CN115698046A

CN115698046A - 新型启动子及其用途

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Publication number: CN115698046A
Application number: CN202180005398.6A
Authority: CN
Inventors: 权娜罗; 朴素静; 郑武泳; 金径林; 金希英; 李在旼; 金贤雅
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2023-02-03
Also published as: JP2023530535A; JP7422888B2; CA3171537A1; EP4116317A1; AU2021420802A1; ZA202208680B; BR112022019132A2; MX2022011083A

Abstract

本申请涉及一种新型启动子和使用该启动子生产目标材料的方法。更具体地，本申请涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、基因表达盒和包含该多核苷酸的宿主细胞，以及使用该微生物生产目标材料的方法。

Description

新型启动子及其用途

[技术领域]

本申请涉及新型启动子和使用该启动子生产目标材料的方法。更具体地，本申请涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和宿主细胞以及使用微生物生产目标材料的方法。

[背景技术]

以作为环保和安全生产方法的多种方式研究了从微生物生产目标材料(例如氨基酸)的工艺。其中，连续地进行研究以在棒状杆菌属微生物中生产大量的目标材料。棒状杆菌属微生物，具体是谷氨酸棒状杆菌，是广泛用于生产L-氨基酸和其他有用材料的革兰氏阳性微生物。为了生产L-氨基酸和其他有用材料，正在进行多种研究以开发具有高效生产的微生物和用于发酵工艺的技术。

L-赖氨酸是由棒状杆菌属微生物生产的代表性材料，用于动物饲料、人用药物和化妆品工业，并且是利用棒状杆菌菌株发酵生产的。L-赖氨酸生物合成相关基因被增强的微生物和使用该微生物生产L-赖氨酸的方法等是本领域已知的(KR 10-0924065B1)。

此外，L-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛用于饲料和食品添加剂，并且也用于医用输液和作为医药原料。由于L-苏氨酸的植物蛋白含量低，因此有效地用作动物饲料的添加剂。L-苏氨酸主要通过利用大肠杆菌或使用人工突变或基因重组开发的棒状杆菌属微生物发酵生产。通常，使用基因重组菌株通过将大肠杆菌来源的苏氨酸操纵子引入黄色短杆菌、生产苏氨酸的菌株等来生产L-苏氨酸的方法是本领域已知的(TURBAE，等人，Agric.Biol.Chem.53:2269–2271,1989)。

O-乙酰高丝氨酸是用作甲硫氨酸生产前体的物质并且是甲硫氨酸生物合成途径中的中间体(WO 2008/013432)。O-乙酰基-L-高丝氨酸由L-高丝氨酸和乙酰辅酶A作为底物通过高丝氨酸O-乙酰转移酶合成。

L-异亮氨酸与其他支链氨基酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸共享主要的生物合成途径。关于L-异亮氨酸的生物合成途径，由L-苏氨酸生产的2-酮丁酸被用作前体，L-苏氨酸是由糖酵解中生产的丙酮酸和天冬氨酸衍生的氨基酸。由这两种前体通过乙酰羟酸合酶(AHAS)的作用合成2-乙酰-2-羟基乙酸，然后通过乙酰羟酸异构还原酶产生2,3-二羟基-3-甲基戊酸酯。随后，在二羟酸脱水酶的作用下生成2-酮-3-甲基戊酸酯，并通过转氨酶反应最终产生L-异亮氨酸。此外，乙酰羟酸合酶催化丙酮酸的脱羧和与其他丙酮酸分子的缩合反应，以产生乙酰乳酸，其为缬氨酸和亮氨酸的前体。

L-色氨酸是必需氨基酸之一，广泛用于饲料添加剂，或作为用于输液等药物的原料，以及作为保健食品的材料。目前，L-色氨酸主要通过使用微生物直接发酵生产。

L-酪氨酸是一种氨基酸，并被用作医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂等的重要材料。为了生产L-酪氨酸和其他有用的材料，正在进行多种研究以开发具有高效生产的微生物和用于发酵工艺的技术。通过微生物的L-酪氨酸生产工艺始于3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)，它是糖酵解的中间体磷酸烯醇丙酮酸(PEP)与戊糖磷酸途径的中间体赤藓糖-4-磷酸(E4P)的聚合反应产生的。然后，DAHP通过常见的芳香族生物合成途径从分支酸生物合成为预苯酸，并最终通过L-酪氨酸生物合成途径转化为L-酪氨酸。在这个工艺期间，分支酸可以分流成L-色氨酸，预苯酸可以分流成L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。因此，当加强共同的芳香族生物合成途径以增加L-酪氨酸的产量时，可以预期L-色氨酸和L-苯丙氨酸的产量同时也将增加。即，为了生产L-酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸作为副产物一起生产，因此，必须进行例如基因重组、纯化等多种研究。同时，已知根据微生物生产的L-色氨酸的浓度，由阻遏物和衰减物调节L-色氨酸的生产(韩国专利号10-0792095)。

L-苯丙氨酸是L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的起始原料，它是一种甜味剂。

如果开发出不限于具体有用材料的通用启动子，则期望其可用于生产多种有用材料。

在这种情况下，本发明人开发了具有新型启动子活性的多核苷酸，其能够在棒状杆菌属微生物中以高产率生产目标材料，并证实了通过将多核苷酸引入微生物中可以提高目标材料的生产率，从而完成本申请。

[发明内容]

[技术问题]

本发明人为制备具有启动子活性的新型多核苷酸付出了广泛的努力，结果证实，靶基因启动子可以通过核苷酸取代而增强，并且增强的启动子可以调节与该启动子可操作地连接的基因的表达，从而完成了本申请。

[技术方案]

本申请的一个目的是提供具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸被其他核苷酸取代。

本申请的另一个目的是提供基因表达盒，其包括：多核苷酸；和与多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

本申请的仍另一个目的是提供宿主细胞，其包括：多核苷酸；和与多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

本申请的还另一个目的是提供用于生产目标材料的方法，其包括：在培养基中培养宿主细胞；和从培养基中回收目标材料。

本申请的甚至另一个目的是提供多核苷酸作为启动子的用途，其中SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸被其他核苷酸取代。

[有利效果]

可以将本申请的新型启动子引入用于生产目标材料的微生物中，以增加微生物的目标材料的产量。由于改进的生产产率，在工业方面可以期望例如生产成本降低以及生产便利的效果。

[具体实施方式]

下面将详细描述本申请。同时，本文公开的每个描述和实施方式可以分别应用于其他描述和实施方式。即，本文公开的各种要素的所有组合都落入本申请的范围内。进一步地，本申请的范围不受以下所述的具体描述的限制。

此外，本领域普通技术人员仅使用常规实验就能够识别或确认本文所述的本发明的具体方面的许多等价物。此外，还旨在将这些等价物包括在本申请中。

本申请的一个方面提供了一种具有启动子活性的多核苷酸。

具体地，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以是包括SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中的至少一个核苷酸取代的具有启动子活性的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”是作为核苷酸聚合物的具有超过一定长度的DNA链，其是通过共价键连接的核苷酸单体的长链。

如本文所用，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译核苷酸序列，其包括聚合酶的结合位点并具有起始转录启动子-靶基因为mRNA的活性，即当聚合酶与其结合时导致特定基因转录起始的DNA区域。启动子可以位于mRNA转录起始位点的5'区域。

如本文所用，术语“具有启动子活性的多核苷酸”是指存在于如此区域附近的DNA区域，该区域参与靶基因的转录，所述靶基因包括结RNA聚合酶或增强子的结合位点，用于表达与其下游可操作地连接的基因，即靶基因。出于本申请的目的，多核苷酸可以用作一般用途的启动子。此外，与现有启动子或细胞内部启动子相比，多核苷酸可以在细胞中调节(例如，增加或减少)与其可操作地连接的靶基因的表达和由靶基因编码的蛋白质的生产和/或活性，并且可以调节(例如，增加或减少)参与生产蛋白质的目标产物(作为生物活性材料，例如，选自氨基酸、核酸、维生素、蛋白质、脂肪酸和有机酸等中的至少一种)的生产和/或活性，但不限于此。

例如，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以用作能够增强具有转酮醇酶(tkt)活性的多肽表达的启动子。另外，多核苷酸可以是参与增加赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的生产或产量的多核苷酸。

