株を得た。配列番号５９及び６０のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンスを通じてその遺伝的操作を確認し、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍと命名した。
芳香族共通生合成経路の初段階であるａｒｏＧ遺伝子を大腸菌由来のフィードバック調節解除変異型ａｒｏＧに強いプロモーターを追加して強化した。大腸菌由来ａｒｏＧタンパク質は１５０番のプロリン（Proline）がロイシン（Leucine）に置換される場合、フィードバックが解除されることが知られており、この形態（配列番号６１）を使用した(Appl. Environ. Microbiol. 63，761-762 (1997))。
このような遺伝子操作のために、まずａｒｏＧ遺伝子を追加挿入するアップストリーム（upstream）とダウンストリーム（downstream）領域を得た。具体的には、染色体上の相同組換え（Homologous recombination）が発生する位置にコリネバクテリウム・グルタミクムのトランスポザーゼ（Transposase）の一つであるＢＢＤ２９＿１４４７０位置を使用してベクターを製作した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号６２及び６３のプライマーを用いてＢＢＤ２９＿１４４７０遺伝子のアップストリーム領域を、配列番号６４及び６５のプライマーを用いてダウンストリーム領域の遺伝子断片をＰＣＲの遂行を通じて得た。また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異型ａｒｏＧ遺伝子を確保するためにコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号６６及び６７のプライマーを用いてｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲの遂行を通じて得、大腸菌由来フィードバック解除変異型ａｒｏＧは合成ＤＮＡを鋳型（配列番号６１）として配列番号６８及び６９のプライマーを用いて変異型ａｒｏＧ遺伝子断片をＰＣＲの遂行を通じて得た。重合酵素はＳｏｌｇ（登録商標） Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
増幅されたＢＢＤ２９＿１４４７０遺伝子のアップストリームとダウンストリーム領域、ｇａｐＡプロモーター、大腸菌由来の変異型ａｒｏＧ遺伝子断片、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体の形質転換用ベクターｐＤＣＭ２をギブソン・アッセンブリー方法を用いてクローニングすることにより、組換えプラスミドを得、ｐＤＣＭ２－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍと命名した。クローニングはギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することにより行った。
製作されたｐＤＣＭ２－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍベクターをＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ菌株に電気穿孔法で形質転換後、２次交差過程を経て、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来フィードバック解除変異型ａｒｏＧ遺伝子が挿入された菌株を得た。配列番号７０及び７１のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンスを通じてその遺伝的操作を確認し、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ と命名した。
３－７－２．ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ挿入されたＬ－フェニルアラニン生産菌株の製作
実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ、ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ及びｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔを用いてＬ－フェニルアラニン生産菌株を製作した。実施例３－７－１で製作したＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ菌株に上記三ベクターを電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次交差過程を経て染色体上でａｒｏＰが欠損したり、ａｒｏＰ位置にＰｎｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子とＰｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子がそれぞれ挿入された菌株を得た。配列番号４６及び４７を利用したＰＣＲとゲノムシーケンスを通じて当該遺伝的操作を確認し、製作された菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
実施例２－２で製作されたｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ、ｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ及びｐＤＣＭ２－△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔを用いてＬ－フェニルアラニン生産菌株を製作した。実施例３－７－１で製作したＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ菌株に上記三ベクターを電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を得た。２次交差過程を経て染色体上でａｒｏＰが欠損したり、ａｒｏＰ位置にＰｎｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子とＰｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子がそれぞれ挿入された菌株を得た。配列番号４６及び４７を利用したＰＣＲとゲノムシーケンスを通じて当該遺伝的操作を確認し、製作された菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔと命名した。
３－７－３．ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ挿入された菌株のＬ－フェニルアラニン生産能の評価
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ 、実施例３－７－２で製作された ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－フェニルアラニン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
親株として利用したコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ 、実施例３－７－２で製作された ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍ ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株のＬ－フェニルアラニン生産能を評価するために、以下の方法で菌株を培養した後、分析した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で２４時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。上記種培地及び生産培地の組成は以下の通りである。
＜種培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ，ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ （蒸留水１リットルを基準）
ブドウ糖２０ｇ，ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ （蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
ブドウ糖３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットルを基準）。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＬ－フェニルアラニンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｎｔｋｔ＿ｔｋｔ，ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ菌株に対する培養液中のＬ－フェニルアラニン濃度及び濃度増加率は下記表９の通りである。
上記表９に示すように、Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ遺伝子が１ｃｏｐｙ導入された ＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ：：Ｐｍ４ｔｋｔ＿ｔｋｔ 菌株が対照群であるＡＴＣＣ１３８６９ΔｔｙｒＡ：：ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍΔＢＢＤ２９＿１４４７０：：ＰｇａｐＡ－ａｒｏＧｍ△ａｒｏＰ菌株に比べてＬ－フェニルアラニンの濃度が３９．０５％増加することを確認した。
以上の結果により、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む組換え微生物が産業に有用なL-リシン、L-スレオニン、O-アセチルホモセリン、L-イソロイシン、芳香族アミノ酸(Aromatic amino acid)であるＬ－トリプトファン、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンの生産性を増加させることを確認した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
受託番号
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２９７１Ｐ
受託日：２０２１０４０５
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２９７１Ｐ
受託日：２０２１０４０５
Claims (13)
- 配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番、２１９番、２２０番、２２１番、２２２番、２２５番及び２２７番のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
- 上記ポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列において２１８番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に、２１９番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、２２０番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）に、２２１番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に、２２２番のヌクレオチドであるチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に、２２５番のヌクレオチドであるアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）に、２２７番のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）に置換されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 上記ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 上記ポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結される、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセット。
- 上記目的タンパク質は、トランスケトラーゼ(Transketolase)である、請求項５に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、宿主細胞。
- 上記目的タンパク質は、トランスケトラーゼ(Transketolase)である、請求項７に記載の宿主細胞。
- 上記宿主細胞は、コリネバクテリウム属微生物である、請求項７に記載の宿主細胞。
- 上記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項９に記載の宿主細胞。
- 請求項７に記載の宿主細胞を培地で培養する段階；及び上記培地から目的物質を回収する段階；を含む目的物質を生産する方法。
- 上記目的物質は、アミノ酸である、請求項１１に記載の方法。
- 上記目的物質は、リシン、スレオニン、Ｏ－アセチルホモセリン、イソロイシン、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群から選択される一つ以上である、請求項１１に記載の方法。
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