CN112877352B - 一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用 - Google Patents

一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。该系统包括：阻遏蛋白CymR基因、启动子、操纵基因CuO及强启动子；启动子控制阻遏蛋白CymR基因，强启动子控制操纵基因CuO。所述阻遏蛋白CymR基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述操纵基因CuO的如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的质粒载体包含上述cumate诱导系统。本发明构建的诱导系统严格受诱导剂cumate(四‑异丙基苯甲酸)的调控，实现了cumate对目的基因表达的调控，并且可通过诱导剂cumate的浓度及诱导时间对目的蛋白的表达量进行控制。

Description

一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统 构建的质粒载体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是一种革兰氏阳性细菌，最早是在1957年由日本学者从土壤中分离得到，因其可以分泌大量的L-谷氨酸而得名。谷氨酸棒杆菌是微生物发酵工业生产氨基酸的经典菌种，具有高产谷氨酸、生长迅速等优点，可以生产氨基酸、外源蛋白和化合物，涉及食品、医药和化工等领域。
Cumate诱导系统来源于恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)，目前这个系统已经开发用于基因的表达，并且应用到多种生物体，包括哺乳动物细胞、大肠杆菌、链霉菌、以及革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌。除此之外，Cumate诱导系统还用于一些重组酶的表达，如Cre重组酶。Cumate诱导系统主要由四部分组成，包括阻遏蛋白CymR、操纵基因CuO、控制CymR基因表达的启动子和控制CuO基因表达的强启动子。未诱导时，阻遏蛋白CymR与操作基因CuO结合，阻止目的基因的转录。加入cumate诱导后，cumate与CymR结合，使其与操纵基因分离，诱导目的基因转录。
目前，在谷氨酸棒状杆菌中常用的诱导型启动子是来自大肠杆菌的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)诱导的Ptac启动子和L-阿拉伯糖诱导的PBAD启动子，还有无水四环素诱导的Ptet启动子。IPTG诱导的Ptac启动子在谷氨酸棒状杆菌中泄露表达严重，诱导剂IPTG具有毒性、会影响菌的生长，且IPTG价格昂贵，不适用于工业生产。PBAD启动子的诱导剂是L-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖是一种碳源，会受到宿主碳代谢的调节和潜在的碳源利用的影响，从而被消耗。而无水四环素诱导的Ptet启动子，诱导后表达量太低(Zhang Y,Shang X,Lai S,et al.Development and application of anarabinose-inducible expression system by facilitating inducer uptake inCorynebacterium glutamicum.[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(16):5831-5838.)。
优良菌株的获得需要进行代谢工程、基因工程等改造，调控严格的诱导系统对酶和外源基因、蛋白的表达是十分重要的，然而谷氨酸棒状杆菌的诱导型启动子较少且都存在一定程度的泄露表达。严格控制的诱导系统具有两个特点：1.在诱导前受严格的调控，不表达目标基因；2.诱导后，转录水平高，可以高效地启动外源基因的转录。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。
本发明可为谷氨酸棒状杆菌提供一种新的严格控制的表达系统，在代谢工程、合成生物学研究和工业蛋白生产中可应用于控制基因的表达。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统，包括：阻遏蛋白CymR基因、启动子、操纵基因CuO及强启动子；
所述阻遏蛋白CymR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述操纵基因CuO的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述启动子为谷氨酸棒状杆菌启动子Phom和谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf中的一种；
所述谷氨酸棒状杆菌启动子Phom的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，所述强启动子为强启动子Ptac；所述强启动子Ptac的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
本发明提供一种包含上述的适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体。本发明提供的质粒载体可通过大肠杆菌扩增后，经过纯化，再转化入谷氨酸棒状杆菌中。
本发明提供的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体中，还包含控制目的基因表达的核糖体结合位点RBS1和表达阻遏蛋白CymR的核糖体结合位点RBS2；所述控制目的基因表达的核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述表达阻遏蛋白CymR的核糖体结合位点RBS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步地，所述目的基因为谷氨酸棒状杆菌的外源基因。