本申请的多核苷酸可以包括具有启动子活性的任何多核苷酸序列，但不限于此。

在一个实例中，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以包括具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中的至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。具体地，在本申请中，具有启动子活性的多核苷酸可以是具有启动子活性的多核苷酸，其包括在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或七个或更多个核苷酸取代。在本申请中，具有启动子活性的多核苷酸可以与“修饰的启动子”互换使用，并且所有上述术语都可以在本文中使用。

在本申请中，SEQ ID NO:1的多核苷酸序列可以是例如具有转酮醇酶启动子活性的多核苷酸。另外，在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中具体核苷酸被取代的多核苷酸也可以是具有转酮醇酶启动子活性的多核苷酸，只要它具有启动子活性。SEQ ID NO:1的多核苷酸序列可以是用于指示突变位置的代表性多核苷酸，并且与其对应的具有启动子活性的其他多核苷酸序列也包括在可以引入突变的序列中。例如，能够充当转酮醇酶(tkt)的启动子的任何多核苷酸序列或具有相应活性的多肽都可以包括在本申请的可以引入突变的序列范围内，而不限于此。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以从已知数据库NCBI GenBank中确认，并且对应于SEQ ID NO:1的序列作为可以用作转酮醇酶的启动子的序列，可以来源于棒状杆菌属某种，并且具体地，可以是谷氨酸棒状杆菌的序列，但本申请的启动子中可以包含具有与该多核苷酸同等或更高活性的序列，但不限于此。

本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以是其中通过在具有存在启动子活性的多核苷酸序列中的具体位置处的核苷酸取代来增强启动子活性的多核苷酸。

在一个实施方式中，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以包括具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中的至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。具体地，它可以由具有启动子活性的多核苷酸组成，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中的至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。在本申请中，具有启动子活性的多核苷酸可以与“修饰的启动子”互换使用。

在一个实施方式中，修饰的启动子可以是具有启动子活性的多核苷酸，包括用其他核苷酸取代选自218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸的至少一个核苷酸。具体地，修饰的启动子可以是其中任何一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或七个上述位置或其对应位置被其他核苷酸取代的启动子。

如本文所用，术语“另一个/其他核苷酸”不受限制只要它与取代前的核苷酸不同。例如，当描述“SEQ ID NO:1中218位的核苷酸被另一个核苷酸取代”时，意味着它被腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)取代，除了胞嘧啶(C)。此外，除非另有说明，当描述具体核苷酸被“取代”时，意味着该核苷酸被与取代前的核苷酸不同的另一个核苷酸取代。

同时，本领域技术人员可以通过本领域已知的序列比对鉴定任何多核苷酸序列中对应于本申请的SEQ ID NO:1的218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸的位置处的核苷酸。进一步地，除非本文另有说明，当描述“具体SEQ ID NO中具体位置处的核苷酸”时，显然是指包括任何多核苷酸序列中的“在对应位置处的核苷酸”。因此，其中在具有启动子活性的任何多核苷酸序列中的选自对应于SEQ ID NO:1的218、219、220、221、222、225和227位的位置处的核苷酸的任何一个或更多个核苷酸被其他核苷酸取代的多核苷酸序列也落入本申请的范围内。

在一个实例中，当在与SEQ ID NO:1的218、219、220、221、222、225和227位的位置处的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或七个核苷酸被其他核苷酸取代时，可以得到具有比未取代(未修饰)的启动子序列更高活性的启动子。

具体地，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以是其中SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中的218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸被其他核苷酸取代的多核苷酸，但不限于此。

在一个具体实例中，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以是以下的多核苷酸，其中在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中，218位的核苷酸胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，第219位的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代、220位的核苷酸腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代、221位的核苷酸腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)取代、222位的核苷酸胸腺嘧啶(T)被鸟嘌呤(G)取代、225位的核苷酸腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)和227位的核苷酸胞嘧啶(C)被腺嘌呤(A)取代。

在更具体的实例中，它可以是由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成的多核苷酸。具体地，本申请中的具有启动子活性的多核苷酸可以是包括SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或由(基本上由)其组成的多核苷酸。

此外，对多核苷酸序列的多种修饰可以包括在不显著降低启动子活性的范围内，而不限于上述实施方式。例如，可以通过常规已知的诱变例如定向演化、定点诱变等来修饰本申请的核苷酸序列。

具体地，术语“修饰”是指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且在本文中可以通过术语“修饰”或“突变”互换地指代。

因此，本申请中的具有启动子活性的多核苷酸可以是具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的多核苷酸序列，或者是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的多核苷酸序列。具有同源性或同一性的核苷酸序列可以是上述范围内的序列，不包括具有100％同一性的序列，或者可以是具有小于100％同一性的序列。

同时，在本申请中，尽管它被描述为“具有具体SEQ ID NO的核苷酸序列的多核苷酸”或“包括具体SEQ ID NO的核苷酸序列的多核苷酸”，但是显然其中在核苷酸序列的部分被缺失、修饰、取代或添加的任何多核苷酸也可以用于本申请，只要该多核苷酸与由相应SEQ ID NO.的核苷酸序列组成的多核苷酸具有相同或相应的活性。

例如，只要多核苷酸具有与该多核苷酸相同或相应的活性，则显然其中在相应的SEQ ID NO的核苷酸序列之内或末端处添加了无意义的序列，在相应的SEQ ID NO的核苷酸序列之内或末端处缺失序列的部分的多核苷酸也落入本申请的范围中。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。

术语同源性和同一性通常可以彼此互换使用。

保守多核苷酸的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与通过所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源或同一序列可以在中等或高度严格条件下杂交，使得序列的全长或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多可以杂交。还考虑了在杂交多核苷酸中含有简并密码子而非密码子的多核苷酸。

任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性可以例如通过已知的计算机算法例如“FASTA”程序(Pearson等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)使用默认参数确定。可选地，它可以通过使用EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277)(优选地5.0.0版本或更新)(GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))执行的Needleman–Wunsch算法(Needlemanand Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,JMOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,AcademicPress,San Diego,1994,和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)来确定。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以例如通过使用例如GAP计算机程序(如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443)比较序列信息来确定，如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所公开的。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似地比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的序列中的符号总数而得到的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(包含值1表示同一性，0表示非同一性)和Gribskov等人(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)(或EDNAFULL替换矩阵(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)中所公开的)；(2)对每个空位处以3.0的罚分，对每个空位中的每个符号额外处以0.10的罚分(或10的空位打开罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)没有对末端空位的罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性。

另外地，可以非限制性地包括可以从已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下可以与与全部或部分多核苷酸序列互补的序列杂交并显示同一活性的任何多核苷酸序列。“严格条件”是指这样的条件，在该条件下允许多核苷酸之间特异性杂交。此类条件在文献中具体描述(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。例如，严格条件可以包括这样的条件，在该条件下具有40％或更高、具体地70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、更具体地95％或更高、更具体地97％或更高、仍更具体地99％或更高的高度同源性或同一性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因彼此不杂交，或Southern杂交的洗涤条件，即在对应于60℃、1×SSC、0.1％ SDS，具体地60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS，和更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％ SDS的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地两次或三次。

杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间的错配可能存在，这取决于杂交的严格性。术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请可以包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及与其基本上相似的核酸序列。

具体地，具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用包括在上述条件下T_m值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测。进一步地，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，本领域技术人员可以根据其目的适当调整。

用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量在本领域中是众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50–9.51、11.7–11.8)。

本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以使用标准分子生物学技术分离或制备。例如，它可以使用自动化DNA合成仪使用标准合成技术来制备，但不限于此。

本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以用作启动子。

启动子可以位于mRNA内转录起始位点的5'区域处。

与常规启动子相比，该启动子可以具有增加或减少的启动子活性。即，启动子可以增加或减少由靶基因编码的蛋白质的表达和/或活性以及靶基因在宿主细胞中的表达。出于本申请的目的，用于表达增强或减弱的靶基因可以根据待生产的产物而改变，并且启动子可以用作增强或减弱靶基因的通用启动子。

