JP2007289152A - 核酸相互作用分析 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】DNA/蛋白質/DNA複合体の結合されているDNAフラグメントをリンカー配列によって連結する。リンカー配列は制限酵素切断部位を含む。蛋白質複合体を架橋により固定後制限酵素でリンカーを切断する。そして遊離した末端をタグとして塩基配列の解析を行なう。
【選択図】 図2
Description
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグおよび第2のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入する工程と、
(ii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の各制限部位を第1のポリヌクレオチドの5’末端および第2のポリヌクレオチドの3’末端に付加する工程と、
(iii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
(iv)切断フラグメントをライゲーションして、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程(ii)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位がアダプターの一部またはベクターの一部である、工程と
を含む。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
(d)第1のタグおよび第2のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも2つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも2つのポリヌクレオチドを検出および/または同定する工程と
を含む方法を提供する。
制限酵素−制限酵素(または制限エンドヌクレアーゼ)は、二本鎖DNAを切断する酵素である。この酵素は、2つの切り込み(塩基を損傷することなく二重らせんの各リン酸骨格に1つ)を作製する。酵素に切断された化学結合は、その末端が相補的であれば、リガーゼとして知られる他の酵素によって再形成することができ、これにより異なる染色体または遺伝子から得た制限フラグメントを互いにつなぎ合わせることができる。II型酵素は、特定の核酸配列を認識し、その認識配列部位の近くまたは内部の定義された位置でDNAを切断する。これらにより、個別の制限フラグメントおよび異なるゲルバンドパターンが得られる。IIs型酵素は、その認識配列の外側の一方を切断する。MmeIにより、ほとんどのIIs型制限酵素と同様に、長さが異なる末端が得られる。Dunn etal,2002は、MmeIがおよそ1:1の比で18/20または19/21塩基を切断することができることを示した。全図中に示した配列は、それぞれMmeIを使用した1つの共通の変異形(variant)を示す。
本発明は、核酸複合体、特に、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも1つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定、および/または調製する新規の方法に関する。特に、本発明の方法は、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも2つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定、および/または調製する方法を提供する。本発明はまた、オリゴヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドのコンカテマーを提供する。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグおよび第2のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入する工程と、
(ii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、およびリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含むことができる。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の各制限部位を第1のポリヌクレオチドの5’末端および第2のポリヌクレオチドの3’末端に付加する工程と、
(iii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
(iv)切断フラグメントをライゲーションして、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程
とを含むことができる。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
(d)配列に基づいて少なくとも2つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも2つのポリヌクレオチドを検出および/または同定する工程と
を含む方法を提供する。
核酸−タンパク質複合体を、クロマチン免疫沈降(ChIP)によって得ることができる。
ChIPを使用して富化し、それにより、ヒストンおよび核酸−タンパク質複合体中の核酸に結合することができる他のタンパク質などの特定のタンパク質と会合するゲノム領域を同定可能である(Tavermer et al.,Genome Biol.2004.5(3):p.210に概説)。タンパク質をその相互作用部位でDNAと架橋することを目的とする。培養物中の生きた細胞へのホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはメタノールなどの適切な固定液の直接添加によってこれを迅速且つ有効に行う。
本出願の目的のために、タグは、核酸分子から得られたヌクレオチド配列またはサインであり、タグが得られるか由来するポリヌクレオチドに相当する。収縮するか相当することが意図されるポリヌクレオチドは、RNA、mRNA、ゲノムDNA、全長cDNA、またはcDNAであり得る。
特に、各リンカーは、少なくとも1つの第1の制限部位および少なくとも1つの第2の隣接制限部位を少なくとも含むことができる。したがって、各リンカー中に存在する制限部位数は、1つまたは複数、好ましくは、2つであり得る。制限部位は、非対称の制限部位であり得る。非対称の制限部位の例は、ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位およびいくつかのII型(またはクラスII)認識部位である。その認識部位の片側を切断するIIs型制限酵素が好ましい。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグおよび第2のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入する工程と、
(ii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の各制限部位を第1のポリヌクレオチドの5’末端および第2のポリヌクレオチドの3’末端に付加する工程と、
(iii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
(iv)切断フラグメントをライゲーションして、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程(ii)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位がベクターの一部である工程と
を含む。
(a)核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
(b)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
(c)オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