优选地，所述谷氨酸棒状杆菌的外源基因包括绿色荧光蛋白基因sfGFP。
进一步地，所述质粒载体为能在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中复制的温敏型载体pJYS1Ptac。
优选地，本发明提供的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体有如下四种。
第一种质粒载体包含阻遏蛋白CymR基因、谷氨酸棒状杆菌启动子Phom、操纵基因CuO、强启动子Ptac；所述谷氨酸棒状杆菌启动子Phom控制阻遏蛋白CymR的表达，强启动子Ptac控制操纵基因CuO的表达两个启动子之间的间隔序列不是操纵基因CuO；
第二种质粒载体包含阻遏蛋白CymR基因、谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf、操纵基因CuO、强启动子Ptac；所述谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf控制阻遏蛋白CymR的表达，强启动子Ptac控制操纵基因CuO的表达，两个启动子之间的间隔序列不是操纵基因CuO；
第三种质粒载体包含阻遏蛋白CymR基因、谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf、两个操纵基因CuO、强启动子Ptac；所述谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf控制阻遏蛋白CymR的表达，强启动子Ptac控制操纵基因CuO的表达，两个启动子之间的间隔序列是操纵基因CuO；
第四种质粒载体包含阻遏蛋白CymR基因、谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf、两个操纵基因CuO、两个强启动子Ptac；两个强启动子Ptac控制操纵基因CuO表达的结构为Ptac-CuO-Ptac-CuO，两个启动子之间的间隔序列不是操纵基因CuO。
所述包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体上可装载谷氨酸棒状杆菌的外源基因。
本发明提供的一种宿主细胞，含有所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体。
进一步地，所述宿主细胞为谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
本发明提供的适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统、所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体及所述的宿主细胞均能应用在基因表达调控中。该应用中，cumate诱导剂的浓度为1.56-100μM。
优选地，所述cumate诱导剂的浓度为1.56-25μM。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明的cumate诱导系统是一种严格控制的诱导系统，泄漏表达水平很低，在未添加诱导剂时，目的基因表达量很低，在添加诱导剂之后，目的基因表达量很高，克服了现常用诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)控制的Ptac启动子泄漏表达严重的缺点；
(2)本发明的cumate诱导系统可通过诱导剂cumate的浓度和诱导时间进行调节，实现对目的基因表达量的控制；
(3)含cumate诱导系统的质粒载体为温敏型的大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒，适用于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌；
(4)cumate(四-异丙基苯甲酸)是一种低廉、无毒性的诱导剂，对含质粒载体的宿主细胞无毒害作用，且在含质粒载体的宿主细胞不被消耗。
(5)本发明的cumate诱导系统可应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，用于表达有毒蛋白、Cas9蛋白或重组酶等。
附图说明
图1为实例1中菌落PCR验证质粒1-12转化入谷氨酸棒状杆菌的电泳图。
图2为实施例中质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的示意图。
图3为实施例中质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP上的cumate诱导结构示意图。
图4为实施例中质粒载体pZL071-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP上的cumate诱导结构示意图。
图5为实施例中质粒载体pZL073-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP上的cumate诱导结构示意图。
图6为实施例中质粒载体pZL074-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP上的cumate诱导结构示意图。
图7为实施例中cumate诱导系统在谷氨酸棒状杆菌中的诱导效果图，其中，“-”表示未添加诱导剂的实验组荧光强度，“+”表示添加诱导剂50μM cumate的实验组荧光强度。
图8为实施例中质粒载体pZL071中的cumate诱导系统在谷氨酸棒状杆菌中受不同诱导浓度和时间的诱导效果图。
图9为实施例中质粒载体pZL074中的cumate诱导系统在谷氨酸棒状杆菌中受不同诱导浓度和时间的诱导效果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例中CymR为所述谷氨酸棒状杆菌启动子控制表达的阻遏蛋白CymR基因的缩写，核苷酸如SEQ ID NO:1所示；
CuO为所述强启动子控制表达的操纵基因CuO的缩写，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