本申请的另一方面提供了一种基因表达盒，其包括所述多核苷酸和靶基因。

本申请的多核苷酸如上所述。

如本文所用，术语“基因表达盒”是指包含启动子和靶基因因此可以表达可操作地连接到启动子下游的靶基因的单元盒。这样的基因表达盒可以包括可以帮助在盒内部或外部有效表达靶基因的多种因素。除了可操作地连接到靶基因的启动子之外，基因表达盒通常可以包括转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号，但不限于此。

如本文所用，术语“靶基因”是指出于本申请的目的其表达受本申请的启动子序列控制的基因。由靶基因编码的蛋白质可以表述为“靶蛋白”，编码“靶蛋白”的基因可以表述为“靶基因”。

此外，由于密码子简并性或考虑到其中表达本申请的多核苷酸的生物体中优选的密码子，编码靶蛋白的多核苷酸可以在不改变多肽序列的范围内在编码区进行多种修饰。多核苷酸序列如上所述。

在一个实施方式中，靶蛋白可以是具有转酮醇酶(tkt)活性的多肽。即，启动子的靶基因可以是编码具有转酮醇酶(tkt)活性的多肽的基因。

如本文所用，术语“转酮醇酶”是影响戊糖磷酸途径并由D-木酮糖-5-磷酸和D-核糖-5磷酸生产D-景天庚酮糖-7-磷酸和D-甘油醛-3-磷酸的酶，通过调节其活性，可得到增强例如赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的有用材料的产率的效果。

编码转酮醇酶的基因的实例可以包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032等的tkt基因(NCgl1512)，但不限于此。本领域技术人员可以很容易地从已知数据库GenBank等中得到编码转酮醇酶的基因的信息。

另外，构成转酮醇酶的氨基酸序列可以从已知的数据库NCBI的GenBank得到。例如，它可以来源于谷氨酸棒状杆菌。

此外，本申请的“具有转酮醇酶活性的多肽”不仅包括转酮醇酶的野生型、未修饰或天然形式，而且还包括具有相同活性或增强活性的突变体。

如本文所用，“修饰的多肽”与“变体”具有相同的含义，是指如此蛋白质，其通过保守取代和/或修饰而具有一个或更多个氨基酸与所述序列不同，使得保留蛋白质的功能和性质。

这些变体不同于通过取代、缺失或添加数个氨基酸而鉴定的序列。此类变体通常可通过修饰蛋白质的一种或多种上述氨基酸序列并评估修饰的蛋白质的性质来鉴定。即，变体的能力可以相对于天然蛋白质增强。进一步地，一些变体可包括其中一个或多个部分(例如N-末端前导序列或跨膜结构域)已被去除的那些变体。

术语“变体”可以与例如修饰、修饰的蛋白质、修饰的多肽、突变体、突变蛋白、分歧者、变体等术语互换使用，只要这些术语用于指示变异。出于本申请的目的，变体可以是与天然野生型或非修饰蛋白质的活性相比，修饰蛋白质的活性增强的变体，但不限于此。

如本文所用，术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代氨基酸。该变体可以具有例如至少一种保守取代，同时保留至少一种生物活性。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。

此外，变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以在N末端与参与共翻译或翻译后蛋白质转移的信号(或前导)序列缀合。进一步地，多肽还可以与另一个序列或接头缀合以鉴定、纯化或合成多肽。

编码本申请的具有转酮醇酶活性的多肽的基因可以称为“tkt基因”。

该基因可以来源于棒状杆菌属微生物，和具体来源于谷氨酸棒状杆菌。

在本申请中，由于密码子简并性或考虑到其中表达多肽的生物体中优选的密码子，编码具有“tkt基因”，即转酮醇酶活性的多肽的多核苷酸，可以在不改变多肽序列的范围内在编码区进行多种修饰。

本申请的具有转酮醇酶活性的多肽可以包括变体序列，并且可以具体地包括修饰的蛋白质的变体，使得可以表达增强的转酮醇酶活性。

本申请的仍另一个方面提供了重组载体——其包括多核苷酸、或基因表达盒——其包括与多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

本申请的多核苷酸、靶蛋白和基因表达盒如上所述。

在一个实施方式中，靶蛋白可以是具有转酮醇酶活性的多肽。

如本文所用，术语“载体”是人工DNA分子，其具有能够使靶基因在合适的宿主细胞中表达的遗传物质，具体是指包括可操作地连接其上的编码靶蛋白的基因的核苷酸序列的DNA构建体。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指具有本申请的启动子活性的多核苷酸与基因序列功能性地连接，从而可以起始和介导靶基因的转录。可操作的连接可以使用本领域公知的基因重组技术制备，位点特异性DNA切割和连接可以使用本领域已知的切割和连接酶等制备，但不限于此。

出于本申请的目的，调节序列可以包括本申请的具有启动子活性的多核苷酸。

同时，调节序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调节这种转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列和用于调节转录和翻译的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，载体可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可以整合到其基因组中。

本申请中使用的载体可能不被具体限制，只要载体可在宿主细胞中表达，并且可以使用本领域已知的任何载体转化宿主细胞。常规使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。

例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体；可以使用基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些载体作为质粒载体，但载体不限于此。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但载体不限于此。可以通过本领域公知的方法，例如同源重组，进行将多核苷酸插入染色体。

由于本申请的载体可以经由同源重组插入到染色体中，因此可以进一步包括用于确认插入到染色体中的选择标记。选择标记用于选择转化的细胞，即，用于确认多核苷酸的插入，并且可以使用能够提供可选择的表型例如药物抗性、营养需求、对细胞毒剂的抗性或表面蛋白表达的标记。在选择剂处理的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达其他表型性状，从而可以选择转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而使由多核苷酸编码的蛋白质能够在宿主细胞中表达的工艺。对于转化的多核苷酸，无论是否插入宿主细胞的染色体中并位于染色体内或位于染色体外都没有关系，只要它可以在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸可以包括编码靶蛋白的DNA和RNA，并且可以以任何形式引入，只要它可以引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入，该表达盒是基因构建体，其包括自我表达所需的所有必要元件；或者以包括表达盒的载体的形式引入。

转化方法可以包括可以将编码靶蛋白的基因引入细胞的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的适当的标准技术来进行转化。例如，该方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法和醋酸锂-DMSO法等，但不限于此。

本申请的又另一方面提供了宿主细胞，其包括：所述多核苷酸，以及与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

具体地，宿主细胞可以是棒状杆菌属的微生物，更具体地，是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

多核苷酸和靶蛋白如上所述。

如本文所用，术语“微生物”是既包括野生型微生物，也包括天然或人工基因修饰的微生物的概念，并且它可以是由于插入外源基因或增强或弱化内源基因的活性而具有具体弱化或增强机制的微生物。具体地，可以是包含具有启动子活性的多核苷酸和靶蛋白的微生物。

靶蛋白可以是具有转酮醇酶(tkt)活性的多肽。具有启动子活性的多核苷酸、靶蛋白、具有转酮醇酶(tkt)活性的多肽和载体如上所述。

微生物可以是棒状杆菌属的微生物，更具体地是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

所述微生物可以是表达转酮醇酶的微生物、表达具有转酮醇酶活性的多肽的微生物或引入了具有转酮醇酶活性的多肽的微生物，但不限于此。

在本申请中，微生物可以包括本申请的具有启动子活性的多核苷酸，具体可以包括多核苷酸和/或与该多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。可选地，微生物可包括含有多核苷酸或编码基因表达调节序列和靶蛋白的基因的载体，但不限于此。此外，多核苷酸、编码靶蛋白的基因和载体可以通过转化引入微生物中，但不限于此。进一步地，只要基因可以表达，无论编码多核苷酸和靶蛋白的基因是位于染色体上还是位于染色体外都没有关系。

如本文所用，关于蛋白质的术语“被表达/表达”是指将靶蛋白例如转酮醇酶或其变体引入微生物中或修饰靶蛋白以在微生物中表达的状态。当靶蛋白是存在于微生物中的蛋白质时，该术语是指其中蛋白质的活性与其内源性蛋白质或其修饰前的活性相比增强的状态。

具体地，术语“蛋白质的引入”是指微生物表现出该微生物原本不具有的具体蛋白质的活性，或者该微生物表现出与其内源性活性或修饰前蛋白质的活性相比增强的活性。例如，它可能意味着将编码具体蛋白质的多核苷酸引入微生物的染色体中；或者将含有编码具体蛋白质的多核苷酸的载体引入微生物中，从而允许展现具体蛋白质的活性。

