CN116004693A - 一种正交线性基因表达系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种正交线性基因表达系统及应用，属于基因工程领域。本发明是以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为表达宿主，通过在胞内构建线性质粒，实现了基因的稳定表达。同时，本发明还实现了线性质粒拷贝数的精确控制。这不仅在苏云金芽孢杆菌内开发了一个稳定的蛋白表达系统，还为苏云金芽孢杆菌合成生物学应用奠定了基础。

Description

一种正交线性基因表达系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种正交线性基因表达系统及其应用。

背景技术

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，广泛存在于许多生物中，它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性等。质粒DNA有三种构象，大部分质粒DNA通常呈现超螺旋的SC构型，其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，也称为共价闭合环形DNA(cccDNA)；当两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，也称为开环DNA(ocDNA)；当质粒DNA经过限制性内切酶等核酸酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子(lDNA)。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为革兰氏阳性微生物，在农业上被广泛用作生物农药。此外，作为通常认为安全的微生物，其生长速度快，在合成生物学领域的应用具有巨大潜力，适合作为蛋白表达和代谢工程的宿主。然而，目前对其工具的开发仍然有限。此外，目前已有的细菌质粒均为环形质粒，尚未开发出线性的DNA质粒。相比于环形质粒，线性质粒具有正交、可控拷贝数、复制稳定不易丢失等诸多优点。因此，为了酶工程、代谢工程等领域的发展打下基础，本发明旨在实现一种适用于苏云金芽孢杆菌的线性质粒的开发与应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种适用于苏云金芽孢杆菌的正交线性基因表达载体，是将溶源性线性双链DNA噬菌体基因组改造后获得的能够表达目的基因的载体，并将其应用于蛋白的稳定表达。

本发明的第一个目的是提供一种正交线性基因表达系统，该基因表达系统包括以下I或II：

I、含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点的第一质粒，以及含有DNA复制与控制基因簇的第二质粒；

II、同时含有左复制原点、DNA复制与控制基因簇、启动子、目的基因和右复制原点的第三质粒；

其中，当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.1时，所述右复制原点的序列为SEQID NO.2，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.3；

当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.4时，所述右复制原点的序列为SEQ IDNO.5，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.6。

具体地，SEQ ID NO.1序列为：

ATTATGTACCTCTACTAGCCTATTAAAATATTTACCTATTGACACGTAATAACATTTATGAAATATGATATAC；

SEQ ID NO.2序列为：

TATATCGTGAAACATAGATGTTTATTTGTGTCAATGGGTAATATTGGTAAAAGTGCTAGTAGGGATACATAATA；

SEQ ID NO.4序列为：

ATTATGTACCCCTACCAACCTATTAAAATATTTACCTATTGACATGTAATAACATTTATGAAACACGATATAC；

SEQ ID NO.5序列为：

TATATCGTGTTTCATAGATGTTTATTTTTGTCAATGGGTAAATATGGTAAAGGTGCTAGTAGGGGTACATAAT。

进一步地，上述第三质粒中，各元件从5′端到3′端依次为左复制原点、DNA复制与控制基因簇、启动子、目的基因和右复制原点；上述第一质粒中，各元件从5′端到3′端依次为左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点。

进一步地，所述质粒由双链线性DNA溶源噬菌体基因组衍生获得，并以线性DNA形式存在于胞内，两端共价连接有末端蛋白。

进一步地，所述DNA复制与控制基因簇包括以下四个蛋白：末端蛋白TP(terminalprotein)、DNA聚合酶DNAP(DNA polymerase)、双链DNA结合蛋白DSB(double-strandedDNA-binding protein)和单链DNA结合蛋白SSB(single stranded DNA-bindingprotein)。

本发明中，表达载体的复制主要依赖于上述四个蛋白：

(1)表达载体两端与末端蛋白TP共价连接。TP上丝氨酸残基的-OH替代了核苷酸3′-OH，可以作为DNA复制的引物。

(2)DNA聚合酶识别线性质粒两端的一段特定DNA序列后，以TP为引物实现线性质粒的复制。根据线性质粒两端是否同时引发复制，将线性质粒的复制分为类型I与类型II。

(3)表达载体在双链形式时其上结合有DSB用以保护，复制过程中出现单链形式时会有SSB结合用以保护。由于复制线性质粒的DNA聚合酶不能复制基因组，而宿主的DNA聚合酶不能引发复制线性质粒，因此称线性质粒的复制方式为正交复制。