(d)第1のタグおよび第2のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも2つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも2つのポリヌクレオチドを検出および/または同定する工程と
を含む方法を提供する。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入する工程と、
(ii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の各制限部位を第1のポリヌクレオチドの5’末端および第2のポリヌクレオチドの3’末端に付加する工程と、
(iii)第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
(iv)切断フラグメントをライゲーションして、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程(ii)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位がアダプターの一部またはベクターの一部である工程と
を含む。
CIA−PET法(図1および4)では、DPD複合体中のタンパク質によって繋留されたDNAフラグメントを、ライゲーションを介してリンカー配列によって連結する。リンカー配列は、2つのMmeI部位を含む。逆(reversal)架橋後、ライゲーションしたDNAをMmeIで消化して、対合末端ジタグを放出させる(CIA−PET)。各CIA−PETは、2つの隣接タグ(それぞれ約20bp)を有するリンカーを含む(図1の工程2)。したがって、CIA−PET中に含まれる2つのタグは、線状ゲノム配列中で互いに離れているが、互いに相互作用し、ヒストンタンパク質などの特定のタンパク質によって媒介される2つの遠位遺伝子領域を示す。
CIA−diPET法(図2および6)では、2つの各関連DNAフラグメントを示す対合末端ジタグ配列を抽出および配列決定し、配列あたりたった1つのタグと比較する。そのようなものとして、得られたCIA−diPETは、CIA−PET法のタグよりも長いタグ配列を含む。当業者は、したがって、本発明のCIA検出法が当分野の他の方法よりもクロマチン相互作用のマッピングでより特異的であることを認識する。DPD複合体中のDNAフラグメントを、MmeI部位およびGsu1部位を含むリンカー配列によって連結する。逆架橋後、ライゲーションしたDNAを、超音波処理によって無作為に破壊する。
〔実施例〕
マウスES細胞(E14)中のNanog転写因子、NanogについてのChIP−PETデータ、および他の重要なES細胞転写因子(Oct4およびSox2など)を、本発明を実施するための生体系として使用した。ChIP−PETデータにより、これらの転写因子が結合する場所を示す線状マップが得られ、これを、クロマチン相互作用データを立証するための基準として使用する。クロマチン間の相互作用を、2つの方法(CIA−PETおよびCIA−diPET)によって検出した。
5’ GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’(31 nt)(配列番号1)
5’ GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGAC 3’(31 nt)(配列番号2)
5’末端をリン酸化する。
M&Gリンカー
5’ GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGT 3’(31 nt)(配列番号3)
5’ CTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACT 3’(31 nt)(配列番号4)
5’末端をリン酸化する。
P1鎖状体形成アダプター(PMR011)
5’ GGATCCCTTAATCGCCTTGCAGCACATC 3’(28 nt)(配列番号5)
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNN 3’(30 nt)(配列番号6)
上のアダプターの5’末端をリン酸化する。
下のアダプターの5’末端をリン酸化しない。
P2鎖状体形成アダプター(PMR012)
5’ GGATCCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(29 nt)(配列番号7)
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGGGGATCCNN 3’(31 nt)(配列番号8)
上のアダプターの5’末端をリン酸化する。
下のアダプターの5’末端をリン酸化しない。
D1 diPETingアダプター(PMR011)
5’ GGATCCCTTAATCGCCTTGCAGCACATC 3’(28 nt)(配列番号9)
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNN 3’(30 nt)(配列番号10)
上のアダプターの5’末端をリン酸化する。
下のアダプターの5’末端をリン酸化しない。
D2 diPETingアダプター(PMR012)
5’ GGATCCAATGCTCCTCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(39 nt)(配列番号11)
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGGGAGGAGCATTGGATCCNN 3’(41 nt)(配列番号12)
上のアダプターの5’末端をリン酸化する。
下のアダプターの5’末端をリン酸化しない。
PMR011プライマー
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAG 3’(22 nt)(配列番号13)
5’末端をリン酸化する。
PMR012プライマー
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(23 nt)(配列番号14)
5’末端をリン酸化する。
RecA選択オリゴ
5’ AGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGT 3’(配列番号15)
(ビオチニル化)
このベクターは、pGEMベクター(Promega)に由来し、以下の制限酵素のための固有の多クローニング部位をこの順序で含む。
BamH1→Mme1;切断領域;Gsu1→BamH1→BseR1
以下のオリゴヌクレオチドを使用する。
5’ AATTGGATCCGACTCGAGGATGAATTCTCCAGGATCCCTCCTC 3’(43 nt)(配列番号16)
5’ TCGAGAGGAGGGATCCTGGAGAATTCATCCTCGAGTCGGATCC 3’(43 nt)(配列番号17)
5’末端をリン酸化する。
このベクターの残りは、BseR1部位、BamH1部位、Mme1部位、またはGsu1部位のいずれも含まない。
5’NNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(69 nt)(配列番号20)
5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(69 nt)(配列番号21)
アダプター配列を有するM&MアダプターPET
5’GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(128 nt)(配列番号22)
5’ AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNA GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNN NNNNNNNNNN GGATCCCTTA ATCGCCTTGCAGCACATC 3’(128 nt)(配列番号23)
M&M最終PET(アダプター配列の切断後)
5’GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG (77 nt)(配列番号24)
5’ GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG 3’(77 nt)(配列番号25)
