CN116004681B - 一种提高topo克隆中载体连接效率的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高TOPO克隆中载体与目的DNA连接效率的方法，包括向连接转化体系中加入一定量的DNA结合蛋白，并在此基础上提供了相应的连接转化试剂及试剂盒，采用本发明的方法、试剂或试剂盒可获得更多的克隆载体。

Description

一种提高TOPO克隆中载体连接效率的方法及试剂盒

发明领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及分子克隆领域，尤其涉及一种提高TOPO克隆中载体与目标DNA连接效率的方法及试剂盒。

发明背景

传统分子克隆依赖重组DNA方法，即首先通过限制性内切酶酶切(如，T4 DNA连接酶)，制备接受DNA插入片段的载体；随后，通过连接酶将酶切的片段拼接在一起(即连接过程)，形成可以表达目标基因的新载体。但这个反应过程涉及的步骤多，繁琐费时，且酶稳定性差，储存运输过程中其活性容易发生变化。

目前有一种基于TOPO异构酶的，能将目标DNA克隆到载体中的高效、简便、快捷的方法——TOPO克隆。该方法不依赖于限制性内切酶和外源性连接酶，其关键在于DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有内切酶和连接酶特性，其生物学功能是在复制期间切割并重新连接DNA。

牛痘病毒拓扑异构酶I可特异性地识别DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA，DNA断裂释放的能量储存在其3′端胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团与拓扑异构酶I上Tyr-274残基形成的共价键中。牛痘病毒拓扑异构酶I在切割一条DNA链后使DNA解旋，随后，这种酶重新连接被切割的链，并使自身从DNA上释放出来。

目前市面上有多种在3′磷酸基团连接有拓扑异构酶I的线性化TOPO载体，如pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(仅适用于平末端)，但其连接转化的效率不高，尤其当连接3000bp及以上片段时，连接时间长且克隆子较少甚至不长克隆。在使用者的样品较珍贵或量较少时，如果无法获得有效的克隆子，这大大增加了科研者的实验风险、时间及经济成本。

发明概述

本发明提供一种提高TOPO克隆中载体与目标DNA连接效率的方法，基于此方法的试剂盒。采用本发明提供的方法及试剂盒克隆效率高，质量稳定，可改善现有TOPO克隆技术中时间和生产成本高的问题。

一方面，本发明提供DNA结合蛋白在制备TOPO克隆试剂中的应用，包括向TOPO克隆连接转化反应体系中加入DNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述的连接转化反应体系还包含载体、TOPO异构酶、目标DNA。

另一方面，本发明提供一种提高TOPO克隆中载体与目标DNA连接效率的方法，包括使用包含DNA结合蛋白的TOPO克隆连接转化反应体系。在一些实施方案中，所述的连接转化反应体系还包含TOPO异构酶、载体、目标DNA。

另一方面，本发明提供了一种TOPO克隆用试剂，所述试剂中包含TOPO异构酶、载体、DNA结合蛋白。

另一方面，本发明提供了一种TOPO克隆用试剂盒，所述试剂盒中包含TOPO异构酶、载体、DNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒中包含TOPO异构酶、载体、Sso7d蛋白。

另一方面，本发明提供了上述试剂或试剂盒在构建克隆载体中的应用。

在一些实施方案中，所述DNA结合蛋白选自Sso7d、Sac7a、Sac7b、Sac7d、Sac7e或上述蛋白的变体，优选为Sso7d蛋白或其变体。本发明中Sso7d变体蛋白DNA结合结构域可基于其与Sso7d的同源性来修饰，与Sso7d的DNA结合结构域相同或相似的变体均可用于本发明，Sso7d结合结构域中的多种突变已经记载，例如：美国专利申请US2007/0141591、PCT申请PCT/US2012/024739。

在一些实施方案中，所述Sso7d变体与Sso7d具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列一致性。