此外，术语“活性增强”是指微生物所具有的具体蛋白质的活性与其内源性活性或其修饰前的活性相比得到增强。术语“内源性活性”是指在微生物的性状由于天然或人为因素引起的基因突变而改变的情况下，亲本菌株在修饰之前原来具有的具体蛋白质的活性。

出于本申请的目的，可以通过将本申请的具有启动子活性的多核苷酸序列用作靶蛋白的表达调节序列来实现活性的增强。由于靶蛋白可以是如上所述的天然蛋白或修饰蛋白，因此表达调节序列可以是编码蛋白变体的基因的表达调节序列，或染色体上编码天然蛋白的基因的表达调节序列。

另外，可以组合使用其他增强活性的方法。例如，除了使用本申请的具有启动子活性的多核苷酸作为靶蛋白的表达调节序列之外，还可以使用任何一种或多种选自以下的方法：用于增加编码靶蛋白的基因的细胞内拷贝数的方法；用编码蛋白质变体的基因替换染色体上编码天然蛋白的基因的方法；进一步将突变引入编码蛋白质的基因中使得蛋白质变体的活性增强的方法；以及将蛋白质变体引入微生物的方法，但方法不限于此。

通过使用本申请的具有启动子活性的多核苷酸作为微生物中的靶蛋白的表达调节序列，可以增强靶蛋白的活性。

例如，基于野生型或非修饰的微生物菌株中蛋白质的活性或浓度，相应蛋白质的活性或浓度可以增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，并且最多1,000％或2,000％，但增加的范围不限于此。

如本文所用，术语“非修饰的微生物”不排除含有可能在微生物中天然发生的突变的菌株，并且可以是野生型菌株本身，或者可以包括不含有本申请的具有启动子活性的多核苷酸的微生物、或未用含有本申请的具有启动子活性的多核苷酸的载体转化的微生物。

如本文所用，“用于生产目标材料的微生物”包括天然或人工发生基因修饰的所有微生物，并且它可以是其中由于外源基因的插入或内源性基因的活性增强或失活而削弱或增强具体机制的微生物，并且可以是其中发生基因修饰以生产所期望产物或活性增强的微生物。出于本申请的目的，生产目标材料的微生物可以指与野生型或非修饰的微生物相比，能够过量生产目标材料的微生物，其包括本申请的具有启动子活性的多核苷酸。

“用于生产目标材料的微生物”可以与“生产目标材料的微生物”、“具有生产目标材料的能力的微生物”、“生产目标材料的菌株”、“具有生产目标材料的能力的菌株”等互换使用。

目标材料可以是氨基酸，具体是赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。在更具体的实例中，赖氨酸可以是L-赖氨酸，苏氨酸可以是L-苏氨酸，O-乙酰高丝氨酸可以是O-乙酰基-L-高丝氨酸，异亮氨酸可以是L-异亮氨酸，色氨酸可以是L-色氨酸，和酪氨酸可以是L-酪氨酸，苯丙氨酸可以是L-苯丙氨酸，但目标材不限于此。

出于本申请的目的，用于生产目标材料的微生物可以是那些其中生产目标材料，具体是赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的能力得到增强的微生物。

同时，用于生产目标材料的微生物可以是野生型微生物或重组微生物。重组微生物如上所述。微生物可以进一步包括突变，例如加强生物合成途径以增加生产目标材料的能力、解除反馈抑制或基因失活以削弱降解途径或生物合成途径等，并且这些突变可以例如是通过UV照射人为引起的，但不排除天然发生的突变。

具体地，可以将用于生产目标材料的微生物进行突变，使得可以生产目标材料。例如，其可以是其中不具有生产目标材料能力的微生物被突变为具有生产目标材料的能力的微生物的那些微生物，或者它可以是具有增强生产能力的微生物。例如，它可以是一种微生物，其中引入了参与生物合成途径的蛋白质或其变体，使得可以在野生型微生物中生产目标材料(KR 10-2011994、KR 10-1947959)。

本申请的微生物与不包括具有启动子活性的多核苷酸的微生物相比，可以具有生产至少1％、5％、10％、13％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或25％或更多的目标材料的能力。

本申请的甚至另一个方面提供了用于生产目标材料的方法，包括在培养基中培养宿主细胞；和从培养基中回收目标材料。

宿主细胞和目标材料如上所述。

如本文所用，术语“培养”是指微生物在适当的、人工控制的环境条件中生长。在本申请中，使用包含多核苷酸的微生物生产目标材料的方法可以通过本领域公知的方法进行。具体地，培养可以以分批工艺、补料分批工艺或重复补料分批工艺连续进行，但不限于此。用于培养的培养基必须以适当的方法满足具体菌株的要求。属于棒状杆菌属的菌株的培养基是已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.AmericanSociety for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。

碳源的实例可以包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等；油脂，如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可以单独使用或组合使用，但不限于此。

氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)、大豆粉和尿素；或无机氮源，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独或组合使用，但不限于此。

磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。另外，培养基可以含有生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，可以使用生长必需的材料，例如氨基酸和维生素。另外，也可以在培养基中含有适当的前体。以上材料可以通过适当的方法以分批型或连续型添加到培养物中。

可以通过使用例如氢氧化钠、氢氧化钾和氨的碱性化合物或例如磷酸和硫酸的酸性化合物来适当调节培养物的pH。另外，可以添加例如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来防止泡沫生成。为了维持培养物的好氧状态，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。

培养物(培养基)的温度可通常为20℃到45℃，优选为25℃到40℃，并可以持续培养直到得到期望量的目标材料，和也可以具体进行10至160小时。

从培养物(培养基)中回收目标材料可以通过本领域已知的常规方法分离和回收。作为分离方法，可以使用例如离心、过滤、层析和结晶的方法。例如，通过将培养物在低速下离心除去生物质而得到的上清液可以通过离子交换色谱分离，但不限于此。

回收步骤还可包括纯化工艺。

本申请的仍进一步另一个方面提供了多核苷酸作为启动子的用途，其中SEQ IDNO:1的多核苷酸序列中218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸被其他核苷酸取代。

多核苷酸如上所述。

[实施本发明的方式]

本申请将通过实施例的方式进行详细描述。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅出于说明目的给出，并不旨在将本发明的范围限制于此。

实施例1.新启动子的诱导靶基因表达活性的确认

实施例1-1.使用随机诱变构建tkt启动子变体文库

首先，根据美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)，得到了含有野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的tkt基因(NCBI注册号NCgl1512)的启动子区的核苷酸序列(SEQ IDNO:1)。

PCR随机诱变试剂盒(Random Mutagenesis Kit)(takara)使用由SEQ IDNO:1的核苷酸序列组成的tkt基因的启动子(Pntkt)作为模板，根据制造商的手册将SEQ IDNO:3和4的引物用于诱导随机诱变，从而得到具有不同序列的tkt启动子变体PCR产物(Pmtkt)。另外，使用SEQ ID NO:5和6的引物，基于pGFPuv载体(clontech，USA)作为模板，对GFP基因的ORF(开放阅读框)进行PCR。将Solg^TM Pfu-X聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟，以得到含有GFP的ORF的基因片段。

将tkt启动子变体PCR产物(Pmtkt)、扩增产物和GFP与用BamHI/SalI限制性内切酶切割的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体pCES208(J.Microbiol.Biotechnol.18:639–647,2008)混合，并使用Gibson组装方法(DG Gibson等人,NATURE METHODS,Vol.6No.5,MAY2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)克隆以得到重组质粒，每个载体命名为pCES208_Pm1tkt_gfp至pCES208_Pm50tkt_gfp。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

作为用于确认tkt启动子变体文库的活性的对照，使用了其中野生型tkt基因的启动子(SEQ ID NO:1)和GFP连接的重组载体。野生型tkt基因的启动子基因(Pntkt)是使用SEQ ID NO:3和4的引物，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032作为模板而得到的。另外，使用SEQ ID NO:5和6的引物，基于pGFPuv载体作为模板对GFP基因的ORF(开放阅读框)进行PCR。使用Solg^TM Pfu-X聚合酶作为聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟，以得到含有GFP的ORF的基因片段。