超音波処理後のM&GアダプターDNA配列
5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(配列番号26)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCG TACGGCCG CCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(配列番号27)
(種々のnt)
pGIS8プラスミドへのクローニング後のM&GアダプターDNA配列
(注釈:残りのプラスミドは示さず)
5’GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号28)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号29)
M PET中間体
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(132 nt)(配列番号30)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(132 nt)(配列番号31)
MおよびG diPET
5’ ATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(116 nt)(配列番号32)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNGTCGGATC 3’(116 nt)(配列番号33)
BamH1粘着末端を有する放出diPET
5’ GATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNCTCCAG 3’(111 nt)(配列番号34)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTA CGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCG 3’(111 nt)(配列番号35)
MmeI消化前のM&MアダプターPET
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(91 nt)(配列番号 36)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCAGCCTCCGGTTCCGCCGGCATGCAGGTTGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(91 nt)(配列番号37)
M&Gリンカーの挿入前の図8のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(53 nt)(配列番号38)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(53 nt)(配列番号39)
プラスミドに挿入した図8のオリゴヌクレオチド(残りのプラスミドは示さず)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’
(140 nt)(配列番号40)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号41)
プラスミドに挿入した図8のオリゴヌクレオチド(残りのプラスミドは示さず)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号42)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号43)
電気泳動によって除去された挿入M&Gリンカーを含まない図8のオリゴヌクレオチド
5’ GATCCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(112 nt)(配列番号44)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCG 3’(112 nt)(配列番号45)
M&Gリンカーの挿入前の図9のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(59 nt)(配列番号46)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(59 nt)(配列番号47)
M&Gリンカーの一部の挿入後の図9のオリゴヌクレオチド
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号48)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号49)
制限酵素消化後に挿入された部分的M&Gリンカーを有する図9のオリゴヌクレオチド(残りのプラスミドは示さず)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(126 nt)(配列番号50)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(126 nt)(配列番号51)
プラスミドからの切り出し後の図9のオリゴヌクレオチド
5’ GATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(120 nt)(配列番号52)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCG 3’(120 nt)(配列番号53)
逆方向に挿入されたM&Gリンカーを有する図10のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(85 nt)(配列番号54)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(85 nt)(配列番号55)
プラスミドに挿入した図10のオリゴヌクレオチド(残りのプラスミドは示さず)
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(148 nt)(配列番号56)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(148 nt)(配列番号57)
図10のオリゴヌクレオチド中間体1
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(62 nt)(配列番号58)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(62 nt)(配列番号59)
図10のオリゴヌクレオチド中間体2
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(62 nt)(配列番号60)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(62 nt)(配列番号61)
図10のオリゴヌクレオチド産物
5’ GATCCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(114 nt)(配列番号62)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCG 3’(114 nt)(配列番号63)
〔実施例1〕
CIA−PET法(図1および4)は、以下の5つの部を含む。(1)ChIP DNA−タンパク質−DNA複合体の生成、(2)CIA−PETの調製、(3)CIA−PETの増幅、(4)CIA−PETの配列決定、および(5)CIA−PET配列のマッピング(図3)。
(a)マウス胚幹(ES)細胞を、白血病阻害因子(Chemicon)の存在下での無支持細胞(feeder-free)条件で培養する。
c1.細胞を溶解緩衝液(50mM HEPES、1mM EDTA、0.15M NaCl、1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、全てAmbion)に溶解する。
c2.クロマチンを、Branson450超音波細胞破壊機(20%負荷出力、30秒、5〜8回)を使用した超音波処理によって可溶化する。