在一些实施方案中，所述Sso7d或其变体在连接转化反应体系中的含量选自0.0001～0.1μg/μL，优选0.0001～0.05μg/μL，更优选0.00025μg/μL、0.0005μg/μL、0.001μg/μL、0.0015μg/μL、0.002μg/μL、0.0025μg/μL、0.003μg/μL、0.0035μg/μL、0.004μg/μL、0.0045μg/μL、0.005μg/μL、0.0055μg/μL、0.006μg/μL、0.0065μg/μL、0.007μg/μL、0.0075μg/μL、0.008μg/μL、0.0085μg/μL、0.009μg/μL、0.0095μg/μL、0.01μg/μL。

在一些实施方案中，所述的载体是线性载体。在一些实施方案中，所述的载体含有自杀基因。在一些实施方案中，所述的自杀基因选自tse2、ccdB。在一些实施方案中，所述的载体是含有自杀基因的线性载体。在一些实施方案中，所述的载体是质粒。在一些实施方案中，所述的载体具有平末端。在一些实施方案中，所述的载体末端有突出的T。在一些实施方案中，所述的载体一个末端有突出的GTGG。在一些实施方案中，所述的载体结构中包含TOPO酶的识别序列5'-(C/T)CCTT-3'。在一些实施方案中，所述的载体是带有自杀基因并且包含TOPO酶的识别序列5'-(C/T)CCTT-3'的线性载体。在一些实施方案中，所述的载体是pCE3Blunt-Zero Vector。

在一些实施方案中，所述的TOPO异构酶是TOPO异构酶I。在一些实施方案中，所述的TOPO异构酶是牛痘病毒TOPO1酶。

在一些实施方案中，本发明所述的TOPO克隆连接转化反应体系中包含Tris-HCl、甘油、BSA、牛痘病毒TOPO1酶、载体、Sso7d蛋白、目标DNA。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含5～15v/v％的pH为7.2～8.0Tris-HCl、20～60v/v％的甘油、0.2～0.4μg/μL BSA、0.02～0.08μg/μL牛痘病毒TOPO1酶、0.01～0.05μg/μL载体、0.005～0.05μg/μL Sso7d蛋白。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含10v/v％的pH＝7.5的Tris-HCl、45v/v％甘油、0.25μg/μL BSA、0.025μg/μL载体、0.05μg/μL牛痘病毒TOPO1酶和0.0025～0.025μg/μL的Sso7d蛋白。

本发明的方法或试剂盒可用于TA、平端克隆及定向克隆载体构建。

在一些实施方案中，所述的目标DNA具有平端结构，目标DNA的长度选自500bp-50Kbp，优选为1K bp-10K bp，更优选3K bp-10K bp，例如4K bp、5K bp、6K bp、7K bp、8K bp、9Kbp。

另一方面，本发明还涉及克隆载体的构建方法，包括如下步骤：(1)提供目标DNA；(2)提供包含载体和TOPO异构酶的连接转化体系；(3)将目标DNA与第(2)步的连接转化体系进行反应，从而获得克隆载体；其中，连接转化体系中包含Sso7d蛋白。在一些实施方案中，所述的Sso7d蛋白在所述连接转化体系中的含量选自0.001～0.08μg/μL，优选0.005～0.05μg/μL，更优选0.0025～0.025μg/μL，更优选0.005、0.01、0.0125μg/μL、0.015μg/μL、0.0175μg/μL、0.02μg/μL、0.0225μg/μL。在一些实施方案中，所述的目标DNA长度选自500bp-50Kbp，优选为1K bp-10K bp，更优选3K bp-10K bp，例如4K bp、5K bp、6K bp、7K bp、8K bp、9Kbp。进一步的，所述连接转化反应体系中的载体为平末端结构。在一些实施方案中，所述的载体及目标DNA均为平末端结构。

