CN116218953A - 一种连接核酸片段与接头的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种连接核酸片段与接头的方法,属于生物技术领域。该方法能有效提高CUT&Run文库构建过程中150‑300bp小片段与接头的连接效率,进而提高文库中150‑300bp小片段占比及建库成功率,并有效提高数据信噪比,同时降低细胞起始量。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域,具体涉及一种连接接头与核酸片段的方法。该方法能有效提高CUT&Run文库构建过程中150-300bp小片段与接头的连接效率,进而提高文库中150-300bp小片段占比及建库成功率,并有效提高数据信噪比,同时降低细胞起始量。
背景技术
染色质免疫沉淀(ChIP)是广泛用于研究蛋白质与DNA相互作用的方法,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与大规模平行DNA测序技术相结合,可以让研究者精确绘制感兴趣蛋白的全局DNA结合位点。ChIP的基本流程是:(1)交联:采用甲醛固定组织或细胞,使DNA与蛋白质紧密结合;(2)片段化:该过程破坏染色质,最终获得用于ChIP分析的DNA片段与蛋白复合物;(3)染色质免疫沉淀:通过加入针对目的蛋白的抗体,结合靶蛋白-DNA复合物;(4)DNA回收和纯化:回收纯化富集的DNA片段,通过下游检测技术(定量PCR、基因芯片、测序等)分析靶标蛋白特异结合的DNA序列信息(Park PJ.ChIP-seq:advantages and challenges of a maturing technology.[J].NatureReviews Genetics,2009,10(10):669.)(图1)。然而,因ChIP技术需要对组织或细胞进行甲醛交联,然后再进行DNA片段化,这使得该技术需要极高的细胞起始投入量(百万级),并且很可能因为甲醛过度交联使实验结果存在假阳性。
为了弥补ChIP的技术缺陷,研究者通过不断地更新与优化,开发了CUT&Run(Cleavage UnderTargets&Release UsingNuclease)技术和CUT&Tag(CleavageUnderTargets&Tagmentation)技术。CUT&Tag以及CUT&Run是研究生物活体细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术(HenikoffS,Skene P J.An efficient targeted nuclease strategyfor high-resolution mapping ofDNAbinding sites[J].eLife,6,(2017-01-06),2017,6;Kaya-OkurH S,Wu S J,Codomo CA,et al.CUT&Tag for efficient epigenomicprofiling of small samples and single cells[J].Nature Communications,2019,10(1):1930.),其通过抗体富集Tn5转座酶或Mnase核酸酶,特异切割目的蛋白附近的DNA。再通过对切割后标记的DNA进行文库构建和测序就可以绘制目的蛋白全局的DNA结合位点(图2)。该技术因为不需要交联和物理打断DNA,一定程度的缓解了ChIP技术假阳性和高细胞投入量的缺点。
虽然CUT&Tag和Cut&Run技术相较ChIP有明显提升,但是CUT&Tag技术由于使用PA/G-Tn5酶进行基因组切割和打断,而Tn5酶本身分子量较大有60KD左右,导致其很难同时在NDR区(nucleosome depleted region)发生切割,故CUT&Tag技术较难单独富集NDR区域的信号。而Cut&Run技术由于使用的是PA/G-MNase,其整个融合酶的分子量大小只有20KD,能有效进入NDR区域发生切割,但是目前的Cut&Run技术对小片段的回收和建库性能很弱,导致目前Cut&Run仍然不能很好的回收NDR区域的小片段信息。而大部分转录因子(TF:transcription factor)却结合在NDR区域(图3),故很难直接研究转录因子和DNA的结合信息。
发明内容