c3.クロマチンを10倍希釈し、SDSを0.1%に低下させる。
c4.次いで、抽出物を、14,000rpmにて4℃で10分間の遠心分離によって明澄化する。
c5.この抽出物を、使用するまで−80℃で保存する。
d1.2μgのモノクローナル抗体(F7、Santa Cruz)を、プロテインGセファロース(Pharmacia)に結合させる。
d2.抗体被覆ビーズを、クロマチン抽出物と4℃で16時間インキュベートする。
d3.次いで、ビーズを、以下の緩衝液を使用して洗浄する(Sigma Chemical Companyの試薬):
緩衝液1(50mM HEPES、1mM EDTA、0.15M NaCl、0.1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム)で2回洗浄する。
緩衝液2(50mM HEPES、1mM EDTA、0.5M NaCl、1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。
緩衝液3(20mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.25M LiCl、0.5% NP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。
緩衝液4(20mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA)で1回洗浄する。
d4.次いで、タンパク質−DNA複合体を、溶離緩衝液(50mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA、1%SDS)にて65℃で20分間ビーズから溶離する。
d5.次いで、溶離物を、PBS(Ambion)中にて4℃で3時間透析して、SDSを除去する。
(a)末端修復
Epicentre End-Itキットおよび以下の化学物質を使用して末端修復を行う。
クロマチン(5μgまで) 2.5μl
10×末端修復緩衝液 5μl
2.5mM dNTPミックス 5μl
10mM ATP 5μl
末端修復酵素ミックス 1μl
無ヌクレアーゼ水 50μlにする
短時間ボルテックスして混合し、次いで、室温で45分間インキュベートし、70℃で10分間の加熱によって反応を停止させる。27μlの無ヌクレアーゼ水の添加によって濃度を65ng/μlに調整する。
DNA 20μl
10mM dATP(Roche) 0.5μl
10×ExTaq緩衝液(Takara) 2.5μl
ExTaqポリメラーゼ(Takara) 0.5μl
無ヌクレアーゼ水 25μlにする
PCR装置中にて72℃で30分間インキュベートし、次いで、4℃にする。一旦72℃でインキュベートすると、その直後にチューブを取り出してライゲーションを行うのに最良である。
クロマチンDNA(200μg) 3.1μl
M&Mアダプター−Tテール(38ng) 3.1μl
5×PEG含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen) 6μl
T4リガーゼ(5U/μl)(Invitrogen) 1μl
無ヌクレアーゼ水 12.3μl
16℃で一晩ライゲーションして、M&Mリンカーを挿入したオリゴヌクレオチド(配列番号20および21)を得る。
DNAサンプルを20μlアリコートに分割し、15μlの20mg/mlプロテイナーゼK(Ambion)の存在下での65℃にて一晩のインキュベーションによって逆架橋する。翌日、1μlの10mg/ml RNAアーゼA(Qiagen)を添加し、RNAを37℃で45分間分解し、その後、DNAのフェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。20μlの溶離緩衝液中に再懸濁し、−20℃で保存する。得られた濃度は、通常、500ng/μlである。
10μgのDNA 20μl
10×NEBuffer4(New England Biolabs) 20μl
10×SAM(New England Biolabs) 20μl
Mme1(2U/μl)(New England Biolabs) 20μl
無ヌクレアーゼ水 120μl
2つのチューブに分割し、37℃で一晩インキュベートする。SAMを新たに調製すべきである。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行う。
得られたDNAを、適切なラダー(例えば、20μlのTakara広範囲ラダー)と共に、Scie-Plas中型ユニット(60μl/ウェル)中の2%アガロースゲルにロードする。80Vで約1.5時間泳動し、365nmのUVで視覚化する。不正確に挿入されたリンカーを有するオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動によって除去する(不正確に挿入されたリンカーの例は、図8〜10を参照のこと)。ジタグバンドを切り出し、製造者の説明書にしたがって使い捨てFermentas Eluta Tubesを使用して電気溶出する。90Vで1〜1.5時間電気溶出し、採取したジタグを、エタノール沈殿する。200μlの溶出液毎に、以下を添加する。
3M NaOAc(pH5.2)(Amresco) 20μl
1M MgCl2(Ambion) 4.5μl
グリコチューブ(Ambion) 2μl
100%エタノール 800μl
沈殿したジタグを、12μl溶離緩衝液(Qiagen)中に再懸濁し、純度チェックおよび視覚的定量のための低分子量ラダー(Invitrogen)と共に、4〜20%PAGEミニゲルで2〜5μlを泳動する。正確に得られたジタグは、配列番号22および23に示す配列を有する。
(a)アダプターライゲーション(配列番号5〜8のアダプターの鎖状体形成)
DNA(100ng) 6μl
アダプター(10μg) 6μl
10×リガーゼ緩衝液(スペルミジン含有) 1.5μl
T4 DNAリガーゼ(5U/μl、Invitrogen) 1μl
無ヌクレアーゼ水 0.5μl
総体積は15μlである。16℃で16時間インキュベートする。
10×スペルミジン含有ライゲーション緩衝液を以下から作製する。
60mM Tris−HCl(pH7.5)(Ambion)
60mM MgCl2(Ambion)
50mM NaCl(Ambion)
1mg/ml BSA(New England Biolabs)
70mM β−メルカプトエタノール(Sigma)
1mM ATP(Invitrogen)
20mM DTT(Invitrogen)
10mMスペルミジン(Sigma)
以下のプライマー(PMR11および12)(それぞれ、配列番号13および14)およびQiagenのHotstartaqキットを使用して増幅する。
DNA 1μl
10×PCR緩衝液(Qiagen) 10μl
dNTPミックス(各10mM)(Invitrogen) 2μl
PMR11 1μl(0.2μM)
PMR12 1μl(0.2μM)
HotStarTaqDNAポリメラーゼ(Qiagen) 0.5μl
無ヌクレアーゼ水 100μlにする
1.95℃で15分間
2.94℃で0.5分間
3.55℃で0.5分間
4.72℃で1分間
5.工程2を25回繰り返す
6.72℃で10分間
PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製する。
CIA−PETを、454多重配列決定装置(454 life sciences)のプロトコールにしたがって直接配列決定することができる。この技術は、Margulies et al(2005)および米国特許出願番号20030068629号に教示されている。これらの引例は、その全体が本明細書中で参照することにより組み込まれる。
Compressed Suffix Arrayを使用して、マッピングを行うことができる。2つの異なるDNAフラグメント(n>3)にわたる複数の連結を、実際の遠位調節領域を示すために利用するべきである(図3)。
〔実施例3〕
CIA−diPET法(図2および6)は、以下の部を含む。(1)ChIP DNA−タンパク質−DNA複合体の生成、(2)CIA−ライブラリーの調製、(3)CIA−PETライブラリーの調製、(4)配列決定、および(5)CIA−PET配列のマッピング(図5)。
