CN113444768A

CN113444768A - 一种检测染色体互作的方法

Info

Publication number: CN113444768A
Application number: CN202110682552.5A
Authority: CN
Inventors: 唐忠辉; 吴霞; 谢梓莹; 熊丹
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-06-18
Also published as: CN113444768B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种检测染色体互作的方法。方法包括以下步骤：在细胞中进行原位邻近连接反应并用生物素标记连接位置；将多种抗体‑Tn5‑标签序列复合体与邻近连接后的细胞共孵育，抗体将Tn5靶向结合至目标蛋白附近的DNA上，激活Tn5酶切目标蛋白附近的DNA并同时接入含各抗体对应标签序列的接头序列；经生物素富集，分离出含有和不含有生物素标记的DNA，分别扩增、建库，测序和分析。本发明可以同时检测多个目标蛋白各自单独介导形成的染色质互作，并区分不同蛋白两两组合共同介导形成的染色质互作。

Description

一种检测染色体互作的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测染色体互作的方法。

背景技术

染色质相互作用在基因组功能中的重要性一直备受关注。目前，研究染色质相互作用的技术主要有两大类：分子探针技术和分子相互作用图谱(molecular interactionmapping)技术，利用这些技术能够捕获染色质点与点之间或多点之间的相互作用。这些方法广泛检测所有蛋白因子介导的染色质互作，或者针对性地检测单一目标蛋白介导形成的染色质互作。

Fullwood等2009年11月在《Nature》上发表文章提出了一项能够分析全基因组染色质相互作用的新技术-配对末端标签测序分析染色质相互作用(ChIA-PET)技术。随着科学的发展，ChIA-PET技术随之也在不断地改进，改进后的原位ChIA-PET技术的流程是：交联后的细胞经过细胞膜透化后利用限制性内切酶AluI将染色质DNA片段化得到平末端；使用Klenow大片段在DNA平末端的3’端加上碱基A(A-tailing)；通过连接酶将DNA末端与两端的5’位置均带有T碱基且同时带有生物素(biotin)标记的寡聚脱氧核糖核苷酸片段(bioitn-linker)相连，如此，在空间上相近的两个DNA末端即可通过同一条linker序列连接在一起；通过超声破碎将细胞核打破释放染色质；使用靶蛋白质特异的抗体将目标蛋白质及其相连的染色质一起通过免疫共沉淀(ChIP)捕获下来；纯化DNA后用转座酶Tn5进一步打断DNA的同时加上测序文库接头序列(adapter)；使用M280磁珠富集带有生物素标记的DNA序列；直接在磁珠上进行文库扩增同时添加文库索引；使用二代测序进行2x150bp测序；分析数据得到目标蛋白质介导的染色质互作信息。ChIA-PET技术本质上依赖于邻近连接和抗体特异靶向的免疫共沉淀，可以针对某一单独的目标蛋白介导形成的染色质互作进行检测，得到染色质环水平的互作信息，它灵敏，准确，对在全基因组范围内研究染色质相互作用具有重大意义。