Phom为所述谷氨酸棒状杆菌启动子Phom的缩写，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
Ptuf为所述谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf的缩写，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
Ptac为强启动子Ptac的缩写，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述质粒载体为pJYS1Ptac质粒。所述质粒载体购自Addgene平台，型号为85545。
实例1：含诱导系统质粒载体的构建
1.含IPTG诱导启动子质粒载体构建
(1)质粒载体pZL038-Ptac的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的lac操纵基因(序列：TTGTGAGCGGATAACAA)后，插入RBS1(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，下同)基因序列，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因，构建得到所述质粒载体pZL038-Ptac，标记为质粒1。
(2)质粒载体pZL052-Ptac-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的lac操纵基因(序列：TTGTGAGCGGATAACAA)后，插入sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因，构建得到所述质粒载体pZL052-Ptac-sfGFP，标记为质粒2。
2.含cumate诱导系统质粒载体的构建
(1)质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下同)，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP，标记为质粒3。构建的质粒3可参照图2和图3所示。图2为实施例中质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的示意图。图3为实施例中质粒载体pZL070-Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的cumate诱导结构示意图。其他质粒载体的结构也可参照图2所示，其他质粒与质粒3唯一不同之处在于所加载的基因不同。
图中的pSC101 ori为大肠杆菌的复制起始位点；
Rep 101：RepA蛋白，需要pSC101复制起始位点；
pBL-ts(ori)；谷氨酸棒状杆菌的温度敏感型pBL1复制子；
NeoR/Kan：卡那霉素抗性基因；
rrnB T1 terminator：大肠杆菌rrnB基因的转录终止子T1；
rrnB T2 terminator：大肠杆菌rrnB基因的转录终止子T2；
CymR：来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida F1)的cumate诱导系统中的阻遏蛋白CymR基因；
CuO：来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida F1)的cumate诱导系统中的操纵基因CuO；
Phom：来自谷氨酸棒状杆菌的启动子Phom；
Ptac：来自大肠杆菌的强启动子Ptac；
sfGFP：外源基因荧光蛋白。
(2)质粒载体pZL071-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL071-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP，标记为质粒4。质粒4上的cumate诱导结构可参照图4所示。图4为实施例中质粒载体pZL071-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的cumate诱导结构示意图。
(3)质粒载体pZL072-Ptac-CymR-Ptac-CuO-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptac-CymR-Ptac-CuO-sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL072-Ptac-CymR-Ptac-CuO-sfGFP，标记为质粒5。
(4)质粒载体pZL073-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL073-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP，标记为质粒6。质粒6上的cumate诱导结构可参照图5所示。图5为实施例中质粒载体pZL073-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP的cumate诱导结构示意图。
(5)质粒载体pZL074-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP基因序列，其中表达sfGFP基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL074-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP，标记为质粒7。质粒7上的cumate诱导结构可参照图6所示。图6为实施例中质粒载体pZL074-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP的cumate诱导结构示意图。