在一些实施方案中，目标DNA是PCR扩增产物，并且引物5’端无磷酸化或修饰。

进一步的，所述连接转化体系还包括：缓冲体系、保护剂、稳定剂。

可选的，缓冲体系的pH值为7.2～8.0，优选的pH值为7.3～7.6。

可选的，缓冲体系为Tris-HCl缓冲体系。

可选的，保护剂为甘油。

可选的，稳定剂为BSA。

在一些实施方案中，所述连接转化体系包括：Tris-HCl、甘油、BSA、牛痘病毒TOPO1酶、载体、Sso7d蛋白。

可选的，Tris-HCl的pH为7.2～8.0，优选7.3～7.6，更优选7.4、7.5。可选的，Tris-HCl在连接转化体系中的含量为1～20v/v％，优选5～15v/v％，更优选6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％、10v/v％、11v/v％、12v/v％、13v/v％、14v/v％。

可选的，甘油在所述连接转化体系中的含量为10～80v/v％，优选为20～60v/v％，更优选为25v/v％、30v/v％、35v/v％、40v/v％、45v/v％、50v/v％、55v/v％。

可选的，BSA在所述连接转化体系中的含量为0.1～0.5μg/μL，优选0.2～0.4μg/μL，更优选0.25μg/μL、0.3μg/μL、0.35μg/μL。

可选的，牛痘病毒TOPO1酶在所述连接转化体系中的含量为0.01～0.1μg/μL，优选0.02～0.08μg/μL，更优选0.03μg/μL、0.04μg/μL、0.05μg/μL、0.06μg/μL、0.07μg/μL。

可选的，载体在所述连接转化体系中的含量为0.01～0.05μg/μL，优选0.015μg/μL、0.02μg/μL、0.025μg/μL、0.03μg/μL、0.035μg/μL、0.04μg/μL、0.045μg/μL。

在一个具体的实施方式中，所述连接转化体系包括：5～15v/v％的pH为7.2～8.0Tris-HCl、20～60v/v％的甘油、0.2～0.4μg/μL BSA、0.02～0.08μg/μL牛痘病毒TOPO1酶、0.01～0.05μg/μL载体、0.01～0.05μg/μL Sso7d蛋白。在一个具体的实施方式中，所述连接转化体系包括：45v/v％的pH＝7.5的Tris-HCl、45v/v％甘油、0.25μg/μL BSA、0.025μg/μL载体、0.05μg/μL牛痘病毒TOPO1酶和0.0025～0.025μg/μL的Sso7d蛋白。

在一些实施方案中，所述连接转化体系可以是现有技术中常用的连接转化试剂，例如在一个具体的实施方案中，所述连接转化体系为pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(TransGen，CB501)。

本发明中，对连接转化体系和连接转化反应体系进行了区分，其中连接转化体系是指不包含目标DNA的体系，在一些实施方案中其可等同于本发明所述的试剂盒；连接转化反应体系是指包含目标DNA以及连接转化体系的反应体系。本发明也对载体和克隆载体进行区分，其中载体是指未连接目标DNA的载体，克隆载体是将载体与目标DNA进行了连接反应、是连接转化反应的产物。

定义：

如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：

如本文所用，“目标DNA”是指从样品多核苷酸得到的双链DNA分子，所述多核苷酸是DNA，例如基因组或无细胞DNA，和/或RNA。用于本发明“目标DNA”可以是通过高保真酶进行PCR扩增获得，也可是通过普通酶扩增获得。例如，本领域技术人员可以根据需要选择不同的DNA聚合酶，例如在粘性末端体系中，选择普通Taq酶作为DNA聚合酶；在平末端体系中，选择高保真酶作为DNA聚合酶，高保真酶可以选自高保真的Taq酶、Pfu酶和KOD酶等。本领域技术人员可以知道本发明中用于PCR扩增的引物5’端不能磷酸化或修饰，且PCR延伸时间足够，以确保PCR扩增产物的完整性。可以通过电泳检测PCR产物的产量及质量，若产物仅有目的条带，无特异性条带和引物二聚体，可直接进行克隆反应，否则建议进行胶回收纯化。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，以避免模板质粒也长出菌落。“连接性能”是指载体与目的DNA片段连接的连接效率，可以通过将连接产物转化至克隆感受态细胞中，次日平板上生长的单克隆数来表示。

