CN114106196A - 抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体‑转座酶融合蛋白及其制备方法和应用,抗体‑转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白,His蛋白依次与TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白通过linker蛋白进行融合连接。制备方法:将目的基因插入到载体质粒的克隆位点获得可用于蛋白表达的重组质粒;将重组质粒转化至感受态细胞中进行诱导表达。本发明中的抗体‑转座酶融合蛋白,在原位对靶蛋白进行识别,将Tn5锚定在靶蛋白处,同时与Tn5连接的adaptor上加有特定的barcode序列,实现与抗体的对应,从而同时标记多个靶蛋白,并可以彼此区分,可用于制备单细胞多蛋白位点的分析试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)和染色质免疫沉淀结合高通量测序(Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是广泛使用的、经典的研究蛋白质-DNA互作的方法,距今已有20年的历史。传统ChIP的流程包括细胞交联、提取细胞核、裂解细胞核并超声破碎打断染色质、抗体免疫沉淀捕获蛋白-DNA复合物以及纯化DNA。利用该方法,可以研究转录因子、组蛋白及其它特定蛋白质与基因组DNA的相互作用,从而探索转录调控和胚胎发育的相关科学问题。然而传统ChIP存在以下缺陷:
首先,在传统的ChIP中需要使用甲醛对蛋白-DNA复合物进行交联,而且由于组织/细胞类型的不同,使用的甲醛浓度和固定时间都有差异。交联过轻或者过度,都会导致实验结果不理想,甚至失败。因此,针对不同的样品,需要花费大量时间优化交联条件,确保交联程度最佳以及批次间可重复性。同时甲醛是强致癌物,会危害实验人员的身体,并且造成环境污染。其次,在用超声进行染色质破碎时,随着组织/细胞的类型和数量、破碎时间、破碎强度、超声仪的品牌等条件的改变,超声后片段大小也会有较大差异,导致实验的可重复性差。同时,超声带有能量,会破坏染色质的结构,造成假阴性结果。此外,传统的ChIP方法还存在一个致命的缺陷,它需要的起始细胞数量为106以上,这个数量的培养细胞或者一般成体组织细胞比较容易获得,但对于早期胚胎发育相关的细胞和组织则有极大制约,例如哺乳动物的卵子、受精卵、发育早期胚胎以及早期胚胎的心脏和神经组织等,此类组织或细胞取材困难,限制了ChIP在相关领域的应用和发展。此外,传统ChIP实验流程繁琐,实验周期较长,一个完整的实验需要2-3天的时间,存在过多的不可控因素。
近几年出现的CUT&RUN、CUT&Tag以及CoBATCH等新方法极大降低了ChIP所需的实验时间和起始细胞数量。首先,使用ConA(刀豆凝集素,可以结合细胞膜或核膜的糖蛋白)beads捕获消化后的单细胞,对细胞进行通透化处理,之后向体系中加入目的蛋白的特异性抗体,然后利用微球菌核酸酶(MNase)或者转座酶(Tn5)与Protein A(能够识别结合抗体的IgG结构域)组成的融合蛋白,识别并捕获细胞内的抗体-靶蛋白复合物,使用Ca2+/Mg2+激活MNase或者Tn5,从而切割靶点处的DNA,最后纯化DNA并完成文库构建。相较于传统ChIP,这些方法在很大程度上简化了整个实验流程,缩短了实验时间、避免了机械的超声步骤、提高了实验的可重复性、降低了起始细胞量,并广泛适用于各种组织类型的细胞。
虽然这些方法较好的解决了传统ChIP-seq方法的部分不足,如材料要求和可重复性的问题,同时使得单细胞ChIP-seq成为了可能。但由于Protein A/G对于不同种属的抗体都具有一定的亲和能力,所以无法对一个细胞内的多个靶蛋白进行标记,只能通过一种组蛋白或转录因子的结合序列进行细胞分群,但如果能在同一个细胞中标记两个及以上的靶点,即可进一步划分细胞类群,获得更加清晰的细胞谱系,对于研究生物进化发育和转录调控具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,为解决现有技术中存在的问题,本发明提供了一种抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用。抗体-转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白。抗体和Tn5融合表达后,在原位对靶蛋白进行识别,将Tn5锚定在靶蛋白处,同时与Tn5连接的adaptor上加有特定的barcode序列,实现与抗体的对应,从而同时标记多个靶蛋白,并可以彼此区分。其制备方法简单,易于工业化生产。本发明的抗体-转座酶融合蛋白可用于少量样品,甚至是单细胞多蛋白位点的ChIP-seq分析,即Muti ChIP(Multi ChIP),对深入研究染色质功能和基因表达具有十分重要的意义,同时在单细胞水平,可以对细胞进行进一步的分类,在基础研究中有广泛应用。