(6)质粒载体pZL075-Phom-CymR-Ptac-CuO的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Phom-CymR-Ptac-CuO基因序列，其中CuO基因基因后带有表达外源基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL075-Phom-CymR-Ptac-CuO，标记为质粒8。
(7)质粒载体pZL076-Ptuf-CymR-Ptac-CuO的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-Ptac-CuO基因序列，其中CuO基因基因后带有表达外源基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL076-Ptuf-CymR-Ptac-CuO，标记为质粒9。
(8)质粒载体pZL077-Ptac-CymR-Ptac-CuO的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptac-CymR-Ptac-CuO基因序列，其中CuO基因基因后带有表达外源基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL077-Ptac-CymR-Ptac-CuO，标记为质粒10。
(9)质粒载体pZL078-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO基因序列，其中CuO基因基因后带有表达外源基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL078-Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO，标记为质粒11。
(10)质粒载体pZL079-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO的构建。
取质粒载体pJYS1Ptac，往所述质粒载体的T1终止子后的酶切位点SwaI，插入Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO基因序列，其中CuO基因基因后带有表达外源基因的核糖体结合位点为RBS1，表达CymR基因的核糖体结合位点为RBS2，并删除质粒载体pJYS1Ptac上自身包含的FnCpf1基因、Ptac启动子、PlacI启动子及LacIq基因，构建得到所述质粒载体pZL079-Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO，标记为质粒12。
实例2：cumate诱导系统在谷氨酸棒状杆菌中控制sfGFP的表达
将实例1得到的12种质粒分别电转化入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，得到12种工程菌，分别涂布于含有25mg/L卡那霉素的BHIS固体平板上，分别30℃培养48h后进行菌落PCR验证(结果如图1所示)，得到的阳性菌分别命名为SCGpZL01、SCGpZL02、SCGpZL03、SCGpZL04、SCGpZL05、SCGpZL06、SCGpZL07、SCGpZL08、SCGpZL09、SCGpZL10、SCGpZL11、SCGpZL12。图1中的泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道N为野生型谷氨酸棒状杆菌(阴性对照)，泳道P1-P12为质粒1-12的PCR扩增产物(阳性对照)，泳道1-12为阳性菌的PCR扩增产物(实验组)。
所述SCGpZL01转化的是实例1的质粒1，
所述SCGpZL02转化的是实例1的质粒2，
所述SCGpZL03转化的是实例1的质粒3，
所述SCGpZL04转化的是实例1的质粒4，
所述SCGpZL05转化的是实例1的质粒5，
所述SCGpZL06转化的是实例1的质粒6，
所述SCGpZL07转化的是实例1的质粒7，
所述SCGpZL08转化的是实例1的质粒8，
所述SCGpZL09转化的是实例1的质粒9，
所述SCGpZL10转化的是实例1的质粒10，
所述SCGpZL11转化的是实例1的质粒11，
所述SCGpZL12转化的是实例1的质粒12。
将上述阳性菌分别在25mg/L卡那霉素的BHIS固体平板上划线活化后挑取单菌落，然后分别接种至10mL含25mg/L卡那霉素的BHI液体培养基中，分别在220rpm、30℃的条件下培养12h，得到12种菌液。
将上述12种菌液分别接种至25mL含25mg/L卡那霉素的BHI液体培养基中，起始OD600为0.3，220rpm、30℃培养至OD600为1。每种菌液各取10mL加入至两个离心管中，一离心管加入相应诱导剂为诱导管，另一离心管则不添加诱导剂为未诱导管。SCGpZL01和SCGpZL02的诱导管加入1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，SCGpZL03、SCGpZL04、SCGpZL05、SCGpZL06、SCGpZL07、SCGpZL08、SCGpZL09、SCGpZL10、SCGpZL11和SCGpZL12的诱导管加入50μM的cumate(四-异丙基苯甲酸)，在220rpm、30℃的条件下分别进行诱导培养。
诱导4h后每种菌液的诱导管和未诱导管分别取样1mL菌液，5000rpm离心2min收集菌体，用30mMTris/HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤菌体一次，再重悬于缓冲液，稀释OD600至0.5-0.7之间。采用TECAN infinite M200 Pro多功能光栅酶标仪，在放射波长为478nm和吸收波长为515nm的条件下测定荧光强度。荧光强度(荧光测量值/OD600)用来表示sfGFP单位表达水平。
未诱导sfGFP荧光强度＝[(未诱导实验组荧光强度-空白对照荧光强度)-(未诱导对照组荧光强度-空白对照荧光强度)]/OD600；
诱导后sfGFP荧光强度＝[(诱导后实验组荧光强度-空白对照荧光强度)-(诱导后对照组荧光强度-空白对照荧光强度)]/OD600；