(a)マウス胚幹(ES)細胞を、白血病阻害因子(Chemicon)の存在下での無支持細胞条件で培養する。
c1.細胞を溶解緩衝液(50mM HEPES、1mM EDTA、0.15M NaCl、1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、全てAmbion)に溶解する。
c2.クロマチンを、Branson 450超音波細胞破壊機(20%負荷出力、30秒、5〜8回)を使用した超音波処理によって可溶化する。
c3.クロマチンを10倍希釈し、SDSを0.1%に低下させる。
c4.次いで、抽出物を、14,000rpmにて4℃で10分間の遠心分離によって明澄化する。
c5.この抽出物を、使用するまで−80℃で保存する。
d1.2μgのモノクローナル抗体(F7、Santa Cruz)を、プロテインGセファロース(Pharmacia)に結合させる。
d2.抗体被覆ビーズを、クロマチン抽出物と4℃で16時間インキュベートする。
d3.次いで、ビーズを、以下の緩衝液を使用して洗浄する(Sigma Chemical Companyの試薬):
緩衝液1(50mM HEPES、1mM EDTA、0.15M NaCl、0.1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム)で2回洗浄する。
緩衝液2(50mM HEPES、1mM EDTA、0.5M NaCl、1%SDS、1%TritonX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。
緩衝液3(20mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.25M LiCl、0.5% NP40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。
緩衝液4(20mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA)で1回洗浄する。
d4.次いで、タンパク質−DNA複合体を、溶離緩衝液(50mM TrisHCl(pH8.0)、1mM EDTA、1%SDS)にて65℃で20分間ビーズから溶離する。
d5.次いで、溶離物を、PBS(Ambion)中にて4℃で3時間透析して、SDSを除去する。
(a)末端修復(CIA−PETの調製に関する)、Epicentre End-Itキットを使用して末端修復を行う。
クロマチン(5μgまで) 2.5μl
10×末端修復緩衝液(Epicentre) 5μl
2.5mM dNTPミックス(Epicentre) 5μl
10mM ATP(Epicentre) 5μl
末端修復酵素ミックス(Epicentre) 1μl
無ヌクレアーゼ水 31.5μl
短時間ボルテックスして混合し、次いで、室温で45分間インキュベートし、70℃で10分間の加熱によって反応を停止させる。27μlの無ヌクレアーゼ水の添加によって濃度を65ng/μlに調整する。
DNA 20μl
10mM dATP(Roche) 0.5μl
10×ExTaq緩衝液(Takara) 2.5μl
ExTaqポリメラーゼ(Takara) 0.5μl
無ヌクレアーゼ水 1.5μl
PCR装置中にて72℃で30分間インキュベートし、次いで、4℃にする。一旦72℃でインキュベートすると、その直後にチューブを取り出してライゲーションを行うのに最良である。
クロマチンDNA(200ng) 3.1μl
M&Gアダプター−Tテール(38ng) 7.6μl
5×PEG含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen) 6μl
T4リガーゼ(5U/μl)(Invitrogen) 1μl
最終体積 12.3μl
16℃で一晩ライゲーションして、M&Gリンカーを挿入したオリゴヌクレオチド(配列番号26および27)を得る。
DNAサンプルを20μlアリコートに分割し、15μlの20mg/mlプロテイナーゼK(Ambion)の存在下での65℃にて一晩のインキュベーションによって逆架橋する。翌日、1μlの10mg/ml RNAアーゼA(Qiagen)を添加し、RNAを37℃で45分間分解し、その後、DNAのフェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。20μlの溶離緩衝液中に再懸濁し、−20℃で保存する。濃度は、通常、500ng/μlである。
Nla IIIを、−80℃(半減期は、−80℃で6ヶ月)で保存する。使用直前に氷上に置く。
DNA(約1μg) 2μl
10×NEBuffer4(New England Biolabs) 5μl
NlaIII(New England Biolabs) 1μl
100×BSA(New England Biolabs) 0.5μl
無ヌクレアーゼ水 41.5μl
5つの上記反応チューブを調製する。37℃で1時間インキュベートする。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行い、10μlの溶離緩衝液(Qiagen)に再懸濁する。
DNA(5μgまで) 34μl
10×末端修復緩衝液(Epicentre) 5μl
2.5mM dNTPミックス(Epicentre) 5μl
10mM ATP(Epicentre) 5μl
末端修復酵素ミックス(Epicentre) 1μl
室温で45分間インキュベートし、70℃で10分間の加熱によって反応を停止させる。
1.7ml微量遠心管を使用して(複数のチューブを使用する)、氷上に準備する。
40ng/μl プレカットpGIS 1μl
DNA 6μl
5×PEG含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen) 2μl
T4 DNAリガーゼ(5U/μl)(Invitrogen) 1μl
16℃で一晩(12〜16時間)インキュベートして、配列番号28および29に示すオリゴヌクレオチドを得る。ベクター自己ライゲーションコントロールも準備する。
(a)Mme1切断
10μgのDNA 100μl
10×NEBuffer4(New England Biolabs) 20μl
10×SAM(New England Biolabs) 20μl
Mme1(2U/μl)(New England Biolabs) 12μl
無ヌクレアーゼ水 48μl
37℃で一晩インキュベートして、配列番号30および31に示すオリゴヌクレオチドを得る。SAMを、新たに調製すべきである。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行い、12μlの溶離緩衝液に再懸濁する。
以下(MJ Research)を含む各ウェルを有する96ウェルプレートを準備する。
100ngのDNA 50μl
ライゲーション溶液1(Takara Ligation Kit ver2) 50μl
プレートをしっかりと密封して蒸発を防ぐ。16℃で一晩インキュベートする。3つのカラムを使用してPCR精製(Qiagen)を行い、40μlの各溶離緩衝液に再懸濁し、総量が120μlになる。
9つのチューブを準備する
環状化DNA 12μl
10×TANGO緩衝液(Fermentas) 8.6μl
10×SAM(New England Biolabs) 8.6μl
GsuI(5U/μl)(Fermentas) 1μl
無ヌクレアーゼ水 55.8μl
30℃で少なくとも2時間消化させるが、一晩切断しない。配列番号32および33に示すオリゴヌクレオチドを得る。
以下を含む9つのチューブを準備する。
約100ngのDNA 50μl
ライゲーション溶液1(Takara Ligation Kit ver2) 50μl
16℃で一晩インキュベートする。フェノールクロロホルムエタノール沈殿を行い、12μlの溶離緩衝液に再懸濁する。
氷上で溶液を解凍する。以下を含む3〜4つのチューブを調製する。
2.5ngのDNA 1μl
Templiphi kitの変性緩衝液(Amersham) 10μl
95℃で3分間加熱し、その後、氷上で短時間冷却する。
Templiphi kitプレミックス(Amersham) 10μl
軽くたたくか穏やかにボルテックスして十分に混合する。震盪せずに30℃で16〜18時間インキュベートする。材料を、例えば、1μlのマイクロピペッティングによって試験する。材料は、粘性を示すはずである。ピコグリーン蛍光光度法(Quant-iT DNAアッセイキット、Molecular Probes)によって二本鎖DNAを定量する。