为解决上述技术问题,本发明针对兔和鼠的IgG设计了不同的抗体-转座酶融合蛋白,即在同一个细胞中识别不同的靶蛋白,且不会产生互相影响,通过在转座酶的adaptor上设计不同的barcode序列,区分不同靶蛋白与基因组的结合序列。
本发明提供了一种抗体-转座酶融合蛋白,所述抗体-转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白,所述His蛋白依次与TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白通过linker蛋白进行融合连接。
上述的抗体-转座酶融合蛋白,进一步的,所述抗体-转座酶融合蛋白为His-TEV-anti rabbit-Tn5和His-TEV-anti mouse-Tn5中的一种或多种;His-TEV-anti rabbitIgG-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;His-TEV-anti mouse IgG-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述抗体-转座酶融合蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将目的基因插入到载体质粒的克隆位点获得可用于蛋白表达的重组质粒;
S2、将所述重组质粒转化至感受态细胞中,进行诱导表达得到抗体-转座酶融合蛋白。
上述的制备方法,进一步的,所述制备方法还包括以下步骤:
S3、将所述抗体-转座酶融合蛋白用镍柱特异性结合组氨酸标签进行分离纯化。
上述的制备方法,进一步的,所述S1具体为:
S1-1、根据nb序列的起始密码子和终止密码子设计引物对A1和A2,进行PCR扩增获得目的片段;
S1-2、从目的片段插入位点的两侧设计引物对B1和B2,进行PCR扩增获得载体片段;
S1-3、将目的片段合载体片段进行混合,孵育得到可用于蛋白表达的重组质粒。
上述的制备方法,进一步的,所述A1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示;所述A2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示;所述B1的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;所述B2的DNA序列如SEQID NO.6所示。
上述的制备方法,进一步的,所述S2具体为:
S2-1、将重组质粒转化至感受态细胞中获得转化菌落;
S2-1、挑取单克隆进行扩大培养;
S2-3、加入IPTG诱导表达获得抗体-转座酶融合蛋白。
上述的制备方法,进一步的,所述S3具体为:
S3-1、采用高压破碎法将大肠杆菌裂解,将裂解液过滤取上清液;
S3-2、将镍珠加入到上清液中,孵育,用Wash buffer进行洗杂,用Elution buffer进行洗脱,获得纯化的蛋白。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述抗体-转座酶融合蛋白在制备单细胞多蛋白位点的ChIP-seq(Multi-ChIP-seq)分析试剂盒中的应用。ChIP-seq用于研究蛋白质和DNA之间的相互作用,主要应用于分析染色质状态和基因表达调控。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)本发明提供了一种抗体-转座酶融合蛋白,所述抗体-转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白。抗体和Tn5融合表达后,在原位对靶蛋白进行识别,将Tn5锚定在靶蛋白处,同时与Tn5连接的adaptor上加有特定的barcode序列,实现与抗体的对应,从而同时标记多个靶蛋白,并可以彼此区分。当抗体与Tn5融合后,可以使Tn5与靶蛋白结合,并实现原位切割;His蛋白的作用主要是用于蛋白纯化;TEV蛋白主要是在标签蛋白影响目的蛋白活性时,将标签移除。
(2)本发明提供了一种抗体-转座酶融合蛋白,转座酶的种类有很多,本发明中使用的是Tn5转座酶的E54K、L372P突变型,在体外具有更好的转座活性,而且易于纯化。
(3)本发明提供了一种抗体-转座酶融合蛋白的制备方法,具有制备方法简单,易于工业化生产。
(4)本发明还提供了一种抗体-转座酶融合蛋白在制备单细胞多蛋白位点的ChIP-seq分析试剂盒中的应用。ChIP-seq用于研究蛋白质和DNA之间的相互作用,主要应用于分析染色质状态和基因表达调控。本发明可以用来做单个样品中的多个靶蛋白与DNA的相互作用,对深入研究染色质和基因表达具有十分重要的意义,同时在单细胞水平,可以对细胞进行进一步的分类,在基础研究中有广泛应用。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为Multi ChIP-seq的实验流程示意图。