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导荧光蛋白sfGFP表达的实验组是SCGpZL02、对照组是SCGpZL01。cumate诱导荧光蛋白sfGFP表达的实验组是SCGpZL03、SCGpZL04、SCGpZL05、SCGpZL06、SCGpZL07，对照组是SCGpZL08、SCGpZL09、SCGpZL10、SCGpZL11、SCGpZL12。空白对照为30mMTris/HCl(pH 8.0)缓冲液的荧光强度。
结果如图7所示，Ptac-sfGFP结构和Ptac-CymR-Ptac-CuO-sfGFP结构未诱导时依然有很强的荧光强度，说明Ptac启动子控制sfGFP表达的泄漏表达严重，Ptac-CymR-Ptac-CuO结构的cumate诱导系统控制sfGFP表达的泄漏表达严重。这两种诱导系统控制基因表达泄漏表达严重，不是严格的诱导系统。Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP结构、Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP结构、Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP结构和Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP结构的cumate诱导系统在未诱导时sfGFP的表达量很低，与对照组的sfGFP表达量基本持平；在诱导后sfGFP的表达量显著提高，且Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP结构诱导后sfGFP的表达量较高。说明这四种cumate诱导系统可以在谷氨酸棒状杆菌中工作，并且可以严格控制目的基因的表达，在未诱导时几乎不表达目的基因，诱导后表达目的基因且表达水平高，是严格控制的诱导系统，泄漏表达水平很低。图7中的“-”表示未添加诱导剂的实验组荧光强度，“+”表示添加诱导剂50μM cumate或1mM的IPTG实验组荧光强度。SCGpZL02加入的是1mM的IPTG；SCGpZL03、SCGpZL04、SCGpZL05、SCGpZL06、SCGpZL07加入的是50μM cumate。
实例3：cumate诱导系统在不同诱导时间、诱导剂浓度下控制sfGFP的表达
选择调控严格、诱导4h后sfGFP的表达量最高和最低的菌株SCGpZL04和SCGpZL07，以及它们的背景对照菌株SCGpZL09和SCGpZL12进行在不同诱导时间、诱导剂浓度下控制sfGFP的表达的测试。
将菌株SCGpZL04和SCGpZL09、SCGpZL07和SCGpZL12分别在25mg/L卡那霉素的BHIS固体平板上划线活化后挑取单菌落，分别接种至10mL含25mg/L卡那霉素的BHI液体培养基中，分别在220rpm、30℃的条件下培养12h。
分别将上述菌液接种至90mL含25mg/L卡那霉素的BHI液体培养基中，起始OD600为0.3，220rpm、30℃培养至OD600为1。每种菌液各取10mL至8个50mL离心管中，每管分别添加0、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100μM的诱导剂cumate，在220rpm、30℃诱导培养。在0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8h取500μL菌液，采用上述方法测定荧光值。
结果如图8所示，在Ptuf-CymR-Ptac-CuO结构的诱导系统控制sfGFP表达的菌株中，荧光值随着诱导时间的增加不断增加。当诱导时间为8h、诱导剂cumate浓度达到25μM时，荧光值趋于最大值。诱导剂cumate浓度为50μM、诱导8h后，荧光值比未诱导的提高了7000倍。
结果如图9所示，在Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO结构的诱导系统控制sfGFP表达的菌株中，荧光值和诱导时间成正比。当诱导时间为6h、诱导剂cumate浓度达到12.5μM时，荧光值趋于最大值。诱导剂cumate浓度为12.5μM或大于12.5μM、诱导6h后，荧光值比未诱导的提高了7000倍。该诱导系统可以通过添加不同浓度的诱导剂实现目的基因从低到高的表达量的调控，而且该诱导系统比Ptuf-CymR-Ptac-CuO结构的诱导系统对诱导剂cumate的响应更快更敏感，达到相同的荧光值时需要的诱导时间更短、诱导剂浓度更低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 8
<211> 624
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)
<400> 8
atggtgatca tgagtccaaa gagaagaaca caggcagagc gcgcaatgga gacccagggc 60
aagttgattg cagcggccct gggggtttta cgggaaaaag gttacgcggg attccggatc 120
gcagatgtgc ccggtgctgc tggtgtctcc agaggagcgc agagccatca tttcccgaca 180
aagcttgagc ttctgcttgc cacttttgaa tggctttacg aacagatcac cgaacgcagt 240
cgggctcgat tagcgaaatt gaagccagag gatgacgtca tccagcaaat gctggacgac 300
gccgccgaat ttttcctcga cgatgacttc tctatcagcc ttgatttgat tgtggctgcc 360
gaccgggacc cagcgttacg cgagggtatt cagcgcacgg tagagaggaa tcggtttgtc 420
gtcgaggata tgtggcttgg tgttctggtg agccgtggtc tttcgcgtga tgatgcagaa 480
