BRPI0806252B1 - molécula de ácido nucléico de promotor, vetor recombinante, célula de hospedeiro e método de expressão de gene alvo - Google Patents

Abstract

molécula de ácido nucléico de promotor, vetor recombinante, célula de hospedeiro e método de expressão de gene alvo. são proporcionados uma molécula inovativa de ácido nucléico de promotor que tem uma sequência de nucleotideo de seq id no: 1 ou 2 derivada de corynebacterium glutamicum, um vetor recombinante que compreende o promotor, uma célula de hospedeiro trans- formada com o vetor e um método de expressar genes de interesse usando a célula de hospedeiro.

Description

“Molécula de Ácido Nucléico de Promotor, Vetor Recombinante, Célula de Hospedeiro e Método de Expressão de Gene Alvo” Relatório Descritivo Campo Técnico A presente invenção relaciona-se com uma inovativa molécula de ácido nucléico de promotor derivado de Corynebacterium gluta-micum, com um vetor recombinante que compreende o promotor, com uma célula de hospedeiro transformada com o vetor recombinante e a um método de expressar um gene alvo usando a célula de hospedeiro. Técnica Antecedente A bactéria corineiforme tem sido extensamente usada para produzir substâncias químicas que têm várias aplicações em indústrias de alimentação animal, de produtos farmacêuticos, de alimentos e semelhantes, incluindo L-lisina, L-treonina e vários ácidos nucléicos. A fim de desenvolver linhagens de elevada produção dessa bactéria corineiforme usando engenharia genética e técnicas de engenharia metabólica, a expressão de genes envolvidos em vários trajetos metabó-licos em bactéria corineiforme precisa ser seletivamente regulada e, são exigidos deste modo, promotores úteis para estas regulações de gene.

Os métodos convencionais de isolar promotores incluem: (1) um método de usar vetor de sonda de promotor clonando aleatoriamente fragmentos de DNA genômicos a montante de um gene repórter expressado apenas quando um fragmento clonado contiver atividade de promotor; (2) um método de isolar genes e seus promotores de uma biblioteca de gene usando hibridação baseada em sonda de gene específico; e (3) uma hibridação diferencial de um banco de gene usando uma sonda de cDNA induzível e uma sonda de cDNA não induzível.

Na expressão de genes em bactéria corineiforme, os genes são geralmente expressos sob seu controle de promotores originais (Vasicova, P., e colaboradores, J. Bacteriol., 181, 6188-6191, (1999), etc.). Contudo, estruturas típicas de sequências de promotor para expressões de gene em bactéria corineiforme têm sido desconhecidas diferentemente de outros microorganismos industriais tais como Esche-richía coli, Bacilo subtilis e similares. Deste modo, os promotores para uso em bactéria corineiforme foram desenvolvidos eliminando-se uma região de promotor de um gene associado com resistência a antibióticos, como o cloranfenicol, introduzindo no sítio do promotor um fragmento de DNA cromossômico isolado da bactéria corineiforme com digestão de restrição apropriada, transformando a bactéria corineiforme com as moléculas de DNA resultantes e avaliando a resistência a antibiótico de linhagens obtidas (Hkmanns, B.J. e colaboradores, Gene, 102, 93-98, (1991); Patek, M., e colaboradores, Microbiology, 142, 1297-1309, (1996)). Todavia,as sequências de promotor convencionalmente desenvolvidas ainda precisam ser melhoradas com respeito à seletividade de expressão de gene, à eficiência de expressão de genes etc. Nós desenvolvemos uma inovativa molécula de ácido nu-cléico de promotor derivada de Corynebacterium glutamicum por meio da pesquisa e ampliação de regiões de promotor putativo por reação de cadeia de polimerase (PCR), pela introdução do promotor putativo no sítio de iniciação de gene lysC carente de um promotor e pela identificação de variações em atividade de lysC através da produção de lisina para selecionar promotores eficientes.

Revelação da Invenção Problema Técnico A presente invenção proporciona uma inovativa molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebactenum glutamicum. A presente invenção também proporciona um vetor recom- binante que compreende uma inovativa molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacterium glutamicum. A presente invenção também proporciona uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que compreende uma inovativa molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacterium glutamicum. A presente invenção também proporciona um método de expressar um gene alvo usando uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que compreende uma inovativa molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacterium glutamicum.