将野生型tkt启动子变体PCR产物(Pntkt)、扩增产物和GFP与用BamHI/SalI限制性内切酶切割的pCES208混合，并使用Gibson组装法克隆以得到重组质粒，所得产物命名为pCES208_Pntkt_gfp。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

实施例1-2.转化的菌株的构建

将pCES208载体和实施例1-1中制备的包括pCES208_Pm1tkt_gfp至pCES208_Pm50tkt_gfp和pCES208_Pntkt_gfp的重组载体文库经由电穿孔(Appl.Microbiol.Biothcenol.(1999)52:541–545)转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株，得到的菌株分别命名为ATCC13032/pCES208、ATCC13032/pCES208_Pm1tkt_gfp至ATCC13032/pCES208_Pm50tkt_gfp和ATCC13032/pCES208_Pntkt_gfp。

实施例1-3.tkt启动子变体的选择

为了确认tkt启动子变体的活性，将实施例1-2中得到的转化菌株以如下方式培养，测量GFP活性。

具体地，将每种转化的谷氨酸棒状杆菌菌株接种到含有25mL培养基(葡萄糖(20g)、硫酸铵(5g)、酵母提取物(5g)、尿素(1.5g)、KH₂PO₄(4g)、K₂HPO₄(8g)、MgSO₄·7H₂O(0.5g)、生物素(150μg)、硫胺素-HCl(1.5mg)、泛酸钙(3mg)和烟酰胺(3mg)(基于1L蒸馏水)，pH 7.2)并在30℃的培养箱中振荡培养20小时。通过离心(5,000rpm，15分钟)回收细菌细胞，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤两次，并悬浮在相同的缓冲液中。将玻璃珠以1.25g/1.5mL的量添加到悬浮液中，并使用珠磨器(bead beater)粉碎细菌细胞持续6分钟。然后，对所得物进行离心(15,000rpm，20分钟)以从中回收上清液，并通过Bradford法定量蛋白质浓度。对于等量的细菌细胞提取物，根据Laure Gory等人(FEMS MicrobiologyLetters 194,127–133,2001)引入的方法，在488nm处进行激发光照射，并使用LS-50B分光光度计(Perkin-Elmer)测量511nm处的发射光，从而测量GFP基因的表达水平。结果，与对照ATCC13032/pCES208_Pntkt_gfp菌株的GFP基因表达水平相比，选择了具有最高GFP基因表达水平的菌株(表1)。

[表1]

如表1所示，确认了Pm4tkt启动子在谷氨酸棒状杆菌中显示出启动子活性，并且显示出比野生型tkt启动子更高的荧光灵敏度。

为了确认引入到以上所述选择的Pm4tkt启动子中的突变，使用SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR，然后进行序列分析。将Pm4tkt启动子与野生型tkt启动子序列SEQ ID NO:1进行比较，以确认tkt启动子变体的序列，并且序列如下表2中所示。

[表2]

实施例2.用于引入Pm4tkt启动子变体的载体的构建

实施例2-1.用于将Pm4tkt启动子变体引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的载体的构建

为了构建用于将Pm4tkt启动子变体引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的载体，使用SEQ ID NO:9和10以及SEQ ID NO:13和14的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模版，得到了tkt启动子的上游区域和包括tkt的ORF的部分的下游区域。此外，使用SEQ ID NO:11和12，基于pCES208_Pm4tkt_gfp载体作为模板，得到了对应于启动子变体的PCR产物。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟，从而得到PCR产物。将三种扩增产物与之前被SmaI限制性内切酶切割的pDCM2载体(韩国专利申请公开号10-2020-0136813)混合，并使用Gibson组装法克隆以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-Pm4tkt_tkt。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

实施例2-2.将Pm4tkt_tkt引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的载体的构建

制备用于将具有Pm4tkt启动子变体(SEQ ID NO:2)的tkt基因的一个拷贝引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的载体。

制备用于插入靶基因同时缺失作为在染色体上发生同源重组的位置的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的aroP(γ-氨基丁酸透性酶，GenBank登录号WP_060564335.1)位置的载体。

具体地，使用SEQ ID NO:15和16以及SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物对，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA，通过PCR得到在染色体上发生同源重组的aroP的上游和下游区域中的基因片段。Solg^TM Pfu-X聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装法克隆扩增的aroP的上游和下游区域以及经SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体，以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-ΔaroP。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

基于pCES208_Pm4tkt_gfp作为模板，使用SEQ ID NO:19、20的引物进行PCR，并且通过PCR得到具有Pm4tkt启动子变体的基因片段。另外，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO:21和22的引物得到tkt基因的ORF。Solg^TM Pfu-X聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装法克隆扩增的Pm4tkt、tkt基因和经ScaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2-ΔaroP载体，以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-ΔaroP::Pm4tkt_tkt。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

另外，为了与Pm4tkt启动子进行比较，制备了以tkt基因自身的启动子(Pntkt)的形式添加一个拷贝的tkt基因的载体。具体地，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO:19和22的引物进行PCR，得到具有tkt基因自身启动子的tkt基因。使用Gibson组装法克隆如此得到的基因和上述制备的经ScaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2-ΔaroP载体，以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-ΔaroP::Pntkt_tkt。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

实施例2-3.用于将Pm4tkt启动子变体引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的载体的构建

为了用Pm4tkt启动子变体替换先前引入aroP位置的tkt基因的天然启动子，使用SEQ ID NO:23和24，基于实施例2-2中制备的pDCM2-ΔaroP::Pm4tkt_tkt载体作为模板，进行PCR，得到了包含Pm4tkt序列的基因片段。将如此得到的基因片段与经SmaI限制性内切酶切割的pDCM2载体混合，并使用Gibson组装法克隆得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-ΔPn::Pm4tkt_tkt。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

实施例3.目标产物的生产能力的评估

3-1.赖氨酸生产能力的评价

3-1-1.引入tkt启动子变体的L-赖氨酸生产菌株的构建

使用实施例2-1中制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体制备用tkt启动子变体转化的菌株。为此，将载体转化到为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(US 9556463 B2)中，以将tkt启动子变体序列引入染色体。由于基于先前已知的技术将三种类型的突变(pyc(P458S)、hom(V59A)和lysC(T311l))引入野生型菌株中，CJ3P菌株是具有L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌菌株。

具体地，将实施例2-1中制备的载体经由电穿孔转化入CJ3P菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段引入tkt启动子变体的菌株，将由此选择的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CJ3P::Pm4tkt_tkt(CM03-1661)，并于2021年4月5日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物保藏中心，登录号为KCCM12971P。

3-1-2.引入tkt启动子变体的菌株的L-赖氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌CJ3P菌株和实施例3-1-1中制备的谷氨酸棒状杆菌CJ3P::Pm4tkt_tkt菌株的L-赖氨酸生产能力，以下列方式培养菌株并进行分析。

首先，将每种菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板(corner-baffle)烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养48小时。营养培养基、种子培养基和生产培养基的组成如下所示。

<种子培养基(pH 7.0)>

葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH₂PO₄ 4g，K₂HPO₄ 8g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(基于1L蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

葡萄糖45g，大豆蛋白10g，糖蜜10g，(NH₄)₂SO₄ 15g，KH₂PO₄ 0.55g，MgSO₄·7H₂O0.6g，FeSO₄·7H₂O 9mg，MnSO₄·5H₂O 9mg，生物素0.9mg，硫胺素-HCl 4.5mg，CaCO₃ 30g，泛酸钙4.5mg，烟酰胺30mg，ZnSO₄ 0.45mg，CuSO₄ 0.45mg(基于1L蒸馏水)

培养完成后，使用HPLC测量L-赖氨酸的生产。谷氨酸棒状杆菌CJ3P和CJ3P::Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的L-赖氨酸浓度和浓度增加率如下表3所示。

[表3]

菌株名称	L-赖氨酸浓度(g/L)	L-赖氨酸浓度增加率(％)
			CJ3P	4.03	-
CJ3P::Pm4tkt_tkt	4.99	23.82％

如表3所示，确认了与亲本菌株CJ3P相比，引入tkt启动子变体的CJ3P::Pm4tkt_tkt菌株的L-赖氨酸的浓度增加了23.82％。

实施例3-2.苏氨酸生产能力的评价

3-2-1.L-苏氨酸生产菌株的构建

为了使用实施例2-1中制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体构建用tkt启动子变体转化的菌株，首先，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株，制备引入lysC(L377K)突变体(韩国专利号10-2011994)和hom(R398Q)突变体(韩国专利号10-1947959)的L-苏氨酸生产菌株。