本申请的目的在于提供一种连接核酸片段与接头的方法,其可用于提高CUT&Run文库构建过程中150-300bp小片段与接头的连接效率,进而提高文库中150-300bp小片段占比及建库成功率,以解决现有技术中小片段回收率较低、建库性能弱的问题,同时提高CUT&Run技术的细胞投入量兼容性。
在第一方面,本申请提供一种连接核酸片段与接头的方法,所述方法包括使用Sso7d-T4 DNA连接酶连接核酸片段与接头。
在一些实施方案中,所述的核酸片段为双链核酸,所述双链核酸包含但不限于双链DNA、双链RNA和/或DNA-RNA杂交双链。
在一些实施方案中,所述核酸片段的3’末端包含突出的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中,所述核酸片段与所述接头通过A-T连接的方式进行连接,本领域公知的A-T连接为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的腺嘌呤与接头的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的胸腺嘧啶进行互补配对,从而完成核酸片段与接头的连接。在一些实施方案中,所述接头是Y型衔接头或泡状接头。在一个实施方案中,所述接头是illumina平台的测序长接头或短接头或华大智造MGI平台的泡状接头。
在一些实施方案中,所述核酸片段的两端为平末端,其可以与平端接头进行连接,例如Ion Torrent平台的测序接头。
在一些实施方案中,所述Sso7d-T4 DNA连接酶是融合蛋白,按照本领域技术人员公知的方法制备,例如通过在体外构建重组载体并表达纯化获得。在一些实施方案中,所述重组表达载体的Sso7d编码序列和T4 DNA连接酶的编码序列是本领域已知的,包括其野生型和突变型。
在一些实施方案中,所述Sso7d-T4 DNA连接酶是复合物,按照本领域技术人员公知的方法制备,例如通过连接物体外连接Sso7d蛋白和T4 DNA连接酶获得。在一些实施方案中,所述Sso7d蛋白序列和T4 DNA连接酶序列是本领域已知的,包括其野生型和突变型。
在一些实施方案中,所述Sso7d-T4 DNA连接酶包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1
DPALRATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQKKGTSGGGSGGGILKILNEIASIGSTKQKQAILEKNKDNELLKRVYCLTYSRGLQYYIKKWPKPGIATQSFGMLTLTDMLDFIEFTLATRKLTGNAAIEELTGYITDGKKDDVEVLRRVMMRDLECGASVSIANKVWPGLIPEQPQMLASSYDEKGINKNIKFPAFAQLKADGARCFAEVRGDELDDVRLLSRAGNEYLGLDLLKEELIKMTAEARQIHPEGVLIDGELVYHEQVKKEPEGLDFLFDAYPENSKAKEFAEVAESRTASNGIANKSLKGTISEKEAQCMKFQVWDYVPLVEIYSLPAFRLKYDVRFSKLEQMTSGYDKVILIENQVVNNLDEAKVIYKKYIDQGLEGIILKNIDGLWENARSKNLYKFKEVIDVDLKIVGIYPHRKDPTKAGGFILESECGKIKVNAGSGLKDKAGVKSHELDRTRIMENQNYYIGKILECECNGWLKSDGRTDYVKLFLPIAIRLREDKTKANTFEDVFGDFHEVTGL
在一些实施方案中,所述核酸片段大小为50-500bp,优选100-400bp,更优选150-300bp,包括所述范围内的150bp、155bp、160bp、165bp、170bp、175bp、180bp、185bp、190bp、195bp、200bp、205bp、210bp、215bp、220bp、225bp、230bp、235bp、240bp、245bp、250bp、255bp、260bp、265bp、270bp、275bp、280bp、285bp、290bp、295bp或300bp。
在一些实施方案中,所述Sso7d-T4 DNA连接酶在反应体系的浓度为1-10mM,例如1mM、2mM、3mM、3.2mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM;优选2-6mM,更优选3-5mM。
在第二方面,本申请提供一种构建核酸文库的方法,所述方法包含:
收集核酸样本,并对所述核酸样本进行打断获得片段化的核酸;
任选地,纯化片段化的核酸;
对所述片段化的核酸进行末端修复得到核酸片段;
使用本申请第一方面提供的方法,连接所述核酸片段和接头;
任选地,对连接产物进行纯化;
任选地,扩增连接产物;
任选地,对扩增产物进行纯化。
在一些实施方案中,所述打断包括但不限于采用酶切法、化学法和/或机械法对所述核酸样本进行片段化。在一些实施方案中,所述酶切法为例如利用微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)MNase、Tn5转座酶、DNaseⅠ、EndonucleaseⅤ或Fragmentase进行酶切,所述机械法为例如超声断裂法、离心法或热休克法,所述化学法为例如利用化学试剂处理所述核酸样本使其断裂为多个片段。
在一些实施方案中,所述末端修复包括对所述片段化的核酸的末端进行补平,以使所述片段化的核酸能够与平端接头进行连接。
在一些实施方案中,所述末端修复还包括加A的步骤,即在末端补平后的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸,以实现将所述核酸片段与所述接头通过A-T连接。
在一些实施方案中,对所述片段化的核酸进行末端补平的酶为例如T4 DNA聚合酶,所述加A步骤使用的酶为例如Klenow DNA聚合酶(3'-5'exo-)。
在一些实施方案中,所述核酸样本是双链DNA、双链RNA、DNA-RNA杂交双链、单链DNA和/或单链RNA。在一些实施方案中,当所述样本是单链DNA时,所述方法还包括通过随机引物获得双链DNA的步骤。在一些实施方案中,当所述样本是单链RNA时,所述方法还包括逆转录的步骤。
在一些实施方案中,所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法进行纯化;优选磁珠法。
在第三方面,本申请提供一种构建研究蛋白质-DNA互作的文库的方法,所述方法包含:
收集样本,所述样本为细胞、透化的细胞、染色体和/或染色质;
将靶蛋白结合抗体与所述样本进行孵育,所述靶蛋白结合抗体与靶蛋白结合;
加入核酸酶对目标DNA进行片段化得到DNA片段,所述核酸酶上连接有能够结合所述靶蛋白结合抗体的结合物,所述目标DNA位于所述靶蛋白的附近;
任选地,纯化所述DNA片段;
对纯化或未纯化的DNA片段进行末端修复;
使用本申请第一方面提供的方法,将所述DNA片段连接接头;
任选地,对接头连接产物进行纯化;
任选地,对接头连接产物或其纯化产物进行扩增;
任选地,对扩增产物进行纯化。
在一些实施方案中,当与接头A-T连接时,需要对所述DNA片段加A。
在一些实施方案中,所述细胞经透化或穿孔处理,例如采用添加洋地黄皂苷、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇或吐温对所述细胞进行处理,优选洋地黄皂苷。在一些实施方案中,所述方法包括将透化前或透化后的细胞固定在磁珠上,优选伴刀豆球蛋白A磁珠。
在一些实施方案中,所述核酸酶为微球菌核酸酶MNase。在一些实施方案中,所述靶蛋白结合抗体的结合物为例如ProteinA、Protein G或ProteinAG,优选ProteinAG。在一些实施方案中,所述方法还包括加入靶蛋白结合抗体的抗体(二抗)进行孵育,所述二抗用于增加proteinAG结合区域的数量,使核酸酶-抗体结合物与靶蛋白结合抗体更有效结合。
在一些实施方案中,所述方法还包括激活核酸酶的步骤,例如添加二价金属阳离子,例如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+,或者上述离子的混合物,优选添加Ca2+。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是转录因子或组蛋白。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是组蛋白,例如H3k27me3、H3K4me3、H3K27ac、H3K4me1、H3K4me2、H2A和/或Abf1的至少一种。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是转录因子,例如CTCF和/或Reb1。
在一些实施方案中,所述细胞为人K562细胞。
在一些实施方案中,所述细胞至少为100个。在一些实施方案中,所述细胞为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个。