100μgのDNA 1μl
10×固有のBamH1緩衝液(New England Biolabs) 10μl
100×ウシ血清アルブミン(New England Biolabs) 1μl
BamH1(20U/μl;2倍過剰)(New England Biolabs) 20μl
無ヌクレアーゼ水 78μl
必要に応じて、DNAを消化するためのさらなるチューブを調製し、37℃で一晩インキュベートして、配列番号34および35に示すオリゴヌクレオチドを得る。
適切なラダー(例えば、20μlのTakara広範囲ラダー)と共に、Scie-Plas中型ユニット(60μl/ウェル)中の2%アガロースゲルにロードする。80Vで約1.5時間泳動し、365nmのUVで視覚化する。不正確に挿入されたリンカーを有するオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動によって除去する(不正確に挿入されたリンカーの例は、図8〜10を参照のこと)。ジタグバンドを切り出し、製造者の説明書にしたがって使い捨てFermentas Eluta Tubesを使用して電気溶出する。90Vで1〜1.5時間電気溶出し、採取したジタグを、エタノール沈殿する。200μlの溶出液毎に、以下を添加する。
3M NaOAc(pH5.2) 20μl
1M MgCl2 4.5μl
グリコチューブ 2μl
100%エタノール 800μl
沈殿したdiPETを、12μl溶離緩衝液中に再懸濁し、純度チェックおよび視覚的定量のための低分子量ラダー(Invitrogen)と共に、4〜20%PAGEミニゲルで2〜5μlを泳動する。
(a)ゲル精製BamHI付着diPETの鎖状体形成
CIA−diPET 200〜1000ng 6μl
10×リガーゼ緩衝液(スペルミジン含有) 1μl
T4 DNAリガーゼ(5U/μl、Invitrogen) 1μl
無ヌクレアーゼ水 2μl
16℃で2時間から一晩インキュベートする。次いで、65℃で10分間加熱不活化する。
Qiagen PCR精製QuickSpinキットを使用して、コンカテマーDNAを精製する。次いで、Nanodrop(Nanodrop technologies)のための1μlの使用によってDNAを定量し、短いBamHIの再消化物を定量する。
コンカテマー 20μl
10×BamHI緩衝液(New England Biolabs) 3μl
BamHI(1U/μlに希釈)(New England Biolabs) 0.2μl
100×BSA(New England Biolabs) 0.5μl
無ヌクレアーゼ水 6.3μl
37℃で30分間インキュベートし、それ以上はインキュベートしない。6μlのローディング色素を迅速に添加し、65℃で15分間加熱し、氷上で冷却し、その後にPAGEゲルにローディングする。
好ましくは、サイズ測定のためのTakara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーを隣接させた4〜20%の勾配のPAGEミニゲルの1つの穴に全サンプルをローディングする。200Vで約1時間電気泳動する。SYBRグリーンIで15〜30分間染色し、ゲル切り出し物についてDark Readerトランスイルミネーター(Clare Chemical)で視覚化する。
鎖状体形成DNAを3つの個別の画分(低(400〜1000bp)、中(1000〜2000bp)、および高(>2000bp))に切り出す。切り出した各サイズ画分のゲルスライスを0.6mlの微量遠心管に入れ、21Gニードルで底を突き刺した。この突き刺したチューブを、1.7ml微量遠心管内に入れ、16110gにて4℃で5分間遠心分離した。それにより、ゲル片が都合良くバラバラになり、1.7mlの各チューブの底に回収される。200μlのLoTE:NH4OAc(167:33)(LoTEは以下の配合表に従い、NH4OAcはAmbionから入手)を、各チューブに添加し、65℃で2時間の加熱によって溶離する。
3mM Tris−HCl(pH7.5)(Ambion)
0.2mM EDTA(Ambion)
溶離DNA画分 200μl
3M 酢酸ナトリウム(pH5.2) 20μl
GlycoBlue 2.2μl
100%エタノール 800μl
−80℃で30分間保持し、次いで、16110gにて4℃で30分間スピンし、75%エタノールで1回洗浄する。6μlのLoTE緩衝液中にペレットを再懸濁した。
使用前に、pZErO−1クローニングベクターを、37℃で2時間の10単位のBamHI(New England Biolabs)での2μgのpZErO−1プラスミドDNA(Invitrogen)の消化によって調製する。消化されたプラスミドDNAを、フェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、33ng/μlの濃度の60μlのLoTEに再懸濁する。プラスミドを、コントロールとしてのベクターの自己ライゲーションの準備(わずかなコロニーが存在するはずである)およびアガロースゲルでの泳動によって立証することができる。
コンカテマーDNA画分 6μl
BamHI/pZErO−1 1μl
5×リガーゼ緩衝液(PEG含有)(Invitrogen) 2μl
T4 DNAリガーゼ(5U/μL)(Invitrogen) 1μl
16℃で一晩インキュベートする。熱不活化させない。コントロールとして、並行して、ベクターの自己ライゲーションも準備する。自己ライゲーションのためのベクターを調製する場合、コンカテマーDNA画分を無ヌクレアーゼ水と置換する。
コロニー数を計数し、自己ライゲーションバックグラウンドの排除後に有効にライブラリーを測定する。プライマーPMR011およびPMR012を使用したPCRスクリーニングのために24〜48コロニーを選別する。pZErO−1ベクター自体にコントロールPCRを含める。PCRの結果に基づいて、一晩の培養物(低塩LB+ゼオシン、Immedia、Invitrogen)について1〜4×96ウェルプレートのコロニーを選別し、プラスミドを精製および配列決定して、インサートあたりのジタグの平均数を決定する。この段階で、ライブラリーを、精製ライゲーションミックスの形態にて、大量形質転換、プラスミド抽出、および配列決定の実施が望まれるまで−20℃で保存することができる。
形質転換TOP10(Invitrogen)細菌細胞を、ロボット選別を容易にするための2,000/プレート未満のコロニー密度で22×22cm寒天プレート(Q-trays,Genetix)にプレートした。各コロニーを選別し、LB+ゼオシン(上記を参照のこと)を含む384ウェルプレートにて37℃で一晩培養した。384ウェルプレートの複数のコロニーを複製し、15%グリセロール(Sigma)の存在下にて−80℃で保存する。
pZErO−1由来のクローン由来のプラスミドDNAを、Sprintprep固相キット(Agencourt)を使用して調製する。
プラスミドを、両方の方向から配列決定するために、配列決定プライマーPMR011およびPMR012(それぞれ、配列番号13および14)を使用して配列決定する。
Compressed Suffix Arrayを使用して、マッピングを行うことができる。2つの異なるDNAフラグメント(n>3)にわたる複数の連結を、実際の遠位調節領域を示すために利用するべきである(図5)。3つを超えるPETが、DNAの同一ストレッチの再整列を示さなければならない。すなわち、10kBを超える距離で分離しているか、異なる染色体上に存在するタグ1およびタグ2を、ゲノムの異なる位置にマッピングするタグからなる任意のキメラの前に、ゲノム再整列の代表として利用する。
〔実施例4〕
(a)pGIS8ベクターを得る。
1ngのDNA(Maxiprep) 1μl
Templiphi kit変性緩衝液 10μl
95℃で3分間加熱し、次いで、氷上で短期間冷却する。
Templiphi kitプレミックス 10μl
軽くたたくか穏やかにボルテックスして十分に混合する。震盪せずに30℃で16〜18時間インキュベートする。材料を試験する。材料は粘性を示すはずである。ピコグリーン蛍光光度法(Quant-It kit、Molecular Probes)によってDNAを定量する。
DNA 25μl