Solução Técnica De acordo com um aspecto da presente invenção, nela é proporcionada uma molécula de ácido nucléico de promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2. A sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucléico de promotor de acordo com a presente invenção pode ser modificada para um certo grau por uma das várias técnicas recentemente desenvolvidas, como a evolução dirigida ou mutagênese direcionada para um sítio. Aqueles qualificados na técnica prontamente entenderão que uma sequência de nucleotídeo que tem homologia de 70% ou mais com a sequência do promotor da presente invenção é um equivalente para o promotor da presente invenção, desde que ela retenha a atividade de promotor para expressar um gene alvo.

Deste modo, a molécula de ácido nucléico de promotor de acordo com a presente invenção pode incluir sequências de nucleotídeo que têm homologia de 70% ou mais com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 e pode ser usada como promotor. O termo “homologia” usado aqui indica um grau de identi- dade de sequência com a sequência de ácido nucléico tipo selvagem. O promotor da presente invenção pode incluir promotores que têm uma sequência de DNA 75% ou superior, preferencialmente 85% ou superior, com maior preferência 90% ou superior e de maior preferência 95% ou superior, idêntica à sequência de nucleotídeo do inovativo promotor da presente invenção. A homologia pode ser comparada a olhos nus ou usando um software disponível comercialmente. De acordo com o programa de software disponível comercialmente, a homologia entre duas ou mais sequências pode ser calculada como uma porcentagem (%) e a homologia (%) entre sequências adjacentes pode ser calculada.

Além disso, a molécula de ácido nucléico de promotor da presente invenção pode incluir moléculas de ácido nucléico de promotor derivadas de Corynebacteúum glutamicum, selecionadas do grupo que consiste em promotores que compreendem sequências de nucleotídeos complementares às sequências de nucleotídeos descritas acima. O termo “complementar” usado aqui indica que a hibrida-ção ou pareamento de bases é possível entre nucleotídeos ou ácidos nucléicos, por exemplo, entre as duas fitas de uma molécula de DNA de fita dupla ou entre um primer (iniciador) de oligonucleotídeo e um sítio de ligação de púmer de um gabarito de ácido nucléico de fita única para ser sequenciado ou ampliado.

Além disso, a molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacteúum glutamicum da presente invenção inclui um equivalente funcional para a molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacteúum glutamicum. O equivalente funcional para o promotor da presente invenção que inclui fragmento funcional do mesmo pode incluir variantes que tem pelo menos substituições, deleções, inserções de uma base ou combinações das mesmas. A molécula de ácido nucléico de promotor de Corynebacteúum glutamicum da presente invenção é um promotor derivado de bacté- ria corineiforme e de preferência eficientemente usado como promotor para expressões de genes de interesse em células procarióticas, particularmente, a Escherichia coli e a bactéria corineiforme. O termo “promotor” usado aqui indica uma região de DNA para a qual uma RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de gene, localizada a montante do sítio de iniciação de transcrição de mRNA, para a direção 5’. O promotor da presente invenção que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 da presente invenção pode ser promotores para o gene NCgll504 (SEQ ID NO: 11) e o gene NCgll305 (SEQ ID NO: 12) selecionados pela análise da quantidade de expressões de gene de cerca de 3000 genes do Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Aqui, o ‘gene que tem uma sequência de nucleotídeo NC-gll504’ e o ‘gene que tem uma sequência de nucleotídeo NCgll305’ referem-se não só a genes que têm sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 11 e 12, respectivamente, derivados de linhagens de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, mas também a genes que expressam produtos substancialmente idênticos àqueles expressos pelo NCgll504 ou NCgll305 em microorganismos que pertencem ao gênero Corynebacterium. Os termos ‘gene de NCgll504’ e ‘gene de NCgll305’, referem-se, respectivamente, ao ‘gene que tem uma sequência de nucleotídeo NCgll504’ e ao ‘gene que tem uma sequência de nucleotídeo NCgll305’. O termo ‘substancialmente idêntico’ usado aqui indica atividades e mecanismos de regulação. O gene que tem a sequência de nucleotídeo NCgll504 pode ser um gene que tem sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 e o gene que tem a sequência de nucleotídeo NCgll305 pode ser um gene que tem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12. A molécula de ácido nucléico de promotor de acordo com a presente invenção pode ser isolada ou preparada usando uma técnica de biologia molecular padrão, por exemplo, por PCR que usa sequências de primer apropriadas. Pode também ser preparada por uma técnica de síntese padrão que usa um sintetizador de DNA automatizado. A presente invenção também proporciona um vetor recom-binante que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 e uma sequência de codificação de um gene alvo que está operavelmente ligado ao promotor. O termo Vetor’ usado aqui indica uma construção de DNA que compreende uma sequência de DNA que está operavelmente ligada a uma sequência de controle apropriada para expressão numas células de hospedeiro apropriadas. A sequência de controle apropriada inclui um promotor para dirigir a transcrição, uma sequência de operador arbitrário para regular tal transcrição, uma sequência que codifica um sítio apropriado de ligação de ribossomo a mRNA e uma sequência para transcrição e translação. O vetor pode ser um plasmídio, uma partícula de fago ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Quando um vetor transforma um hospedeiro compatível, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma de hospedeiro, ou pode ser integrado no genoma do hospedeiro em alguns casos. O termo ‘operavelmente ligado’ usado aqui indica que um gene a ser expresso está funcionalmente ligado às suas sequências de controles de forma que o gene é corretamente expresso.