gatatccttt ggttgatatt caattcggtg cgtgggcttg ctgttcgtag cctatggcag 540
aaggacaaag aacgctttga gcgtgtcagg aactcgacac tcgaaattgc gcgagagcgg 600
tacgcgaaat tcaagcgcta gtaa 624
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)
<400> 2
aacaaacaga caatctggtc tgtttgtatt at 32
<210> 3
<211> 172
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)
<400> 3
ccgttgaaaa ctaaaaagct gggaaggtga atcgaatttc ggggctttaa agcaaaaatg 60
aacagcttgg tctatagtgg ctaggtaccc tttttgtttt ggacacatgt agggtggccg 120
aaacaaagta ataggacaac aacgctcgac cgcgattatt tttggagaat ca 172
<210> 4
<211> 200
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)
<400> 4
tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60
ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120
aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180
gaagtccagg aggacataca 200
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29
<210> 6
<211> 7
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)
<400> 6
gaaagga 7
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)
<400> 7
gaaaggcga 9

Claims (8)

1.一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统，其特征在于，包括：阻遏蛋白CymR基因、谷氨酸棒状杆菌启动子Phom和谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf中的一种、操纵基因CuO及强启动子Ptac；
所述阻遏蛋白CymR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述操纵基因CuO的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述谷氨酸棒状杆菌启动子Phom的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述谷氨酸棒状杆菌启动子Ptuf的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述强启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统为如下4种结构的cumate诱导系统中的任意一种：
Phom-CymR-Ptac-CuO-sfGFP结构、Ptuf-CymR-Ptac-CuO-sfGFP结构、Ptuf-CymR-CuO-Ptac-CuO-sfGFP结构和Ptuf-CymR-Ptac-CuO-Ptac-CuO-sfGFP结构。
2.一种包含权利要求1所述的适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体。
3.根据权利要求2所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体，其特征在于，该载体还包含控制目的基因表达的核糖体结合位点RBS1和表达阻遏蛋白CymR的核糖体结合位点RBS2；所述控制目的基因表达的核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述表达阻遏蛋白CymR的核糖体结合位点RBS2的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。
4.根据权利要求2所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体，其特征在于，所述目的基因为谷氨酸棒状杆菌的外源基因。
5.根据权利要求4所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌的外源基因包括绿色荧光蛋白基因sfGFP。
6.根据权利要求2所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体为能在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌复制的温敏型载体pJYS1Ptac。
7.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2-6任一项所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体。
8.权利要求1所述的适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统、权利要求2-6任一项所述的包含适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统的质粒载体及权利要求7所述的宿主细胞在基因表达调控中的应用，其特征在于，cumate诱导剂的浓度为1.56-100μM。
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