XhoI(20U/μl)(New England Biolabs) 1μl
EcoR1(20U/μl)(New England Biolabs) 1μl
10×EcoR1緩衝液(New England Biolabs) 5μl
100×BSA(New England Biolabs) 1μl
無ヌクレアーゼ水 17μl
37℃で16時間インキュベートする。PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製する。1%アガロースゲルにて5μlを試験する。
以下のように2つのチューブを準備する。
DNA 22.5μl
10×末端修復緩衝液(Epicentre) 5μl
2.5mM dNTPミックス(Epicentre) 5μl
10mM ATP(Epicentre) 5μl
末端修復酵素ミックス 1μl
無ヌクレアーゼ水 11.5μl
室温で45分間インキュベートし、70℃で10分間の加熱によって反応を停止させる。
1.細胞を採取する。
2.ホルムアルデヒドにて36℃で10分間架橋する。
3.ビーズビーターでの細胞溶解およびその後の遠心分離によって上清を得る。
4.超音波処理、ハイドロシャーリング、皮下注射針による引き抜きの反復、または制限酵素消化によってDNAを剪断する。
5.SDSおよびTriton−X処理を用いて望ましくないタンパク質を除去する。
1.DNAを平滑末端化する。
2.DNAをA−テーリングする。
3.ライゲーションする。
4.ローリングサークル増幅を、Amersham BioscienceのTempliphi kitなどの適切な市販のキットを使用して行うことができる。
5.DNAの定量を、Invitrogen/Molecular ProbesのPicoGreenの蛍光定量キットを使用して行うことができる。
6.MmeI制限酵素を使用して消化し、単離オリゴヌクレオチドを得る。
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Claims (36)
- 少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、前記第1のタグおよび前記第2のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、単離オリゴヌクレオチド。
- 前記第1のタグが第1のポリヌクレオチドのタグであり、前記第2のタグが第2のポリヌクレオチドのタグであり、ここで、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項1に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの制限酵素の認識部位をさらに含む、請求項1または2に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのリンカーをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記リンカーが、少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む、請求項4に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つのリンカーが、タグの間に挿入されているか、第1のタグの上流または第2のタグの下流に配置されている、請求項4または5に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの制限酵素の認識部位が、IIs型制限酵素の認識部位である、請求項3、5または6のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの制限酵素の認識部位が、ホーミング制限酵素の認識部位である、請求項3、5、または6に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの第1のタグが第1のポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含み、前記少なくとも1つの第2のタグが第2のポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含み、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項1〜8のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記リンカーが、第1のポリヌクレオチドを切断して第1のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第1の制限認識部位、および第2のポリヌクレオチドを切断して第2のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第2の制限認識部位を含み、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項5または6に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記リンカーが、第1のポリヌクレオチドを切断して第1のポリヌクレオチドの3’末端を得ることができる第1の制限酵素によって認識される第1の制限認識部位、および第2のポリヌクレオチドを切断して第2のポリヌクレオチドの5’末端を得ることができる第2の制限酵素によって認識される第2の制限認識部位を含み、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項5または6に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記リンカーが、第1のポリヌクレオチドを切断して第1のポリヌクレオチドの5’末端を得ることができる第1の制限酵素によって認識される第1の制限認識部位、および第2のポリヌクレオチドを切断して第2のポリヌクレオチドの3’末端を得ることができる第2の制限酵素によって認識される第2の制限認識部位を含み、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項5または6に記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記リンカーが、第1のポリヌクレオチドを切断して第1のポリヌクレオチドの3’末端を得ることができる第1の制限酵素によって認識される第1の制限認識部位、および第2のポリヌクレオチドを切断して第2のポリヌクレオチドの5’末端を得ることができる第2の制限酵素によって認識される第2の制限認識部位を含み、前記第1のポリヌクレオチドが、第1のポリヌクレオチドを切断して第1のポリヌクレオチドの5’末端を得ることができる第3の制限酵素によって認識される第3の制限認識部位をさらに含み、前記第2のポリヌクレオチドが、第2のポリヌクレオチドを切断して第2のポリヌクレオチドの3’末端を得ることができる第4の制限酵素によって認識される第4の制限認識部位を含み、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドであり、前記少なくとも1つの第1のタグが前記第1のポリヌクレオチドの5’末端および3’末端のライゲーションから得られ、前記少なくとも1つの第2のタグが前記第2のポリヌクレオチドの5’末端および3’末端のライゲーションから得られる、請求項5、6、または11のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記核酸−タンパク質複合体がクロマチン構造の一部である、請求項1〜13のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAである、請求項1〜14のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも2つの単離オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含み、前記第1のタグおよび第2のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、コンカテマー。