“阳性率鉴定”是指将平板上的单克隆进行菌液PCR鉴定,检测其是否插入目的片段。

“载体”，是指能够用于缺失、插入、置换或组装一个或多个核酸分子的任何载体，可来源于质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒、人工染色体或能够在体外或在宿主细胞内复制或被复制的其它序列。可以包含能够被另一种转基因或DNA片段去除或置换的反选择标记基因，即本发明所述的自杀基因(例如ccdB或tse2)，还可含有(例如)耐药基因、控制被克隆的DNA片段上的基因表达用的启动子序列和操纵子序列等。“克隆载体”是指目标DNA与载体连接的产物。

有益效果

采用本发明所述方法或试剂盒，TOPO载体连接小于3000bp的片段性能提升了50～80％；TOPO载体连接大于3000bp的片段性能提升了200～300％；从而得到更多的克隆载体，极大节约科研者们的时间及经济成本。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明，但不作对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

1.1PCR产物的获取

(1)DNA片段的扩增

选择高保真酶Vazyme#P515分别对Blunt-1k(SEQ ID NO:5)和Blunt-7k(SEQ IDNO:6)片段进行PCR扩增，引物5’端无磷酸化或修饰，且延伸时间足够，以确保PCR扩增产物的完整性。

引物序列：

扩增体系：

扩增程序：

(2)扩增产物筛选

扩增结束后，电泳检测产物的产量及质量，若产物仅有目的条带，无特异性条带和引物二聚体，可直接进行反应，否则进行胶回收纯化。

1.2连接转化

(1)配制连接转化体系40ul

Sso7d蛋白制备方法：

(1)将Sso7d基因和肠激酶酶切克隆到pGEX-4T-1(外购丰晖生物)载体上；

(2)16℃低浓度IPTG诱导原核表达；

(3)GST标签纯化(GST亲和层析)；

(4)肠激酶酶切(EK酶切)；

(5)离子交换层析去除EK和痕量DNA。

设置六种不同浓度的Sso7d蛋白，x分别为0、0.05、0.1、0.5、1、2μg。

(2)连接反应

配制连接反应体系10ul

轻弹混匀，短暂离心，25℃反应5min。

(3)转化

将FastT1感受态细胞(VazymeC505)从-70℃拿出，迅速置于冰上融化，将(2)中的连接产物全部加入其中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激30sec后，迅速置于冰上静置2min。向离心管中加入900μl LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm摇床中复苏1h。取100μl菌液，均匀涂布在含氨苄抗生素的LB固体培养基平板上。将平板正置于37℃培养箱10min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养。

(4)菌检鉴定或测序分析菌落/菌液PCR鉴定

每个平板上各挑16个单克隆至10μl无菌水混匀作为菌液模板。

菌液PCR体系配制如下：

扩增程序：

引物序列：

克隆数的结果见表1，插入片段大小分别为7Kb/1Kb，采用本发明所述的方法在进行连接7kb片段时加入0.5μg的Sso7d蛋白比不加Sso7d蛋白的克隆数提高了216％；在进行1kb片段时加入0.5μg的Sso7d蛋白比不加Sso7d蛋白的克隆数提高了67％。

表1.结果克隆数统计(个)

加入Sso7d蛋白的连接转化反应体系所得到的连接片段的阳性率合格(合格是指阳性克隆率高于14/16)。

实施例2：

利用TransGen.CB501-01进行TOPO克隆。将实施例11.1得到的PCR扩增产物(210ngBlunt-7K bp或300ng Blunt-1K bp)加入到1μlpEASY-Blunt Zero Cloning Vector中，用ddH₂O补足体积至5μl，轻弹混匀，短暂离心，室温反应5min。进行实施例11.2(3)(4)步骤。