具体地，为了制备L-苏氨酸生产菌株，首先制备用于引入lysC(L377K)的载体。为了制备该载体，使用SEQ ID NO:25和26以及SEQ ID NO:27和28的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株的染色体作为模板进行PCR。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。使用Gibson组装法克隆扩增产物和经SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-lysC(L377K)。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

将由此制备的pDCM2-lysC(L377K)载体经由电穿孔引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQ ID NO:29和30的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段将核苷酸突变引入lysC基因的菌株，并将选择的菌株命名为ATCC13032::lysC(L377K)。

此外，为了制备用于引入hom(R398Q)的载体，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株的染色体作为模版，使用SEQ ID NO:31和32以及SEQ ID NO:33和34的引物对，进行PCR。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。使用Gibson组装法克隆扩增产物和经SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体以得到重组质粒，所得产物命名为pDCM2-hom(R398Q)。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

将上述制备的pDCM2-hom(R398Q)载体经由电穿孔引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)菌株，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQ ID NO:35和36的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段将核苷酸突变引入hom基因的菌株，并将选择的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)。

3-2-2.引入tkt启动子变体的L-苏氨酸生产菌株的构建

将实施例2-1制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体经由电穿孔引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段引入tkt启动子变体的菌株，将选择的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)-Pm4tkt_tkt。

3-2-3.引入tkt启动子变体的菌株的L-苏氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)和实施例3-2-2中制备的ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)-Pm4tkt_tkt的L-苏氨酸生产能力，以下列方式培养菌株并进行分析。

首先，将每种菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养48小时。营养培养基、种子培养基和生产培养基的组成如下所示。

<种子培养基(pH 7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

培养完成后，使用HPLC测量L-苏氨酸的生产。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)和ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)-Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的L-苏氨酸浓度和浓度增加率如下表4所示。

[表4]

如表4所示，与亲本菌株ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)相比，引入tKt启动子变体的ATCC13032::lysC(L377K)-hom(R398Q)-Pm4tkt_tkt菌株中L-苏氨酸的浓度增加了41.30％。

实施例3-3.O-乙酰高丝氨酸生产能力的评价

3-3-1.引入tkt启动子变体的O-乙酰高丝氨酸生产菌株的构建

将实施例2-1中制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体经由电穿孔引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段引入tkt启动子变体的菌株，并将选择的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032::Pm4tkt_tkt。

3-3-2.引入tkt启动子变体的O-乙酰高丝氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和实施例3-3-1中制备的ATCC13032::Pm4tkt_tkt的O-乙酰高丝氨酸生产能力，以下列方式培养并分析菌株。

使用接种环将上述菌株接种到含有25mL以下培养基的250mL角挡板烧瓶中，然后在33℃下以200rpm振荡培养20小时。

<生产培养基(pH 7.2)>

葡萄糖30g，KH₂PO₄ 2g，尿素3g，(NH₄)₂SO₄ 40g，蛋白胨2.5g，CSL(玉米浆，Sigma)5g(10mL)，MgSO4·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 20g(基于1L蒸馏水)

培养完成后，通过HPLC测量O-乙酰高丝氨酸生产能力。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和ATCC13032::Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的O-乙酰高丝氨酸浓度和浓度增加率如下表5所示。

[表5]

如表5所示，确认了与亲本菌株野生型ATCC13032菌株相比，引入tkt启动子变体的ATCC13032::Pm4tkt_tkt株中O-乙酰高丝氨酸的浓度增加了46.43％。

实施例3-4.异亮氨酸生产能力的评价

3-4-1.引入tkt启动子变体的L-异亮氨酸生产菌株的构建

为了使用实施例2-1中制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体制备用tkt启动子变体转化的菌株，首先，将该载体转化到谷氨酸棒状杆菌CJP1(韩国专利号10-1996769)菌株中，然后将tkt启动子变体序列引入其染色体。此后，进一步引入含有ilvA基因(V323A)的载体(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,pp.4345–4351))从而制备L-异亮氨酸生产菌株(韩国专利号10-1996769)，其中编码先前已知的L-苏氨酸脱水酶的ilvA基因的第323个氨基酸缬氨酸被突变为丙氨酸。

具体地，将实施例2-1中制备的pDCM2-Pm4tkt_tkt载体经由电穿孔引入CJP1菌株，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，通过使用SEQID NO:7和8的引物进行PCR和测序，选择通过插入染色体上的DNA片段引入tkt启动子变体的菌株，并将选择的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CJP1::Pm4tkt_tkt。

将pECCG117-ilvA(V323A)载体各自引入上述制备的CJP1::Pm4tkt_tkt菌株和CJP1菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。选择的菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)和CJP1::Pm4tkt_tkt/pECCG117-ilvA(V323A)。

3-4-2.引入tkt启动子变体的菌株的L-异亮氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)和CJP1::Pm4tkt_tkt/pECCG117-ilvA(V323A)菌株的L-异亮氨酸生产能力，以下列方式培养菌株并进行分析。

<种子培养基(pH 7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

培养完成后，使用HPLC测量L-异亮氨酸的生产。谷氨酸棒状杆菌CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)和CJP1::Pm4tkt_tkt/pECCG117-ilvA(V323A)菌株在培养基中的L-异亮氨酸浓度和浓度增加率如下表6所示。

[表6]

如表6所示，确认了与CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)菌株相比，引入tkt启动子变体的CJP1::Pm4tkt_tkt/pECCG117-ilvA(V323A)菌株的L-异亮氨酸浓度增加了57.35％。

实施例3-5.色氨酸生产能力的评价

3-5-1.L-色氨酸生产菌株的构建

为了确认Pm4tkt启动子变体的效果，首先，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株制备L-色氨酸生产菌株。

具体地，L-色氨酸生物合成基因操纵子的表达通过启动子增强而增强。另外，为了解除对TrpE蛋白的反馈抑制，用精氨酸取代trpE的第38个氨基酸丝氨酸(JOURNAL OFBACTERIOLOGY,Nov.1987,pp.5330–5332)。

对于遗传操作，首先得到染色体上发生同源重组的trpE启动子的上游和下游区域。具体地，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，通过PCR，使用SEQ IDNO:37和38的引物得到trpE启动子上游区域的基因片段，使用SEQ ID NO:41和42的引物得到下游区域的基因片段。另外，基于合成的启动子SPL7(韩国专利号10-1783170)和trpE(S38R)序列(SEQ ID NO:43)作为模板，使用SEQ ID NO:39和40的引物进行PCR。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装法克隆三种扩增产物和由SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体，以得到重组质粒，将所得产物命名为pDCM2-PSPL7_trpE(S38R)。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

将上述制备的pDCM2-PSPL7_trpE(S38R)载体经由电穿孔引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，得到其中trpE的启动子被染色体上更强的SPL7启动子替换，和TrpE的第38位氨基酸丝氨酸被精氨酸替换的菌株。通过基因组测序和PCR使用能够扩增插入基因的同源重组的上游和下游区域的SEQ ID NO:44和45确认相应的遗传操作，将所得产物命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)。

3-5-2.引入一个拷贝的tkt基因的L-色氨酸生产菌株的构建

色氨酸生产是经由芳香族氨基酸代谢途径发生的，该代谢途径始于磷酸烯醇丙酮酸盐和赤藓糖4-磷酸之间的缩合反应。因此，这两种前体的充足供应对于增强色氨酸的生产是必需的，而tkt基因的过表达对于已知是相对缺乏的赤藓糖4-磷酸的充足供应是必不可少的。因此，使用实施例2-2中制备的pDCM2-ΔaroP、pDCM2-ΔaroP::Pm4tkt_tkt和pDCM2-ΔaroP::Pntkt_tkt制备L-色氨酸生产菌株。

将上述三种载体引入实施例3-5-1中制备的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)菌株，在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，得到了其中缺失了aroP，或在染色体上的aroP位置插入了Pntkt_tkt基因和Pm4tkt_tkt基因的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO:46和47的PCR确认了相应的遗传操作，并且将由此制备的菌株分别命名为ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP、ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pntkt_tkt和ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pm4tkt_tkt。