Um vetor recombinante que compreende uma molécula de ácido nucléico de promotor de Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção pode estar operavelmente ligado aos genes que codificam várias proteínas para produzir, de forma recombinante, proteínas alvo. Os genes alvo a serem expressos usando o vetor da presente invenção podem ser a quinase do aspartato que codifica lysC, a redutase do dihidrodipicolinato que codifica dapB ou semelhantes, mas não são limitados aos mesmos.

Os genes alvos de acordo com a presente invenção podem ser a quinase de aspartato que codifica o lysC. A quinase de aspartato que codifica o gene lysC pode ter uma sequência de base de SEQ ID NO: 13 (Ikeda e colaboradores, Appl Mcrobiol Biotechnol. 2002 Feb; 58(2):217-23 A novel methodology employing Corynébacterium glu-tamicum genome Information to generate a new L-lysine-producing mutant). O vetor recombinante de acordo com a presente invenção pode ser o pDZ-NCgll504-lysC que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 operavelmente ligada à sequência de codificação de lysC (SEQ ID NO: 13) que é o gene alvo. O vetor recombinante pode também ser o pDZ-NCgll305-lysC que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 operavelmente ligada à sequência de codificação de lysC (SEQ ID NO: 13) que é o gene alvo. A presente invenção também proporciona uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2. A célula de hospedeiro, por exemplo, células procarióticas, de preferência Escherichia coli e bactéria corineiforme e, com maior preferência, a bactéria corineiforme, pode ser transformada com o vetor recombinante preparado de tal forma que a molécula de ácido nucléico de promotor de Corynebacterium glutamicum é operavelmente ligada ao gene que codifica uma proteína alvo a fim de expressar a proteína alvo. A ‘bactéria corineiforme’ pode ser uma bactéria que pertença ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Brevibacterium, em particular Corynebacterium glutamicum e, mais em particular, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. A bactéria corineiforme da presente invenção pode incluir outras linhagens do gênero Corynebacterium, Corynebacterium tkermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e um mutante dos mesmos que produz ácido L-amino, ou Corynebacterium glutamicum KFCC 10881, Corynebacterium glutamicum KFCC 11001 e semelhantes. O termo ‘transformação’ usado aqui indica a introdução de DNA num hospedeiro de tal modo que ele pode ser replicado ou como um elemento extracromossômico ou por integração cromossômica. A célula de hospedeiro pode ser uma Corynebacterium transformada com um vetor recombinante que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e lysC (SEQ ID NO: 13) operavelmente ligados ao promotor. A célula de hospedeiro pode ser preferencialmente Corynebacterium glutamicum (Depósito No. KCCM 10831). A célula de hospedeiro pode ser também uma Corynebacterium transformada com um vetor recombinante que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 e lysC (SEQ ID NO: 13) operavelmente ligados ao promotor. A célula de hospedeiro pode ser de preferência Corynebacterium glutamicum (Depósito No. KCCM 10830). A presente invenção também proporciona um método de expressar um gene alvo, que compreende propagar artificialmente uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que tem uma molécula de ácido nucléico de promotor derivada de Corynebacterium glutamicum. O gene alvo que está operavelmente ligado ao promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 pode ser proteínas de codificação de genes associadas com a síntese do produtos finais como a lisina e a treonina. O termo ‘que expressa um gene alvo’ usado aqui indica que produz o produto final de um trajeto sintético no qual a proteína codificada pelo gene alvo é envolvida. Deste modo, o método de expressar um gene alvo pode ser um método de produzir o produto final de um trajeto sintético no qual uma proteína codificada pelo gene alvo é envolvida, por propagar artificialmente uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que inclui o gene alvo. O produto final pode ser lisina. Isto é, a presente invenção pode proporcionar um método de produzir lisina que compreende propagar artificialmente uma célula de hospedeiro transformada com um vetor recombinante que compreende lysC que codifica uma proteína envolvida em síntese de lisina e um promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 operavelmente ligada ao gene.