- 前記第1のタグが第1のポリヌクレオチドのタグであり、前記第2のタグが第2のポリヌクレオチドのタグであり、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体に由来し、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
- 前記少なくとも1つの制限部位が少なくとも1つのリンカーに含まれる、請求項18に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
- 前記少なくとも1つのリンカーが、タグの間に挿入されているか、または第1のタグの上流および/または第2のタグの下流に配置されている、請求項19に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
- 前記少なくとも1つの制限酵素の認識部位が、IIs型制限酵素の認識部位である、請求項18〜20のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
- 前記第1のタグが第1のポリヌクレオチド由来の5’末端および3’末端を含み、前記第2のタグが第2のポリヌクレオチド由来の5’末端および3’末端をさらに含む、請求項17〜21のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
- 請求項1〜15のいずれかに記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリー。
- 少なくとも1つの単離オリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
(d)核酸−タンパク質複合体を供するステップと、
(e)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記第1のタグおよび第2のタグが前記核酸−タンパク質複合体から得られる、ステップと、
(f)前記オリゴヌクレオチドを単離するステップと、
を含む、方法。 - 前記第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、前記第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、請求項24に記載の方法。
- 前記ステップ(b)が、
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入するステップと、
(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、およびリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項24または25に記載の方法。 - 前記ステップ(b)が、
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間に挿入するステップと、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の制限部位を前記第1のポリヌクレオチドの5’末端および前記第2のポリヌクレオチドの3’末端の各々に付加するステップと、
(iii)前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得るステップと、
(iv)前記切断フラグメントをライゲーションして、前記第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、前記第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、および前記タグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項24または25に記載の方法。 - 前記ステップ(ii)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位が、アダプターまたはベクターの一部である、請求項27に記載の方法。
- 前記核酸−タンパク質複合体が、クロマチン免疫沈降によって得られたものである、請求項24〜28のいずれかに記載の方法。
- 核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも2つのポリヌクレオチドを検出および/または同定する方法であって、
(g)核酸−タンパク質複合体を供するステップと、
(h)少なくとも1つの第1のタグおよび少なくとも1つの第2のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記第1のタグが第1のポリヌクレオチドから得られ、前記第2のタグが第2のポリヌクレオチドから得られ、前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られるステップと、
(i)前記オリゴヌクレオチドを配列決定するステップと、
(j)第1のタグおよび第2のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも2つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、前記少なくとも2つのポリヌクレオチドを検出および/または同定するステップと
を含む、方法。 - 前記ステップ(b)が、
(i)少なくとも1つの制限認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを挿入するステップと、
(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも1つの制限部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して、第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、および前記タグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項30に記載の方法。 - 前記ステップ(b)が、
(i)少なくとも1つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも1つのリンカーを、複合体の第1のヌクレオチドと第2のヌクレオチドとの間に挿入するステップと、
(ii)少なくとも1つの制限酵素の制限部位を前記第1のポリヌクレオチドの5’末端および前記第2のポリヌクレオチドの3’末端の各々に付加するステップと、
(iii)前記第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを、少なくとも1つの認識部位を認識する少なくとも1つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得るステップと、
(iv)前記切断フラグメントをライゲーションして、前記第1のポリヌクレオチドから得た第1のタグ、前記第2のポリヌクレオチドから得た第2のタグ、各ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端を含むタグ、および前記タグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項30に記載の方法。 - 前記ステップ(ii)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位が、アダプターまたはベクターの一部である、請求項32に記載の方法。
- 前記核酸−タンパク質複合体が、クロマチン免疫沈降によって得られたものである、請求項30〜33のいずれかに記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列決定前にステップ(a)〜(b)によって得られた少なくとも1つのさらなるオリゴヌクレオチドと鎖状体形成される(concatenate)、請求項30〜34のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが同一染色体上に存在するか、前記ポリヌクレオチドが異なる染色体上に存在する、請求項30〜35のいずれかに記載の方法。
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