在一些实施方案中,所述样本来自真核生物或原核生物,例如动物、植物或微生物,又例如人、小鼠、大鼠、拟南芥或酿酒酵母。
在第四方面,本申请提供一种组合物,所述组合物包含异丙醇、异硫氰酸胍、泊洛沙姆、吐温20和SDS。
在一些实施方案中,所述异丙醇的体积分数为25%-95%,优选40%-90%,包括所述范围内的例如40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%或95%。在一些实施方案中,所述异硫氰酸胍的浓度为10-30M,优选10-20M,包括所述范围内的例如10M,11M,12M,13M,14M,15M,16M,17M,18M,19M或20M。在一些实施方案中,所述泊洛沙姆的浓度为1%-15%,优选1%-10%,包括所述范围内的例如1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%或10%。在一些实施方案中,所述吐温20的浓度为0.1%-1%,优选0.1%-0.5%,包括所述范围内的例如0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%,0.35%,0.4%,0.45%或0.5%。在一些实施方案中,所述SDS的质量浓度为0.1%-2%,优选0.2%-1%,包括所述范围内的例如0.2%,0.25%,0.3%,0.35%,0.4%,0.45%,0.5%,0.6%,0.65%,0.7%,0.75%,0.8%,0.85%,0.9%,0.95%或1%。
在一些实施方案中,所述组合物中含有90%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20和0.6%SDS;在一些实施方案中,所述组合物中含有80%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20和0.6%SDS;在一些实施方案中,所述组合物中含有70%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20和0.6%SDS;在一些实施方案中,所述组合物中含有60%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20和0.6%SDS;在一些实施方案中,所述组合物中含有50%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20 和0.6%SDS;在一些实施方案中,所述组合物中含有40%异丙醇、15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20和0.6%SDS。
在第五方面,本申请提供第四方面任一实施方案的组合物在核酸纯化中的应用。
在第六方面,本申请提供第四方面任一实施方案的组合物在第二、第三方面所述方法中所述核酸纯化步骤中的应用;特别是用于纯化150-300bp核酸片段。
在第七方面,本申请提供一种试剂盒,所述试剂盒包含Sso7d-T4 DNA连接酶及其反应缓冲液、核酸片段化试剂和末端修复试剂,其中,所述反应缓冲液能够使所述Sso7d-T4DNA连接酶发挥其连接活性。
在一些实施方案中,所述核酸片段化试剂例如片段化酶例如MNase及其反应缓冲液。
在一些实施方案中,所述末端修复试剂例如T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4多聚合核苷酸激酶或其中任意两种或三种的混合物,以及上述酶的反应缓冲液。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含核酸纯化试剂,例如磁珠法纯化试剂。在一些实施方案中,所述核酸纯化试剂中包含本申请第四方面多个实施方案所述的纯化缓冲液。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含接头;优选地,所述接头为平端接头、Y型接头或泡状接头。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含扩增试剂例如扩增用聚合酶和反应缓冲液。
在一些实施方案中,所述Sso7d-T4 DNA连接酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒用于实施本申请第一方面、第二方面、第三方面和/或第五方面提供的方法。