No método de síntese de lisina de acordo com a presente invenção, a célula de hospedeiro pode ser Corynebacterium glutamicum KCCM 10831 ou Coryneform Bacterium KCCM 10830 transformada com um vetor recombinante que inclui o promotor que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 que é operavelmente ligada ao gene alvo, o lysC de SEQ ID NO: 13. A propagação artificial das células de hospedeiro transformadas (transformantes) pode ser realizada de acordo com os métodos comumente usados na técnica. Os métodos de propagação artificial conhecidos são revelados por Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Enfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); e Storhas (Bioreaktoren und periphere Enrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Os meios de cultura usados para a propagação artificial precisam encontrar requisitos para o crescimento de linhagens particulares numa maneira apropriada. Os meios de cultura para linhagens de Corynebacterium são revelados, por exemplo, no Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology. Washington D. C, EUA, 1981. Uma fonte de carbono para os meios de cultura pode ser carboidrato como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleo e gordura como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco, um ácido graxo tal como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolênico, um álcool como glicerol e etanol e um ácido orgânico como ácido acético. A fonte de carbono pode ser usada só ou numa mistura. Uma fonte de nitrogênio pode também ser peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, solução saturada de milho, alimentos de soja e ureia ou um composto inorgânico, por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. A fonte de nitrogênio pode ser usada só ou numa mistura. Uma fonte fosforosa pode ser fosfato dihidrogênio de potássio, fosfato hidrogênio dipotássico ou um sal de sódio dos mesmos. Além disso, os meios de cultura deviam conter um sal de metal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, essencial para o crescimento. Finalmente, os meios de cultura podem incluir, além disso, substâncias essenciais para o crescimento como ácidos de amino e vitaminas. Além disso, precursores apropriados podem também ser adicionados aos meios de cultura. Aqueles componentes de meios de cultura podem ser adicionados aos meios de cultura num lote ou em base contínua durante a propagação artificial. O pH dos meios de cultura pode ser regulado usando um composto básico como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amoníaco ou um composto de ácido tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico numa maneira apropriada. Além disso, a formação de espuma pode ser impedida pelo uso de um agente anti-espumante como o éster de poliglicol de ácido graxo. O oxigênio ou um gás que contém oxigênio, por exemplo, ar, pode ser introduzido em meios de cultura, a fim de manter um estado arejado. A temperatura dos meios de cultura pode estar na faixa de 20 a 45°C e preferencialmente de 25 a 40°C. A propagação artificial é continuada até que a quantidade de substância alvo produzida alcance seu máximo. Em geral, a cultura é realizada por 10 a 160 horas. A presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos exemplos seguintes. Os exemplos seguintes são apenas para propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o escopo da invenção.

Efeitos Vantajosos De acordo com a presente invenção, é proporcionada uma inovativa sequência de ácido nucléico de promotor derivada de Coryne-bacterium glutamicum para uso em expressão eficiente de um gene de interesse.