3-5-3.引入一个拷贝的tkt基因的菌株的L-色氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)和在实施例3-5-2中制备的ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP、ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pntkt_tkt和ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pm4tkt_tkt，以下列方式培养菌株并进行分析。

<种子培养基(pH 7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

葡萄糖30g，(NH₄)₂SO₄ 15g，MgSO₄ 7H₂O 1.2g，KH₂PO4 1g，酵母提取物5g，生物素900μg，硫胺素-HCl 4500μg，泛酸钙4500μg，CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)。

培养完成后，使用HPLC测量L-色氨酸的生产。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)、ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP、ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pntkt_tkt和ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的L-色氨酸浓度和浓度增加率如下表7所示。

[表7]

如表7所示，确认了与对照ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP菌株相比，引入一个拷贝的Pm4tkt_tkt基因的ATCC13869::PSPL7_trpE(S38R)ΔaroP::Pm4tkt_tkt菌株中L-色氨酸浓度增加了62.50％。

实施例3-6.酪氨酸生产能力的评价

3-6-1.L-酪氨酸生产菌株的构建

为了确认Pm4tkt启动子变体的效果，使用L-酪氨酸生产菌株CM06-0010(韩国专利号10-2134418，保藏在韩国微生物保藏中心，登录号为KCCM12487P)作为亲本菌株进行转化。

具体地，将实施例2-3中制备的pDCM2-ΔPn::Pm4tkt_tkt载体经由电穿孔引入CM06-0010菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，得到了其中tkt天然启动子(Pntkt)被插入染色体上的DNA片段替换为tkt启动子变体的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO:48和49的PCR确认相应的遗传操作，将由此制备的菌株命名为CM06-0010ΔPn::Pm4tkt_tkt。

3-6-2.引入tkt启动子变体的菌株的L-酪氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌CM06-0010和实施例3-6-1中制备的CM06-0010ΔPn::Pm4tkt_tkt的L-酪氨酸生产能力，以下列方式培养菌株并进行分析。

<种子培养基(pH 7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

葡萄糖30g，(NH₄)₂SO₄ 15g，MgSO₄ 7H₂O 1.2g，KH₂PO₄ 1g，酵母提取物5g，生物素900μg，硫胺素-HCl 4500μg，泛酸钙4500μg，CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)

培养完成后，使用HPLC测量L-酪氨酸的生产。CM06-0010和CM06-0010ΔPn::Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的L-酪氨酸浓度和浓度增加率如下表8所示。

[表8]

菌株名称	L-酪氨酸浓度(g/L)	L-酪氨酸浓度增加率(％)
			CM06-0010	2.01	-
CM06-0010ΔPn::Pm4tkt_tkt	2.86	42.29％

如表8所示，确认了与对照CM06-0010菌株相比，其中用Pm4tkt变体替换tkt基因的天然启动子的CM06-0010ΔPn::Pm4tkt_tkt菌株中L-酪氨酸浓度增加了42.29％。

实施例3-7.苯丙氨酸生产能力的评价

3-7-1.L-苯丙氨酸生产菌株的构建

为了确认Pm4tkt启动子变体的效果，首先，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株制备L-苯丙氨酸生产菌株(参见韩国专利号10-2134418)。

具体地，接受L-酪氨酸反馈调节的tyrA基因被替换为包括强gapA启动子的大肠杆菌来源的不接受反馈调节的tyrA变体。已知在大肠杆菌来源的tyrA蛋白中，当53位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸、354位的丙氨酸突变为缬氨酸时，解除反馈，并且使用这种形式的蛋白质(SEQ ID NO:50)(Appl.Microbiol.Biotechnol.75,103–110(2007))。

对于遗传操作，首先得到了其中要通过替换插入tyrA基因的tyrA基因的上游和下游区域。具体地，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，通过PCR，使用SEQID NO:51和52的引物得到tyrA基因上游区域的基因片段，使用SEQ ID NO:53和54的引物，得到tyrA基因下游区域的基因片段。另外，为了得到包含gapA启动子的大肠杆菌来源的变体tyrA基因，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，通过PCR，使用SEQ IDNO:55和56的引物，得到gapA启动子片段，基于大肠杆菌来源的变体tyrA合成DNA(SEQ IDNO:50)作为模板，通过PCR，使用SEQ ID NO:57和58的引物，得到大肠杆菌来源的变体tyrA基因片段。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、60℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装法克隆扩增的tyrA上游和下游区域、gapA启动子、大肠杆菌来源的变体tyrA基因片段和经SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体，以得到重组质粒，将所得产物命名为pDCM2-ΔtyrA::PgapA-tyrAm。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

将如此制备的pDCM2-ΔtyrA::PgapA-tyrAm载体经由电穿孔转化到野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中，然后进行二次杂交以得到其中插入包括gapA启动子的大肠杆菌来源的变体tyrA基因，同时缺失tyrA基因的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO:59和60的引物的PCR确认相应的遗传操作，将得到的菌株命名为ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAm。

通过向大肠杆菌来源的反馈调节解除变体aroG添加强启动子，增强了参与通用芳香族生物合成途径第一步的aroG基因。已知在大肠杆菌来源的aroG蛋白中，当150位的脯氨酸被亮氨酸取代时，解除反馈，并且使用了这种形式的蛋白质(SEQ ID NO:61)(Appl.Environ.Microbiol.63,761–762(1997))。

对于遗传操作，得到了将进一步插入aroG基因的上游和下游区域。具体地，使用BBD29_14470位置制备载体，该位置是在染色体上发生同源重组的谷氨酸棒状杆菌的转座酶之一。

具体地，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，通过PCR，使用SEQID NO:62和63的引物得到BBD29_14470基因上游区域的基因片段，使用SEQ ID NO:64和65的引物得到BBD29_14470基因下游区域的基因片段。另外，为了得到包含gapA启动子的大肠杆菌来源的变体aroG基因，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模版，通过PCR使用SEQ ID NO:66和67的引物得到gapA启动子片段，和基于大肠杆菌来源的反馈解除变体aroG合成DNA(SEQ ID NO:61)作为模版，通过PCR，使用SEQ ID NO:68和69的引物得到大肠杆菌来源的变体aroG基因片段。Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，在以下PCR扩增条件下进行PCR，95℃变性5分钟，随后30个循环：95℃变性30秒、60℃退火30秒和72℃聚合60秒；然后72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装法克隆扩增的BBD29_14470基因上游和下游区域、gapA启动子、大肠杆菌来源的变体aroG基因片段和经SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体，以得到重组质粒，将所得产品命名为pDCM2-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm。通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和每种基因片段，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。

将如此制备的pDCM2-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm载体经由电穿孔转化到ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAm菌株中，然后进行二次杂交以得到插入包括gapA启动子的大肠杆菌来源的反馈解除变体aroG基因的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO:70和71的引物的PCR确认相应的遗传操作，将得到的菌株命名为ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGm。

3-7-2.插入一个拷贝的tkt基因的L-苯丙氨酸生产菌株的构建

使用实施例2-2中制备的pDCM2-ΔaroP、pDCM2-ΔaroP::Pm4tkt_tkt和pDCM2-ΔaroP::Pntkt_tkt制备L-苯丙氨酸生产菌株。经由电穿孔将这三种载体引入实施例3-7-1中制备的ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGm菌株，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中得到转化的菌株。通过二次杂交，各自得到了其中缺失了aroP或在染色体上的aroP位置插入了Pntkt_tkt基因和Pm4tkt_tkt基因的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO:46和47的PCR确认相应的遗传操作，将由此制备的菌株分别命名为ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaro、ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pntkt_tkt和ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pm4tkt_tkt。

3-7-3.插入一个拷贝的tkt基因的菌株的L-苯丙氨酸生产能力的评价

为了评价用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGm和在实施例3-7-2中制备的ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP、ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pntkt_tkt和ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pm4tkt_tkt菌株的L-苯丙氨酸生产能力，以下列方式培养菌株并进行分析。

<种子培养基(pH 7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

葡萄糖30g，(NH₄)₂SO₄ 15g，MgSO₄ 7H₂O 1.2g，KH₂PO₄ 1g，酵母提取物5g，生物素900μg，硫胺素-HCl 4500μg，泛酸钙4500μg，CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)。