进一步地，所述正交线性基因表达系统中还包括含有诱导启动子和DNA聚合酶的第四质粒。

进一步地，所述DNA聚合酶的基因序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。其中，SEQ ID NO.7所示的DNA聚合酶与SEQ ID NO.1-3组成的载体系统配合使用，SEQ ID NO.8所示的DNA聚合酶与SEQ ID NO.4-6组成的载体系统配合使用。

进一步地，所述诱导启动子用于DNA聚合酶的表达调控，诱导启动子可为任何适用于宿主的启动子，如本发明中使用的是木糖诱导启动子。

进一步地，所述第三质粒的序列如SEQ ID NO.9所示。该序列中包括作为报告基因的绿色荧光蛋白基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)，实际应用时，可将该报告基因替换为所需目的基因。

进一步地，上述表达载体衍生于噬菌体GIL16或GIL01的基因组。

进一步地，上述表达载体改造采用同源重组法。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述正交线性基因表达系统的细胞。

进一步地，所述细胞为苏云金芽孢杆菌。

进一步地，所述苏云金芽孢杆菌包括但不限于苏云金芽孢杆菌HD-1(GenBank号:CP001903)、苏云金芽孢杆菌JW-1(GenBank号:CP045030)等。

进一步地，所述第一质粒、第二质粒和第三质粒分别独立地以适于苏云金芽孢杆菌表达的载体为载体骨架，如pGIL01、pGIL16等。

进一步地，所述第四质粒可采用环形载体骨架，如pBMB等。

进一步地，所述启动子为任何适于苏云金芽孢杆菌表达的启动子，如P₄₃启动子等。

本发明的第三个目的是提供一种上述正交线性基因表达系统或含有上述正交线性基因表达系统的细胞在调控目的蛋白表达中的应用。

进一步地，所述的应用为，在所述含有正交线性基因表达系统的细胞发酵过程中，利用不同浓度的诱导剂(如木糖)调控目的蛋白表达。在含有第四质粒的基础上，通过诱导启动子调控正交DNA聚合酶的表达水平实现线性质粒拷贝数的精确调控，拷贝数控制主要依赖于噬菌体自身编码的gp1、gp7与细菌SOS系统调控蛋白LexA的作用。

进一步地，所述诱导剂的浓度为0.01-100g/L。

本发明的第四个目的是提供一种上述正交线性基因表达系统或含有上述正交线性基因表达系统的细胞在食品、生物领域中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过构建细菌内正交线性基因表达载体，其可在苏云金芽孢杆菌胞内以双链线性DNA形式稳定复制并表达目的蛋白，在不添加压力筛选标签的情况下，使载体稳定存在超过70代后几乎未发现丢失。同时，使用诱导型启动子额外表达DNAP可以控制线性质粒拷贝数处于12-80之间，使线性质粒上目的基因的表达水平提升2.9倍。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为细菌内正交线性基因表达系统概念图；

图2为线性质粒结构概念图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所涉及的材料与方法如下：

绿色荧光蛋白(GFP)的GenBank登录号为AF324408.1。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

SG缓冲液：每L含蔗糖93.1g、甘油150mL。

0.1M PBS：每100mL含K₂HPO₄ 1.4g、KH₂PO₄ 0.52g。

1M MgCl₂：每100mL含MgCl₂·6H₂O 20.33g。

EP缓冲液：每L含SG缓冲液1L、0.1M PBS 5mL、1.0M MgCl₂ 500μL

绿色荧光蛋白表达量的测定方法：在96孔板中每孔加入200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。

实施例1苏云金芽孢杆菌的电转化

感受态制备：首先挑取单菌落于5mL LB培养基中，30℃活化培养过夜。然后按1/100的接种量转接至新鲜的LB培养基中，30℃、220r/min培养至OD₆₀₀约等于1.0-1.3(约2h)后冰浴冷却10-30min，整个感受态制作及转化过程均应在低温条件进行。冷却结束后，将菌液以5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，弃上清。然后相同条件用预冷的EP缓冲液清洗菌体2次，使用预冷的SG缓冲液清洗菌体1次，最后将菌体重悬于SG缓冲液中(约加入1.5mL)，使感受态OD₆₀₀约为50-70；将感受态50μL/管分装于离心管中，-80℃存放备用，或500μL/管分装于离心管中，现用现分装。