Descrição dos Desenhos Os objetos acima e outros, as características e outras vantagens da presente invenção serão mais claramente entendidos a partir da descrição detalhada seguinte tomada em conjunto com os desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 mostra esquematicamente um processo de preparar vetores para explorar a atividade de promotor de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Modo da Invenção Exemplo 1 Preparação de Vetor Recombinante que Compreende Sequências de Promotor Inovativas 1. Seleção de Genes Candidatos para o Promotor Inovativo Derivado de Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi cultivada num fermentador de 5L e foram coletadas células. Os níveis de expressão de mRNA de cerca de 3.000 genes de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foram determinados usando chips de DNA de genoma (chips cDNA, Genanictree, Inc., Coréia). Os genes de NCgll504 e de NCgll305 que respondem por 0,88% e 0,43% baseado na expressão de genoma total, respectivamente, foram selecionados como genes candidatos para um promotor inovativo da presente invenção. 2. Amplificação de fragmentos de DNA de regiões de promotor putativo As sequências de nucleotídeo de genoma de Corynebacterium glutamicum já têm sido completamente determinadas e são bem conhecidas [Appl. Mcrobiol. Biotechnol, 62(2-3), 99-109(2003): GenBank Accession No. NC_003450). As informações de sequências de proteínas (NCgll504 e NCgll305) foram obtidas do banco de dados do National Institutes of Health (NIH) GenBank (E.U.A.). A fim de ampliar as regiões de promotor putativo (SEQ ID NO: 1 - região de promotor de NCgll504, SEQ ID NO: 2 - região de promotor de NCgll305) localizadas a montante do frame (moldura) de leitura aberta (ORF) de cada gene, os primers 1-4, incluindo sítios de restrição de EcoRV/BamHI e Ndel, foram sintetizados com base nas sequências de nucleotídeo reportadas. As regiões de promotores putativos de genes NCgll504 e NCgll305 foram ampliadas em PCR usando DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como gabarito, respectivamente com os primers 1 e 2 (SEQ ID NOS: 3 e 4) e os primers 3 e 4 (SEQ ID NOS: 5 e 6) [Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] com 30 ciclos de desnaturação a 94°C, recozendo a 55°C por 1 minuto e de polimerização a 72°C por 30 segundos. 3. Preparação de Vetor Recombinante para Integração Cro-mossômica para Determinar a Atividade de Promotor A fim de determinar a atividade de regiões de promotor pu-tativo dos NCgll504 e NCgll305 obtidos em cromossomos de Corynebac-terium, usamos o vetor pDZ para integração cromossômica (Pedido de Patente Coreano No. 1-2006-089672) desenvolvido por Cheiljedang Corporation, usando pACYC177 (New England Biolab, GenBank acceti-on # X06402), um vetor de clonagem para B. coli como um vetor básico. A fim de inserir genes em cromossomo de Corynebacterium, foi inserido um promotor inovativo que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 1 ou 2 antes do sítio de iniciação de lysC para obter vetores pDZ-Ncgll504-lysC ou pDZ-Ncgll305-lysC, respectivamente.

Um vetor recombinante em que foram inseridos sítios de promotor putativo de NCgll504 e NCgll305 em gene lysC foi preparado da seguinte maneira. A fim de ampliar o lysC de SEQ ID NO: 13, o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi usado como gabarito e foi realizado PCR usando os primers 5 e 6 (SEQ ID NOS: 7 e 8) e os primers 7 e 8 (SEQ ID NRES: 9 e 10) (condições de PCR: 30 ciclos de desnaturação a 94°C, recozendo a 55°C por 1 minuto e de alongamento a 72°C por 30 segundos). Os fragmentos de LysC ampliados usando Kit de Clonagem TOPO (Invitrogen) foram digeridos com EcoRV e Klenau, os dois fragmentos com extremidades cegas foram ligados e clonados em pCR2.1-lysC. Então, os sítios de promotor de pCR.2.1-lysC e NCgll504 ou NCgll305 foram clivados usando EcoRV e Ndel e foram inseridos promotores inovativos de SEQ ID NO: 1 ou 2 nos sítios de restrição usando uma DNA ligase. Então, os fragmentos clonados foram transferidos para o vetor pDZ para preparar vetores pDZ-NCgll504-lysC e pDZ-NCgll305-lysC, conforme mostrado na Figura 1.