附图说明
图1:ChIP技术原理图;
图2:Cut&Run技术原理图;
图3:TF主要结合在NDR区示意图;
图4A:不同纯化缓冲液对片段化产物纯化结果的影响;图4B:不同纯化缓冲液对纯化产物中150-300bp小片段占比的影响;图4C:不同纯化缓冲液对纯化产物的浓度及纯度的影响;
图5A:不同纯化缓冲液对小片段回收产物文库构建的影响;图5B:不同纯化缓冲液对文库产物中150-300bp小片段占比的影响;
图6A:两种建库方法获得的文库产物对比;图6B:两种建库方法获得的文库产物中150-300bp小片段占比;
图7:两种建库方法获得的文库测序结果Heatmap图对比;
图8A:以CTCF为靶点对比两种建库方法在细胞投入量不同时获得的文库测序结果Heatmap图;图8B:以H3k27me3为靶点对比两种建库方法在细胞投入量不同时获得的文库测序结果Heatmap图;
图9A:以CTCF为靶点对比两种建库方法细胞投入量不同时获得的文库测序结果IGV信号图;图9B:以H3k27me3为靶点对比两种建库方法细胞投入量不同时获得的文库测序结果IGV信号图。
具体实施方式(实施例)
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案,但下述的实例仅仅是本申请的简易例子,并不代表或限制本申请的权利保护范围,本申请的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,若无特殊说明,所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商;若无特殊说明,所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实验试剂
以纯水为溶剂,配制下述纯化缓冲液:
纯化缓冲液1:包含15M异硫氰酸胍、40%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液2:包含15M异硫氰酸胍、50%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液3:包含15M异硫氰酸胍、60%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液4:包含15M异硫氰酸胍、70%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液5:包含15M异硫氰酸胍、80%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液6:包含15M异硫氰酸胍、90%异丙醇、4%泊洛沙姆、0.2%tween20、0.6%SDS;
纯化缓冲液7:包含15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20、0.6%SDS。
实施例1
以K562细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司,货号CL-0130)转录因子CTCF为靶标,按照文献“Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for lowcell numbers”中的方法步骤,对7份K562细胞(每份细胞量为10000个细胞)进行Cut&Run实验,将细胞染色质进行片段化,其中使用的CTCF靶标抗体为Active motif产品(Cat.No.61932),PAG-MNase酶为Cell Signaling Technology产品(Cat.No.40366S),最终获得7份片段化后的产物,混匀7份产物,再均分为7份,每份体积200μl,保证每份产物量相同。
实施例2
对实施例1中片段化后的细胞产物进行磁珠DNA纯化,通过不同的纯化缓冲液,用以说明异丙醇对小片段纯化的作用,具体操作如下:
向实施例1中获得的7份样本中分别加入5μl Proteinase K、40μl VAHTSParticles G(南京诺唯赞,货号:N903),后分别在7份样本中加入300μl纯化缓冲液1-7,涡旋振荡混匀,静置10min,期间上下颠倒混匀2-3次;
短暂离心后放置于磁力架上,静置30s-2min,弃尽上清;