电转化过程：取1管感受态细胞放置冰上，加入3-5μL质粒DNA(质粒浓度100ng/μL以上，必须使用大肠杆菌JM110作为克隆宿主，否则质粒会被限制性切割导致转化失败)，稍微震荡混匀，冰浴10-30min后加入到1mm预冷的电转杯中，1.25kV电击后迅速加入500μL 37℃预热的LB培养基；37℃，220r/min恢复培养2h后涂布抗性平板，37℃培养箱内培养过夜。

实施例2线性质粒GIL16的同源重组改造

为实现苏云金芽孢杆菌HD-1高效重组，首先构建了辅助质粒pBMB-ESC(SEQ IDNO.11)，通过使用木糖诱导表达Exo(双链DNA5'-3'外切酶)、EcoSSB(大肠杆菌来源单链DNA结合蛋白)和CspRecT(DNA退火蛋白)以实现DNA片段在胞内形成单链DNA且高效退火。GIL16线性质粒整合框的构建采用融合PCR的方式。首先设计同源重组框，同源臂长度为500-1000bp，具体操作为：使用引物HD-Re-1F：acggacagttgtgcaacaactacg、HD-Rgfp-1R：aggatccagttgctccgtcacacgtgtgtcattttggac扩增左臂，使用引物HD-Rgfp-2F：acgtgtgacggagcaactggatcctgataggtggtatg、HD-Rgfp-2R：gaaattgttatccgctcccaagctttcatcaCTATTTGTATAGTTCATCC扩增GFP表达框，使用引物HD-Rgfp-3F：Gtgatgaaagcttgggagcggataacaatttcacacaggaaacagc、HD-Rgfp-3R：gcgtgataacgccagggttttcccagtcacg扩增抗生素抗性基因，使用引物HD-Re-4F：tgggaaaaccctggcgttatcacgctgggcataactactttgtg、HD-Re-4R：caattacggcttgtgcttcctctcg扩增右臂。相应的线性质粒/基因组整合操作为：

首先制备含pBMB-ESC质粒的菌株的感受态，当菌液OD₆₀₀约为0.5时加入终浓度3％的木糖，继续培养至OD₆₀₀约等于1.0-1.3。其余操作与电转化质粒相同。电转化时，DNA片段需较为单一，加入5μL浓度200ng/μL以上的DNA片段，后培养3h。其余操作与电转化质粒相同，最终DNA整合框实现原噬菌体GIL16基因组的重组编辑，构建获得含表达GFP线性质粒(SEQ ID NO.9)的重组苏云金芽孢杆菌。

实施例3线性质粒GIL01的同源重组改造

同样的，为实现苏云金芽孢杆菌JW-1高效重组，首先构建了辅助质粒pBMB-ESC(SEQ ID NO.11)，通过使用木糖诱导表达Exo(双链DNA5'-3'外切酶)、EcoSSB(大肠杆菌来源单链DNA结合蛋白)和CspRecT(DNA退火蛋白)以实现DNA片段在胞内形成单链DNA且高效退火。线性质粒整合框的构建采用融合PCR的方式。首先设计同源重组框，同源臂长度为500-1000bp，具体操作为：使用引物pGIL01-1F：ggcgttccgaaatgggtagtagagg、pGIL01-1R：tcgccagtcactatggcacgtgtgtcattttggacaaataaaaaagactagc扩增左臂，使用引物pGIL01-2F：tgacacacgtgccatagtgactggcgatgctgtcg、pGIL01-2R：gtcacagaacgcctgcgttattgcgcaggcgttttgtaataaaaaaagagcctcgtacctattaatgtatcgttagaaaaccgactgt扩增GFP表达框，使用引物pGIL01-3F：cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcacgaacggtagaatcgtcgacctg、pGIL01-3R：cacTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCC扩增抗生素抗性基因，使用引物pGIL01-4F：attatgtacccctactagcacctttaccatatttacccattgacaaaaataaacatctatgaaacacg、pGIL01-4R：GCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAAgtgaatacaaacttccaaattcatataggagactttgacg扩增右臂。相应的线性质粒/基因组整合操作为：

首先制备含pBMB-ESC质粒的菌株的感受态，当菌液OD₆₀₀约为0.5时加入终浓度3％的木糖，继续培养至OD₆₀₀约等于1.0-1.3。其余操作与电转化质粒相同。电转化时，DNA片段需较为单一，加入5μL浓度200ng/μL以上的DNA片段，后培养3h。其余操作与电转化质粒相同，最终DNA整合框实现原噬菌体GIL01基因组的重组编辑，构建获得含表达GFP线性质粒的重组苏云金芽孢杆菌。