培养完成后，使用HPLC测量L-苯丙氨酸的生产。ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGm、ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP、ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pntkt_tkt、和ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pm4tkt_tkt菌株在培养基中的L-苯丙氨酸浓度和浓度增加率如下表9所示。

[表9]

如表9所示，确认了与对照ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP菌株相比，其中引入一个拷贝的Pm4tkt_tkt基因的ATCC13869ΔtyrA::PgapA-tyrAmΔBBD29_14470::PgapA-aroGmΔaroP::Pm4tkt_tkt菌株中L-苯丙氨酸浓度增加了39.05％。

通过以上结果，包含本申请的具有启动子活性的多核苷酸的重组微生物增加了L-赖氨酸、L-苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、L-异亮氨酸和芳香族氨基酸如L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的生产率，这在工业上是有用的。

综上所述，本申请所属领域的技术人员将能够理解，本申请可以在不改变本申请的技术概念或本质特征的情况下以其他具体形式实施。在这方面，本文所公开的实例性实施方式仅用于说明目的，不应被解释为限制本申请的范围。因此，本申请的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示。落入权利要求的含义和等效范围内的所有变化都应包含在本申请的范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型启动子及其用途

<130> OPA21347

<150> KR 10-2021-0064855

<151> 2021-05-20

<160> 71

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 启动子

<400> 1

gcttgccgaa catttttctt ttcctttcgg tttttcgaga attttcacct acaaaagccc 60

acgtcacagc tcccagactt aagattgatc acacctttga cacatttgaa ccacagttgg 120

ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg acgggtcaga ttaagcaaag 180

actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca attaacctaa gtcgtagatc 240

tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc ccggtttaac ccaggaagga 300

300

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 启动子变体

<400> 2

gcttgccgaa catttttctt ttcctttcgg tttttcgaga attttcacct acaaaagccc 60

acgtcacagc tcccagactt aagattgatc acacctttga cacatttgaa ccacagttgg 120

ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg acgggtcaga ttaagcaaag 180

actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaatgt ggtatcataa gtcgtagatc 240

tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc ccggtttaac ccaggaagga 300

300

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

ctctagaact agtggatccg cttgccgaac atttttc 37

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gttcttctcc tttactcatt ccttcctggg ttaaacc 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggtttaaccc aggaaggaat gagtaaagga gaagaac 37

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

cccccctcga ggtcgactta tttgtagagc tcatccatg 39

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gcttgccgaa catttttc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

tccttcctgg gttaaacc 18

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

tgaattcgag ctcggtaccc ccgcacccat ccagcc 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gaaaaatgtt cggcaagcaa tacggtgcaa cgtcaa 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

ttgacgttgc accgtattgc ttgccgaaca tttttc 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cagcgtcaag gtggtcaatc cttcctgggt taaacc 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ggtttaaccc aggaaggatt gaccaccttg acgctg 36

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gtcgactcta gaggatcccc ggtcgcttgg tgtccttc 38

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cggtacccgg ggatccctgg accacgatcg cc 32

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

taatttctat cggcctaagt actgtatcaa ccgtaaaccc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gggtttacgg ttgatacagt acttaggccg atagaaatta 40

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

atgcctgcag gtcgacgagg ccgtttgagc cc 32

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

ttacggttga tacagtactg cttgccgaac atttttc 37

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

cagcgtcaag gtggtcaatc cttcctgggt taaacc 36

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ggtttaaccc aggaaggatt gaccaccttg acgctg 36

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tctatcggcc taagtacttt aaccgttaat ggagtcc 37

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tgaattcgag ctcggtaccc ggagctgctg tccaacgtgg 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

gtcgactcta gaggatcccc tgggaacttg tcgacgctat 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

tgaattcgag ctcggtaccc tccaagattt tggtgctgcg 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

atctcagagg tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca cctctgagat 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gtcgactcta gaggatcccc gttcacctca gagacgatta 40

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

tcctaatgca cagaagctgg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gtggtgcagt tagggttcgc 20

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

tgaattcgag ctcggtaccc tttccacacc cgtgttaccg 40

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

atcatcgcgc tcttcctgtt ggattgtacg cagggagatt 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

aatctccctg cgtacaatcc aacaggaaga gcgcgatgat 40

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gtcgactcta gaggatcccc aaccattagc tgcagcaaca 40

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

atccaactgc agacgtcgaa 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

atctgggtgg ccttcaaagg 20

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tgaattcgag ctcggtaccc ggcgttcttg cagtcc 36

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ttgttgacat gaagcgccgg ggcacctacc gaggaa 36

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

ttcctcggta ggtgccccgg cgcttcatgt caacaa 36

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gcgcaccgaa ctcttcaaca ccgcgaggga agaaat 36

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

atttcttccc tcgcggtgtt gaagagttcg gtgcgc 36

<210> 42

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gtcgactcta gaggatcccc gggtacagct gcagctc 37

<210> 43

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE(S38R) 启动子 seq.

<400> 43

ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60

caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120

atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180

gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagcaatt 240

cctgctacaa ttgaaaacgt gcaaaagcat agattattgg aggagatcaa aacaatgagc 300

acgaatcccc atgttttctc cctagatgtc cgctatcacg aggatgcttc tgcgttgttt 360

gcccacttgg gtggcacaac cgcagatgat gcagccctgt tggaacgcgc tgatatcacc 420

accaagaatg gtatttcttc cctcgcggtg 450

<210> 44

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ggcagagcat catacc 16

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

ggcatcagtg cgcatatc 18

<210> 46

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ctggaccacg atcgcc 16

<210> 47

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gaggccgttt gagccc 16

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

ggagctgctg tccaacgtgg 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

tgggaacttg tcgacgctat 20

<210> 50

<211> 1122

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> tyrA 基因

<400> 50

atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60

aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120

ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180

gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240

gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300

gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360

tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420

gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480

aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540

ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600

ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660

gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720

agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780

tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840

tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900

cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960

tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020

gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080

agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36

<210> 52

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36

<210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36

<210> 55

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36

<210> 56

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36

<210> 58

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36

<210> 59

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

cgcagcgagc gaaccg 16

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

gttcgaatcc ctccgggc 18

<210> 61

<211> 1053

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> aroG 基因

<400> 61

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 62

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

ttcgagctcg gtaccccccg gcggtatcga ggtagt 36

<210> 63

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

ctcggtcgtt tttaggcctc ttaatcaccc gcggggaccc 40

<210> 64

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

taaaagcgcg tcgcgggtaa aaacttgtcc cgagggtgag 40

<210> 65

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

actctagagg atcccctatc agtcacttcc ctgaga 36

<210> 66

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

gggtccccgc gggtgattaa gaggcctaaa aacgaccgag 40

<210> 67

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

gttctgataa ttcatgttgt gtctcctcta aagat 35

<210> 68

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

ctttagagga gacacaacat gaattatcag aacgacga 38

<210> 69

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

ctcaccctcg ggacaagttt ttacccgcga cgcgctttta 40

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

ggtaccggca ggtacc 16

<210> 71

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

caagggggtc caatcc 16

Claims

1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中218、219、220、221、222、225和227位的核苷酸被其他核苷酸取代。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中用胸腺嘧啶(T)取代218位的核苷酸胞嘧啶(C)、用鸟嘌呤(G)取代219位的核苷酸胞嘧啶(C)、用胸腺嘧啶(T)取代220位的核苷酸腺嘌呤(A)、用鸟嘌呤(G)取代221位的核苷酸腺嘌呤(A)、用鸟嘌呤(G)取代取代222位的核苷酸胸腺嘧啶(T)、用胸腺嘧啶(T)取代225位的核苷酸腺嘌呤(A)，以及用腺嘌呤(A)取代227位的核苷酸胞嘧啶(C)。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与编码靶蛋白的基因可操作地连接。

5.基因表达盒，其包含：根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的基因表达盒，其中所述靶蛋白是转酮醇酶。

7.宿主细胞，其包含：根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的编码靶蛋白的基因。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述靶蛋白是转酮醇酶。

9.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是棒状杆菌属的微生物。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。

11.一种生产目标材料的方法，其包括：在培养基中培养权利要求7所述的宿主细胞；和从培养基中回收所述目标材料。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标材料是氨基酸。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标材料是选自赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰高丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸中的至少一种。