目前已有的三维染色质构象捕获技术存在一些缺陷。原始的Long-read ChIA-PET可以高质量地检测目标蛋白介导的染色质三维互作图谱，同时获得高质量的目标蛋白结合图谱，但是每个样品往往需要高达上亿数量级的细胞。原位ChIA-PET将对细胞数量的需求降低到了千万级别，也可以高质量地检测目标蛋白介导的染色质互作图谱，但其检测到的目标蛋白的结合图谱质量不够清晰，往往需要额外进行ChIP-seq实验来获得相关信息。这些缺陷在很大程度上使这些技术仅能限制性地应用于细胞量足够大的样品，比如使用模型动物或细胞系来进行实验。在样品数量有限的情况下(比如来自病人的肿瘤标本等)，研究者往往无法应用这些技术进行研究。此外，ChIA-PET技术高度依赖免疫共沉淀，需要使用的抗体量比较大，价格昂贵；实验流程耗时长，往往需要一周才能完成测序文库的构建。更重要的是，上述技术仅能检测单独一种目标蛋白介导的染色质互作，不能同时检测多种蛋白质介导的染色质互作信息，更不能探测不同蛋白质以组合状态介导的染色质互作。但是，细胞内的生理活动往往是由多种蛋白质合作共同进行的，包括染色质互作。不同蛋白质组合可能介导不同的染色质互作，并可能在不同的生理活动(形成一定的染色质结构、调控基因表达等活动)中发挥不同功能。因此，这些技术对于三维染色质互作的认识的深入程度比较有限。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种检测染色体互作的方法，本发明的方法(命名为ChIA-Tag)可以同时检测多个目标蛋白各自单独介导形成的染色质互作，并区分不同蛋白两两组合共同介导形成的染色质互作。此外，还可以同时检测这些蛋白单独结合在染色质上的位置信息和两两组合在染色质上共定位的信息。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种检测染色体互作的方法，包括以下步骤：

1)对经过交联或未经交联的细胞进行细胞膜透化，利用限制性内切酶将细胞内的染色质DNA进行片段化，得到平末端；

2)在片段化后的染色质DNA平末端的3’末端加A碱基，然后与带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段进行邻近连接，使空间上邻近的染色质DNA连接在同一寡聚脱氧核糖核苷酸片段的两端，生物素标记了邻近连接的位置；

3)将目标蛋白的抗体、pA-Tn5和含标签序列的接头序列混合形成抗体-Tn5-标签序列复合体；一种抗体对应一组标签序列；

4)将多种抗体-Tn5-标签序列复合体与邻近连接后的细胞共孵育，Tn5分别靶向结合至各抗体目标蛋白附近的染色质DNA上；通过tagmentation反应，对目标蛋白附近的染色质DNA进行酶切的同时接入含各抗体对应标签序列的接头序列；

5)经生物素富集，分离出含有生物素标记的DNA和不含有生物素标记的DNA，分别扩增、建立测序文库，测序并分析测序结果；

目标蛋白附近的染色质DNA是以结合在目标蛋白抗体上的pA为球心，在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内的染色质DNA，主要是抗体标记的目标蛋白所在的染色质DNA。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述含标签序列的接头序列包含完整测序文库两端的接头序列。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述含标签序列的接头序列为混合序列I或混合序列II。

更优选地，所述混合序列I为序列1分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3退火互补配对组装形成的接头序列A和接头序列C等比例混合形成，混合序列II为序列1分别与SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4退火互补配对组装形成的接头序列B和接头序列D等比例混合形成。

更优选地，接头序列A、B、C和D为序列1分别和SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4退火互补配对组装形成；SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为测序文库N5端完整序列，SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4为测序文库N7端完整序列。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.4所含标签序列的碱基序列分别为tagatcgc、ctctctat、tcgcctta、ctagtacg，也可为其他任意不同的测序索引序列；组成混合序列I的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3可使用相同索引序列，组成混合序列II的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4也可使用相同索引序列，但是混合序列I和混合序列II不可含有同一索引序列

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述序列1为Phos-CTGTCTCTTATACACATC-NH2。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述步骤3)中，先将pA-Tn5和含标签序列的接头序列孵育形成pA-Tn5-标签序列复合体，再将目标蛋白的抗体与pA-Tn5-标签序列复合体孵育形成抗体-Tn5-标签序列复合体，不同目标蛋白的抗体与含有不同标签序列的pA-Tn5-标签序列复合体孵育，一组标签序列对应一种抗体。pA-Tn5也可改用为pG-Tn5。

优选地，所述步骤3)中抗体的分子数量与pA-Tn5的分子数量之间的比例应在1：1到1：2之间，尽量接近1：2为优。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述步骤4)中，同时加入多种目标蛋白(目标蛋白的个数至少为两个)的抗体-Tn5-标签序列复合体，一组标签序列对应一种抗体及其识别的目标蛋白。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，所述步骤1)中细胞的使用量为10⁵～10⁶。