加入900μl bufferWA(南京诺唯赞,货号:N903),涡旋振荡15s,短暂离心后放置于磁力架上,静置30s-2min,弃尽上清;
加入900μl bufferWB(南京诺唯赞,货号:N903),涡旋振荡15s,短暂离心后放置于磁力架上,静置30s-2min,弃尽上清,再重复此步骤一次;
室温晾干5-20min,直至磁珠表面不反光;
每份纯化样本加入22μl ddH2O洗脱,静置5min,短暂离心后放置于磁力架上,静置30s-2min;
对上述7份纯化样本进行Agilent 2100Bioanalyzer检测纯化后的核酸峰型,并检测260/280、260/230性能。
结果分析
如图4A-C,其中图4A中的“普通Buffer”指含有0%异丙醇纯化缓冲液(即纯化缓冲液7),图4C中的“优化Buffer”指含有90%异丙醇纯化缓冲液(即纯化缓冲液6),通过在纯化缓冲液中加入异丙醇能够增加150bp-300bp小片段在总回收产物中的占比,不同浓度的异丙醇对小片段的纯化回收效率不同,经纯化缓冲液1-6处理后的纯化产物浓度、260/280和260/230性能上均显著优于纯化缓冲液7纯化后的产物,其中纯化缓冲液6,即浓度为90%异丙醇的纯化缓冲液对于提高小片段DNA的纯化得率最佳。
实施例3
以K562细胞转录因子CTCF为靶标,按照实施例1进行Cut&Run染色质片段化,通过纯化缓冲液6和纯化缓冲液7对片段化产物的纯化,比较两者在文库构建方向的差异,具体操作如下:
按照实施例1的方法对2份10000个K562细胞进行Cut&Run染色质片段化,混匀后将片段化产物等分为2份,每份按照实施例2的方法步骤,分别使用纯化缓冲液6和纯化缓冲液7对片段化产物进行纯化,每份产物取20μl进行文库构建。
使用南京诺唯赞ND608产品,对上述2份纯化后的片段化产物进行文库构建,按照如下体系对纯化产物进行末端补平和损伤修复:
组分 | 体积 |
InputDNA | 20μl |
EndPrepEnzyme | 3μl |
EndPrepBuffer | 7μl |
ddH2O | 30μl |
总体积 | 60μl |
上述组分混匀后进行如下末修程序:
温度 | 时间 |
105℃热盖 | on |
20℃ | 30min |
65℃ | 30min |
4℃ | Hold |
对上述产物进行接头连接,其中DNA Adapter X接头为南京诺唯赞N321/N322产品,接头按照1:100稀释使用,配制如下体系进行接头连接:
组分 | 体积 |
末修产物 | 60μl |
Rapid Ligation buffer2 | 30μl |
Rapid DNA Ligase | 10μl |
DNA Adapter X | 5μl |
ddH2O | 5μl |
总体积 | 110μl |
上述组分混匀后上机进行如下程序:
温度 | 时间 |
105℃热盖 | on |
20℃ | 15min |
4℃ | Hold |
取165μl DNA磁珠(南京诺唯赞,货号N411)对接头连接后的产物进行纯化,取22μl纯水进行洗脱,吸取20μl进行文库扩增。
按照如下体系配制文库扩增组分:
组分 | 体积 |
连接后纯化产物 | 20μl |
PCR Primer Mix 3 for Illmina | 5μl |
VAHTS HiFi Amplification Mix | 25μl |
总体积 | 50μl |
上述组分混匀后上机进行如下扩增程序:
取100μl DNA磁珠(南京诺唯赞,货号N411)对扩增后的产物进行纯化,取22μl纯水进行洗脱,对纯化产物进行Agilent 2100Bioanalyzer峰型检测,并对2份文库进行测序。
结果分析
如图5A-B,通过含有90%异丙醇的纯化缓冲液6(优化Buffer)构建的文库产物中150-300bp小片段文库占比高于通过纯化缓冲液7(普通Buffer)构建的文库产物中小片段的占比,说明异丙醇不但直接提高了片段化后150-300bp小片段的回收率,而且最终也提高了文库产物中的150-300bp小片段文库占比。
实施例4
以转录因子CTCF为靶蛋白,对K562细胞进行Cut&Run染色质片段化,通过纯化缓冲液6对片段化产物的纯化,纯化产物进行接头连接时分别使用常规的T4 DNA连接酶和融合Sso7d-T4 DNA连接酶,比较两种连接酶在文库构建及测序方面的影响。Sso7d-T4 DNA连接酶融合蛋白根据参考文献(Wilson RH,Morton SK,Deiderick H,Gerth ML,Paul HA,Gerber I,Patel A,Ellington AD,Hunicke-Smith SP,Patrick WM.EngineeredDNAligases with improved activities in vitro.Protein Eng Des Sel.2013Jul;26(7):471-8.)进行制备。