Exemplo 2 Transformação com Cepas Recombinantes que Incluem Inovativas Sequências de Promotor Corynebacterium glutamicum KFCC 10881, uma linhagem que produz L-lisina foi transformada usando o vetor recombinante preparado pDZ-NCgll504-lysC ou pDZ- NCgll305-lysC por pulso elétrico conforme revelado em Appl. Mcrobiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545. As linhagens transformadas foram selecionadas em meios seletivos que incluem 25 mg/L de canamicina (10 g/L de extrato de carne de boi, 10 g/L de peptona, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio, 3,7 g/L de Infusão de Coração e Cérebro (BHI) e 9,1 g/L de sorbitol) na qual o promotor inovativo no reator é integrado no cromossomo por recombinação homóloga. A inserção do vetor foi identificada quando as linhagens que se tornaram azul num meio sólido incluindo X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-6-D-galactopiranosídeo). As linhagens em que o vetor é inserto no cromossomo através do primeiro crossover (cruzamento) foram propagadas artificialmente pela agitação num meio de cultura de nutriente a 30°C por 8 horas, diluídas para IO 4 a 1010, respectivamente, e laminadas sobre um meio sólido que inclui X-gal. A maioria das colônias mostrou a cor azul e as linhagens em que as sequências de vetor inseridas foram removidas pelo segundo crossover foram filtradas pela seleção de colônias brancas. Usando a suscetibili-dade à canamicina, as colônias selecionadas foram identificadas e finalmente confirmadas por sequenciação. A linhagem em que o promotor de gene lysC foi reposto por Ncgll504 foi chamada como CAO 1-0037 e as linhagens em que o promotor de gene lysC foi reposto por Ncgll305 foram chamadas como CA01-0036 e foram depositadas, respectivamente, como KCCM 10831 e KCCM 10830 junto ao Korean Culture Center of Microorganisms, em 28 de dezembro de 2006.

Exemplo 3 Atividade de Sequência de Promotor em Corynebacterium As linhagens transformadas foram cultivadas para analisar a atividade de sequências de promotor como se segue.

Cada linhagem de Corynebacterium glutamicum transformada foi inoculada numa razão de 1:20 num frasco comer-baffle de 250 ml contendo 25 ml de um meio de cultura [20 g de glicose, 5 g sulfato de amônio, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5g de MgS047H20, 150 pg de biotina, 1,5 mg de cloreto de tiamina, 3 mg de pantotenato de cálcio, 3 mg de nicotinamida (baseada em 1 L de água destilada), pH 7,2] e foi propagada artificialmente a 30°C enquanto se agitava a 200 rpm até a cultura ter alcançado a fase de crescimento exponencial média (ODõoo =10). Quando a propagação artificial foi terminada, as células foram coletadas por centrifugação, foram suspensas em tampão de 100 mM Tris-HCl (pH 7,0), foram dissolvidas por lisina por sonicação e, então, foram centrifugadas a alta velocidade para obter um sobrenadante. 1 mg de proteínas do sobrena-dante foi usada para medir a atividade de enzima lysC (Black 85 Wright( 1955b)). Como resultado, a mudança em atividade de lysC foi confirmada em linhagens em que o promotor para lysC foi reposto por NC-gll504 ou NCgll305, como mostrado na Tabela seguinte.

Tabela 1 Comparação da Atividade de Promotor por Adição de Lisina REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1 - Célula de Hospedeiro Transforma por Vetor Recombinante, caracterizada por que tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 2 operavelmente ligado a uma sequência de codificação de um gene alvo que é do gênero Corynebacterium.

2 - Célula de Hospedeiro, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que é Corynebacterium glutamicum KCCM 10831, transformada com um vetor recombinante que compreende um promotor designado como SEQ ID NO: 1 operavelmente ligado a uma sequência de codificação de gene lysC.

3 - Célula de Hospedeiro de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que é Corynebacterium glutamicum KCCM 10830, transformada com um vetor recombinante que compreende um promotor designado como SEQ ID NO: 2 operavelmente ligado a uma sequência de codificação de gene lysC.

4 - Método de Expressão de Gene Alvo, caracterizado por que o método compreende cultivar uma célula de hospedeiro segundo qualquer uma das Reivindicações 1, 2 e 3.

5 - Método de expressão de Gene Alvo, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que nele o gene alvo é o gene lysC.