与现有ChIA-PET技术需要的细胞量(10⁷-10⁸)相比，本发明方法仅需要10⁵～10⁶细胞即可开展实验，大幅度降低细胞用量，可以将三维染色质构象捕获技术的应用范围拓展到细胞量有限的样本，如临床标本。

更优选地，所述步骤1)中细胞的使用量为10⁶。

优选地，所述寡聚脱氧核糖核苷酸(linker)片段的正向链为5'-/5Phos/CGCGATATC/iBIOdT/TATCTGACT-3'，带有生物素标记；反向琏为5'-/5Phos/GTCAGATAAGATATCGCGT-3')；寡聚脱氧核糖核苷酸片段的序列不仅限于此，能够实现本发明的技术效果均可使用。

优选地，所述限制性内切酶包括为AluI内切酶，但不仅限于本发明所公开的限制性内切酶。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，酶切后的染色质DNA在3’端加A碱基后与带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段(linker)连接，空间上邻近的染色质DNA与同一寡聚脱氧核糖核苷酸片段相连，生物素标记了邻近连接发生的位置。

作为本发明所述检测染色体互作的方法的优选实施方式，tagmentation反应后根据有无生物素标记将DNA进行分离。

将目标蛋白的抗体、pA-Tn5和含标签序列的接头序列形成抗体-Tn5-标签序列复合体，一种抗体对应一组标签序列；将多种抗体-Tn5-标签序列复合体与邻近连接后的细胞共孵育，使得Tn5靶向结合到各自目标蛋白附近的染色质上，对目标蛋白附近的DNA进行酶切的同时接入带有各抗体对应的特异标签的接头序列。只有目标蛋白附近被靶向酶切的DNA才带有能被扩增的接头序列，不同的目标蛋白带有不同抗体各自对应的标签；目标蛋白附近的(可被扩增的)DNA中，只有发生邻近连接的DNA才带有生物素标记，没有生物素标记的DNA含有这些目标蛋白的结合位置信息。

本发明可以同时检测多种不同蛋白质分别介导的三维染色质互作图谱和不同蛋白两两组合合作介导的三维染色质互作信息；该方法还可以在同一样本中同时检测不同蛋白各自在基因组上的结合位点和两两组合在基因组上的共定位信息。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)与ChIA-PET技术(仅能检测单独一种目标蛋白介导的染色质互作)相比，本发明的方法(命名为ChIA-Tag)可以同时检测多个目标蛋白介导的染色质互作，包括这些目标蛋白各自单独介导形成的染色质互作和不同蛋白两两组合共同介导形成的染色质互作，有助于更深层次理解染色质互作图谱；

2)本发明的方法可以同时检测多种蛋白质各自在基因组上的结合位置，并且可以得到这些蛋白在基因组上两两组合共定位的图谱；

3)本发明的方法大幅度降低细胞用量(10⁵～10⁶)，并且本发明的方法还降低了90％以上的抗体使用量，需要使用的试剂耗材更少，实验流程更为简洁有效，大幅降低了实验费用并缩短了实验时长。

附图说明

图1为本发明的方法(ChIA-Tag)实验原理和流程图；

图2为经过限制性内切酶酶切后的DNA长度和经过邻近连接反应后的DNA长度变化图；

图3为本发明的方法的结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种检测染色体互作的方法，包括以下步骤：

1)用0.55％SDS对经过甲醛交联的细胞进行细胞膜透化(或用0.5％Triton-X100对未经交联的细胞进行细胞膜透化)，利用限制性内切酶(例如AluI，不仅限于此)在细胞核内原位进行染色质DNA片段化得到平末端，酶切反应37℃过夜，具体条件如表1所示；

2)用Klenow大片段在片段化后的染色质DNA 3’末端加A碱基(A-tailing)，37℃反应1小时，具体条件如表2所示；然后与带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段(linker；正向链：5'-/5Phos/CGCGATATC/iBIOdT/TATCTGACT-3'；反向琏：5'-/5Phos/GTCAGATAAGATATCGCGT-3')进行邻近连接反应，室温反应1小时，然后16℃过夜继续进行连接反应，具体条件如表3所示；