按照实施例1的方法对2份100个细胞和2份10000个细胞分别进行Cut&Run染色质片段化,将片段化产物按照实施例2的方法步骤,使用纯化缓冲液6对片段化产物进行纯化,每种不同投入量的纯化产物混匀后再平均分为两份,每份20μl。
按照实施例3方法步骤进行文库构建,在文库构建过程中,相同投入量的两份片段化纯化产物分别使用2μl 0.2M的T4 DNA连接酶(Vazyme N103)和2μl 0.2M融合Sso7d-T4DNA连接酶进行接头连接,并对扩增、纯化后的文库进行Agilent 2100Bioanalyzer文库峰型检测、上机测序。
结果分析
如图6A-B为10000个细胞投入量的文库产出结果,比较使用常规的T4DNA连接酶(图6A-B中T4 DNA Ligase)进行接头连接获得的文库产物与融合Sso7d-T4 DNA连接酶(即图6A-B中Sso-T4 DNA Ligase)进行接头连接获得的文库产物,通过Sso7d-T4 DNA连接酶构建的文库产物中150-300bp小片段文库占比高达53%。
如图7,Sso7d-T4 DNAligase组,提高了Cut&Run技术的性能,靶点signal值越高,代表富集程度越好,信噪比越高,通过Sso7d-T4 DNA ligase,10000细胞投入组将CTCF信号值由80提升至175,100细胞投入组将CTCF信号值由14提升至60。
实施例5
以转录因子CTCF蛋白、组蛋白H3k27me3为靶标蛋白(使用CellSignalingTechnology公司Cat.No.9733产品为靶标抗体),每个靶标蛋白按照实施例1-3的方法对2份10000个细胞和2份100个细胞的样本,每两份相同细胞量样本进行Cut&Run染色质片段化后混匀,混匀后分为2等份,每份分别用纯化缓冲液6与融合Sso7d-T4 DNA连接酶组合使用构建文库、纯化缓冲液7与常规T4 DNA连接酶组合使用构建文库,研究优化纯化缓冲液与融合Sso7d-T4 DNA连接酶组合使用对文库构建及测序结果的影响。
结果分析
如图8A-B,其中“普通Buffer”指纯化缓冲液7,“优化Buffer”指即纯化缓冲液6,heatmap图显示,纯化缓冲液6与融合Sso7d-T4 DNA连接酶(即图8A-B中Sso-T4 DNALigase)组合使用提高了CTCF与H3K27me3靶点signal信号值,signal信号值越高代表富集程度越好,信噪比越高,说明相比于纯化缓冲液7与常规T4 DNA连接酶(即图8A-B中T4 DNALigase)组合使用,纯化缓冲液6与融合Sso7d-T4 DNA连接酶组合使用提高了Cut&Run测序的质量,并且在低细胞起始量下(100细胞投入量)时也能展示出较好的性能。
如图9A-B,其中“普通Buffer”指纯化缓冲液7,“优化Buffer”指即纯化缓冲液6,IGV信号图显示,纯化缓冲液6与融合Sso7d-T4 DNA连接酶(即图9A-B中Sso-T4 DNALigase)组合使用提高了CTCF、H3k27me3靶点Cut&Run测序的质量,并且在低细胞起始量下(100细胞投入量)时也能展示出较好的性能。
Claims (26)
1.一种连接核酸片段与接头的方法,所述方法包括使用Sso7d-T4DNA连接酶连接核酸片段与接头。
2.权利要求1所述的方法,所述的核酸片段为双链核酸;优选地,所述双链核酸为双链DNA、双链RNA和/或DNA-RNA杂交双链。
3.权利要求1所述的方法,所述核酸片段的3’末端包含突出的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸或所述核酸片段的两端为平末端,所述接头为平端接头、Y型接头或泡状接头。
4.权利要求1所述的方法,所述Sso7d-T4DNA连接酶是融合蛋白或蛋白质复合物,所述蛋白质复合物通过连接物体外连接Sso7d蛋白和T4DNA连接酶获得。
5.权利要求1所述的方法,所述Sso7d-T4DNA连接酶包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的方法,所述核酸片段大小为50-500bp;优选地,所述核酸片段大小为150-300bp。