实施例4线性质粒传代测试稳定性

将实施例2构建的重组苏云金芽孢杆菌在37℃、220rpm、50mL LB培养基、500mL中培养12h，获得种子液，再将种子液以0.1％的接种量转入50mL不含抗生素的LB培养基中，设置4个平行对照，于37℃、220rpm条件下培养12h。相同条件下，继续进行传代。对每一次获得的菌株菌株进行流式细胞仪测定GFP表达情况，以表征线性质粒丢失情况。

表1转接不同代数后仍含有线性质粒细胞的比例

实施例5添加不同浓度木糖后控制线性质粒拷贝数与GFP的表达水平

首先构建质粒pBMB-ODNAP(SEQ ID NO.12)，其构建过程为：首先使用引物ODNAP-1F：tgTTAAAGGAGGAAGGATCCatgagtactactaatagaaaaaagcgtagagag、ODNAP-1R：gcatccttcaatccttataagaaacttaattcgcctaatagttctttcatgtcc扩增GIL16 DNA聚合酶DNA，使用引物ODNAP-2F：catGGATCCTTCCTCCTTTAAcatttccccctttgatttttagatatcactagtttgg、ODNAP-2R：gtttcttataaggattgaaggatgcttaggaagacgag扩增带有木糖诱导性启动子的pBMB质粒载体，然后使用Gibson组装构建质粒pBMB-ODNAP。然后，将实施例2构建的重组苏云金芽孢杆菌转化质粒pBMB-ODNAP。在37℃、750rpm、700μL LB培养基、96孔深孔板中培养10h，获得种子液，再将种子液以5％的接种量转入190μL含不同浓度木糖的LB培养基中，使不同孔中的木糖终浓度为0.00g/L～50g/L，每个浓度设置六个平行对照，于37℃、750rpm条件下培养45h。相同条件下，不添加木糖的对照组最终发酵液中测得荧光强度约为34.3；而添加0.01，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，30，50g/L木糖之后，测得荧光强度平均值分别为35.6，36.6，43.7，51.7，58.4，68.4，85.3，84.9，86.7，100.0，99.4。

表2添加不同浓度木糖后线性质粒拷贝数与GFP的表达水平的数据记录

对比例

具体实施方式同实施例3，区别在于，重组苏云金芽孢杆菌内分别含有环形质粒pDG148、pBMB与pP43NMK。环形质粒在不添加抗生素筛选压力时传代70代时质粒发生显著丢失，含质粒细胞数仅分别占26.37％、2.73％和0.00％。

表3转接不同代数后仍含有环形质粒细胞的比例

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种正交线性基因表达系统，其特征在于，所述正交线性基因表达系统包括以下I和II中的任一种：

I、含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点的第一质粒，以及含有DNA复制与控制基因簇的第二质粒；

II、同时含有左复制原点、DNA复制与控制基因簇、启动子、目的基因和右复制原点的第三质粒；

其中，当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.1时，所述右复制原点的序列为SEQ IDNO.2，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.3；

当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.4时，所述右复制原点的序列为SEQ ID NO.5，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的正交线性基因表达系统，其特征在于：所述正交线性基因表达系统中还包括含有诱导启动子和DNA聚合酶的第四质粒。

3.根据权利要求2所述的正交线性基因表达系统，其特征在于：所述DNA聚合酶的基因序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

4.一种含有权利要求1-3任一项所述的正交线性基因表达系统的细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：所述细胞为苏云金芽孢杆菌。

6.权利要求1-3任一项所述的正交线性基因表达系统或含有所述正交线性基因表达系统的细胞在调控目的蛋白表达中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的应用为，在含有正交线性基因表达系统的细胞发酵过程中，利用不同浓度的诱导剂调控目的蛋白表达。

8.权利要求1-3任一项所述的正交线性基因表达系统或含有所述正交线性基因表达系统的细胞在食品或生物领域中的应用。

9.一种苏云金芽孢杆菌线性质粒，其特征在于：所述线性质粒含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点；

其中，当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.1时，所述右复制原点的序列为SEQ IDNO.2，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.3；

当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.4时，所述右复制原点的序列为SEQ ID NO.5，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.6。

10.含有权利要求9所述的苏云金芽孢杆菌线性质粒的表达系统。

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