3)序列1分别和SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4退火互补配对组装形成接头序列A、接头序列B、接头序列C和接头序列D；混合序列I由接头序列A和接头序列C等比例混合构成，混合序列II由接头序列B和接头序列D等比例混合构成，序列具体如表4所示；先将pA-Tn5和含标签序列的混合序列I或II孵育形成pA-Tn5-标签序列复合体(具体条件如表5所示，30℃1h)，再将不同目标蛋白(factor A或factor B)的抗体分别与带有不同标签序列(混合序列I或II)的pA-Tn5-标签序列复合体孵育，形成带有不同标签序列的抗体-Tn5-标签序列复合体A和抗体-Tn5-标签序列复合体B(具体条件如表6-7所示，常温，1h)；

接头序列组装反应条件为：用annealing buffer(诺唯赞)将接头序列1和2溶解到100μM，等体积(10μL)混合，60℃温浴10min，降温至50℃温浴10min，然后降温至40℃温浴10min，最后降温至25℃温浴30min，降温速度0.1℃/s。在本发明中，标签序列不仅限于此。

4)将抗体-Tn5-标签序列复合体A缓冲液(50μL)和抗体-Tn5-标签序列复合体B缓冲液(50μL)与邻近连接、离心后的细胞沉淀混合均匀共孵育(例如常温孵育2h或4℃过夜)，抗体特异性结合到到各自目标蛋白上，使与抗体相连的带有不同标签序列的Tn5靶向结合至各抗体目标蛋白(factor A和factor B)附近的染色质DNA(pA与Tn5之间由36个氨基酸连接，目标蛋白附近的染色质DNA是以通过抗体结合在目标蛋白上的pA为球心，在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内的染色质DNA)上；将孵育后的细胞离心，用Tagmentation buffer(1x，100μL)重悬细胞置于37℃下反应1h，使Tn5对目标蛋白附近的DNA进行酶切的同时接入含各抗体对应的特异标签序列的接头序列；终止Tagmentation反应，并释放DNA，65℃孵育4小时或过夜(具体条件如表8所示)；或者不进行纯化，改用Triton X-100中和SDS。

5)经生物素磁珠富集，分离出含有生物素标记的DNA和不含有生物素标记的DNA，分别进行扩增、建立测序文库、测序并分析数据(图1)。

表1

试剂	体积(μL)
		透化后的细胞(10<sup>6</sup>)	50
酶切buffer(10x)	10
		限制性内切酶AluI(NEB)100U/μL	3
H<sub>2</sub>O	37
		总体积	100

表2

试剂	体积(μL)
		酶切后的细胞(10<sup>6</sup>)	100
BSA 20％	1.2
		10x CutSmart buffer(NEB)	2
dATP 100mM(NEB)	1.2
		Klenow(exo-)	1.2
H<sub>2</sub>O	14.4
		总体积	120

表3

表4

表5

试剂	体积(μL)
		5μg pA-Tn5(诺唯赞)	10
混合序列I或混合序列II	1.75
		Coupling buffer(诺唯赞)	7
总体积	18.75

表6

表7

表8

试剂	体积(μL)
		Tagmentation反应体系	100
0.5M EDTA	1
		10％SDS	1
蛋白酶K(20mg/mL)	3
		总体积	105