7.权利要求1所述的方法,所述Sso7d-T4DNA连接酶在反应体系的浓度为1-10mM;优选2-6mM;更优选3-5mM。
8.一种构建核酸文库的方法,所述方法包含:
收集核酸样本,并对所述核酸样本进行打断获得片段化的核酸;
任选地,纯化片段化的核酸;
对所述片段化的核酸进行末端修复得到核酸片段;
使用权利要求1-7任一项所述的方法连接所述核酸片段和接头;
任选地,对连接产物进行纯化;
任选地,扩增连接产物;
任选地,对扩增产物进行纯化。
9.权利要求8所述的方法,所述末端修复包括对所述片段化的核酸的末端进行补平。
10.权利要求9所述的方法,所述末端修复还包括在所述片段化的核酸的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
11.权利要求8所述的方法,所述核酸样本是双链DNA、双链RNA、DNA-RNA杂交双链、单链DNA和/或单链RNA;当所述样本是单链DNA时,所述方法还包括通过随机引物获得双链DNA的步骤;当所述样本是单链RNA时,所述方法还包括逆转录的步骤。
12.一种构建研究蛋白质-DNA互作的文库的方法,所述方法包含:
收集样本,所述样本为细胞、透化的细胞、染色体和/或染色质;
将靶蛋白结合抗体与所述样本进行孵育,所述靶蛋白结合抗体与靶蛋白结合;
加入核酸酶对目标DNA进行片段化得到DNA片段,所述核酸酶上连接有能够结合所述靶蛋白结合抗体的结合物,所述目标DNA位于所述靶蛋白的附近;优选地,所述靶蛋白结合抗体的结合物为ProteinA、ProteinG或ProteinAG,更优选ProteinAG;
任选地,纯化所述DNA片段;
对纯化或未纯化的DNA片段进行末端修复;
使用权利要求1-7任一项所述方法,连接所述DNA片段与接头;
任选地,对接头连接产物进行纯化;
任选地,对接头连接产物或其纯化产物进行扩增;
任选地,对扩增产物进行纯化。
13.权利要求12所述的方法,包括对所述细胞进行透化或穿孔处理。
14.权利要求12所述的方法,所述靶蛋白是转录因子或组蛋白;优选地,所述组蛋白选自H3k27me3、H3K4me3、H3K27ac、H3K4me1、H3K4me2、H2A和/或Abf1的至少一种;优选地,所述转录因子选自CTCF和/或Reb1的至少一种。
15.权利要求12所述的方法,所述细胞至少为100个。
16.权利要求12所述的方法,所述末端修复包括对所述片段化的核酸的末端进行补平。
17.权利要求16所述的方法,所述末端修复还包括在所述片段化的核酸的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
18.一种组合物,包含异丙醇、异硫氰酸胍、泊洛沙姆、吐温20和SDS。
19.权利要求18所述的组合物,其中,
所述异丙醇的体积分数为25%-95%,优选40%-90%;
所述异硫氰酸胍的浓度为10-30M,优选10-20M;
所述泊洛沙姆的浓度为1%-15%,优选1%-10%;
所述吐温20的浓度为0.1%-1%,优选0.1%-0.5%;
所述SDS的质量浓度为0.1%-2%,优选0.2%-1%。
20.权利要求18所述的组合物,其中,所述组合物中含有15M异硫氰酸胍、4%泊洛沙姆、0.2%吐温20、0.6%SDS和40%-90%异丙醇;优选40%异丙醇;优选50%异丙醇;优选60%异丙醇;优选70%异丙醇;优选80%异丙醇;更优选90%异丙醇。
21.权利要求18-20任一项所述组合物在核酸纯化中的应用。
22.权利要求18-20任一项所述组合物在权利要求1-17所述方法中用于纯化的用途。
23.一种试剂盒,其包含Sso7d-T4DNA连接酶及其反应缓冲液、核酸片段化试剂和末端修复试剂,其中,所述反应缓冲液能够使所述Sso7d-T4DNA连接酶发挥其连接活性。
24.权利要求23所述的试剂盒,其还包含核酸纯化试剂、接头和扩增试剂中的至少一种,其中,
所述核酸纯化试剂优选权利要求18-20所述的组合物;
所述接头为平端接头、Y型接头或泡状接头;
扩增试剂例如扩增用聚合酶和反应缓冲液。
25.权利要求23所述的试剂盒,所述Sso7d-T4DNA连接酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
26.权利要求23所述的试剂盒在权利要求1-17所述方法中的应用。
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