表2.结果克隆数统计(个)

克隆数的结果见表2，与对照(CB501-01)相比，实施例1中加入0.5μg Sso7d的体系的Blunt-7K组的连接效率是对照的6倍；Blunt-1K组的连接效率是对照的2.4倍。

Claims (17)

1.一种提高TOPO克隆中载体与目标DNA连接效率的方法，包括使用包含DNA结合蛋白Sso7d的TOPO克隆连接转化反应体系，所述连接转化反应体系中还包含载体、TOPO异构酶、目标DNA；其中，目标DNA具有平端结构，且长度选自3Kbp～10Kbp。

2.根据权利要求1所述的方法，目标DNA的长度选自4Kbp、5Kbp、6Kbp、7Kbp、8Kbp或9Kbp。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化反应体系中的含量选自0.0001～0.1μg/μL。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化反应体系中的含量选自0.0001～0.05μg/μL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化反应体系中的含量选自0.00025μg/μL、0.0005μg/μL、0.001μg/μL、0.0015μg/μL、0.002μg/μL、0.0025μg/μL、0.003μg/μL、0.0035μg/μL、0.004μg/μL、0.0045μg/μL、0.005μg/μL、0.0055μg/μL、0.006μg/μL、0.0065μg/μL、0.007μg/μL、0.0075μg/μL、0.008μg/μL、0.0085μg/μL、0.009μg/μL、0.0095μg/μL或0.01μg/μL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的载体结构中包含TOPO异构酶的识别序列5'-(C/T)CCTT-3'；所述的TOPO异构酶是牛痘病毒TOPO1酶。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中TOPO克隆连接转化反应体系中包含Tris-HCl、甘油、BSA、牛痘病毒TOPO1酶、载体、Sso7d蛋白、目标DNA。

8.一种TOPO克隆用试剂盒，包含TOPO异构酶、载体、Sso7d蛋白。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述载体是带有自杀基因并且包含TOPO异构酶的识别序列5'-(C/T)CCTT-3'的线性载体；所述TOPO异构酶是牛痘病毒TOPO1酶。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，包含5～15v/v％的pH为7.2～8.0的Tris-HCl、20～60v/v％的甘油、0.2～0.4μg/μLBSA、0.02～0.08μg/μL牛痘病毒TOPO1酶、0.01～0.05μg/μL载体、0.005～0.05μg/μLSso7d蛋白。

11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，包含10v/v％的pH＝7.5的Tris-HCl、45v/v％甘油、0.25μg/μLBSA、0.025μg/μL载体、0.05μg/μL牛痘病毒TOPO1酶和0.0025～0.025μg/μL的Sso7d蛋白。

12.一种克隆载体的构建方法，包括如下步骤：(1)提供目标DNA；(2)提供包含载体和TOPO异构酶的连接转化体系；(3)目标DNA与第(2)步的连接转化体系进行反应，从而获得克隆载体；其中，连接转化体系中包含Sso7d蛋白，所述目标DNA长度选自3Kbp～10Kbp。

13.根据权利要求12所述的方法，目标DNA长度选自4Kbp、5Kbp、6Kbp、7Kbp、8Kbp或9Kbp。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中Sso7d蛋白在所述连接转化体系中的含量选自0.001～0.08μg/μL。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化体系中的含量选自0.005～0.05μg/μL。

16.根据权利要求12或13所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化体系中的含量选自0.0025～0.025μg/μL。

17.根据权利要求12或13所述的方法，其中Sso7d蛋白在连接转化体系中的含量选自0.005μg/μL、0.01μg/μL、0.0125μg/μL、0.015μg/μL、0.0175μg/μL、0.02μg/μL或0.0225μg/μL。