在本实施例中，细胞的使用量为10⁶。细胞可以为B淋巴细胞，还可以为其他，不仅限于此；抗体的使用量根据采用的目标蛋白进行合理调整。

参考图2，经过限制性内切酶酶切后的DNA长度(深灰色、下面一条线)相比，经过邻近连接反应后的DNA长度(浅灰色、上面一条线)明显变长，表明其连接效果较佳。

因此对测序结果进行生物信息学分析后，将从含有生物素标记的DNA中得到目标蛋白质介导的三维染色质互作信号，其中1)两端仅带有同一抗体对应标签序列的测序数据代表对应目标蛋白(factor A或factor B)单独介导形成的三维染色质互作，2)两端带有不同抗体对应标签序列的测序数据代表这两种标签对应的两种目标蛋白质组合(factor A和factor B)共同介导形成的三维染色质互作图谱。从不含生物素的DNA中可以同时检测得到多种目标蛋白(factor A或factor B)在基因组上的结合图谱，其中3)两端带有相同抗体对应标签序列的测序数据代表对应目标蛋白(factor A或factor B)单独在基因组上的结合位置信息，4)两端带有不同抗体对应标签序列的测序数据代表这两种标签对应的两种目标蛋白质(factor A和factor B)在基因组上共定位的位置信息。进一步分析2)和4)的数据，可以得到不同蛋白质组合(factor A和factor B)在基因组中的共定位结合信息及其共同介导的三维染色质互作的位置、结构和功能特点，进一步了解不同蛋白质组合介导的染色质互作在基因表达调控中等生理活动中发挥的作用。

与ChIA-PET相比，本发明的方法(ChIA-Tag)将pA-Tn5与带有标签序列的接头序列结合后再使之结合到抗体上，形成抗体-Tn5-标签序列复合体，从而使每种抗体带上特定的标签序列。在进行邻近连接反应后的细胞核内同时孵育多种带有各自标签序列的抗体-Tn5-标签序列复合体，不同抗体特异识别并结合到各自的目标蛋白上，将与之相连的带有标签序列的Tn5仅能靶向结合到各抗体目标蛋白附近的DNA上；Tn5将目标蛋白附近的DNA片段化的同时加入与目标蛋白抗体对应的标签序列；纯化DNA后分离带有生物素的发生了邻近连接反应的DNA和不带生物素的DNA分别构建文库测序并进行数据分析，将序列信息对应相应的目标蛋白。因此，本发明可以通过一次实验得到不同蛋白质以单独/组合形式在基因组中的结合信息，及其这些目标蛋白单独/共同介导的三维染色质互作的位置、结构和功能特点，进一步了解不同蛋白质组合介导的染色质互作在基因表达调控等生理功能中发挥的作用(参考图3)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种检测染色体互作的方法

<130> 2021.06.04

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> Primer B1

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Primer B2

<400> 2

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> Primer C1

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> Primer C2

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatctagta cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

Claims

1.一种检测染色体互作的方法，其特征在于，包括以下步骤：

目标蛋白附近的染色质DNA是以结合在目标蛋白抗体上的pA为球心，在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内的染色质DNA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含标签序列的接头序列包含完整测序文库两端所需的接头序列。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含标签序列的接头序列为混合序列I或混合序列II。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合序列I为序列1分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3退火互补配对组装形成的接头序列A和接头序列C等比例混合形成，混合序列II为序列1分别与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4退火互补配对组装形成的接头序列B和接头序列D等比例混合形成。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所含标签序列的碱基序列分别为tagatcgc、ctctctat、tcgcctta、ctagtacg，也可为其他任意不同的测序索引序列；组成混合序列I的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3可使用相同索引序列，组成混合序列II的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4也可使用相同索引序列，但是混合序列I和混合序列II不可含有同一索引序列。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述序列1为Phos-CTGTCTCTTATACACATC-NH2。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，先将pA-Tn5和含标签序列的接头序列孵育形成pA-Tn5-标签序列复合体，再将目标蛋白的抗体与pA-Tn5-标签序列复合体孵育形成抗体-Tn5-标签序列复合体，不同目标蛋白的抗体与含有不同标签序列的pA-Tn5-标签序列复合体孵育，一组标签序列对应一种抗体。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，同时加入多种目标蛋白的抗体-Tn5-标签序列复合体，一组标签序列对应一种抗体及其识别的目标蛋白。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白的个数至少为两个。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中细胞的使用量为10⁵～10⁶。