图2为本发明实施例1的抗体-转座酶融合蛋白经亲和层析后的蛋白图。
图3为本发明实施例1中抗体-转座酶融合蛋白的Tn5的活性检测结果图。
图4为本发明实施例1中抗体-转座酶融合蛋白特异性检测结果图,其中Input为目的蛋白,s为IP后的上清,rabbit IgG和mouse IgG为偶联对应IgG的琼脂糖凝胶珠。
图5为本发明实施例1的抗体-转座酶融合蛋白,单样品双位点数据拆分后比较结果图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种本发明的抗体-转座酶融合蛋白His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5,包括His蛋白、TEV蛋白、anti rabbit IgG蛋白和Tn5蛋白,His蛋白依次与TEV蛋白、anti rabbit IgG蛋白和Tn5蛋白通过linker蛋白进行融合链接。图1是Multi ChIP-seq的实验流程示意图。向通透化处理的细胞样品中加入两种来自不同宿主的靶蛋白一抗,如anti-H3K4me3antibody(rabbit)和anti-polⅡantibody(mouse),经过孵育后,再同时加入anti mouseIgG-Tn5和anti rabbit IgG-Tn5,一抗用于区分不同的靶蛋白,IgG-Tn5融合蛋白与特定种属的一抗结合,在原位对靶蛋白进行识别,将Tn5锚定在靶蛋白处,同时与Tn5连接的adaptor上加有特定的barcode序列,实现与抗体的对应,从而同时标记多个靶蛋白,并可以彼此区分。从而实现对一个样品多蛋白位点的ChIP-seq(Multi ChIP-seq)分析。
His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,具体为:
MSGHHHHHHHHHHSGHHHHHSGENLYFQSSGSQVQLVECGGGLVQAGDSLRLSCVASGRSLDGATMRWYRQAPGKEREFVAGIFWDEIGTEYADTAKGRFTISRDNAKNTIYLQMTNLRSEDTAMYYCNGLVFGGEYWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHMITSALHRAADWAKSVFSSAALGDPRRTARLVNVAAQLAKYSGKSITISSEGSKAMQEGAYRFIRNPNVSAEAIRKAGAMQTVKLAQEFPELLAIEDTTSLSYRHQVAEELGKLGSIQDKSRGWWVHSVLLLEATTFRTVGLLHQEWWMRPDDPADADEKESGKWLAAAATSRLRMGSMMSNVIAVCDREADIHAYLQDKLAHNERFVVRSKHPRKDVESGLYLYDHLKNQPELGGYQISIPQKGVVDKRGKRKNRPARKASLSLRSGRITLKQGNITLNAVLAEEINPPKGETPLKWLLLTSEPVESLAQALRVIDIYTHRWRIEEFHKAWKTGAGAERQRMEEPDNLERMVSILSFVAVRLLQLRESFTPPQALRAQGLLKEAEHVESQSAETVLTPDECQLLGYLDKGKRKRKEKAGSLQWAYMAIARLGGFMDSKRTGIASWGALWEGWEALQSKLDGFLAAKDLMAQGIKI。
His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5的核苷酸序列具体为:
上述核苷酸序列中,具有双下划线标识的是His蛋白,具有单下划线标识的是Tev蛋白,加粗的是linker蛋白,加粗下划线标识的是Tn5蛋白。
本实施例的抗体-转座酶融合蛋白His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5采用以下方法制备得到:
(1)目的蛋白的诱导表达:选择pET-28b表达载体(Kan抗性),根据大肠杆菌的密码子偏好性优化目的基因的核酸序列,采用无缝克隆的方式,将目的基因插入到载体质粒的克隆位点。具体步骤为:
1.1、获得目的片段:以重链抗体序列(nb序列)为目的基因(nb序列获取文献https://doi.org/10.1083/jcb.201709115)。根据目的基因的起始密码子和终止密码子设计引物对。
其中正向引物forward primer的DNA序列如SEQ ID NO.3所示,具体为:
gtttaactttaagaaggagatataccatgagtGGTCACcatcatcatca。
反向引物reverse primer的DNA序列如SEQ ID NO.4所示,具体为:
TGGCGCAGGGCATTAAAATCTGACTGCggccgcactcgag。
进行PCR扩增获得目的片段,其扩增体系为:10μL 2×Taq mix、1μL正向引物、1μL反向引物、1μL模板、7μL H2O。扩增程序为:95℃预变性30s;95℃变性10s、57℃退火15s、72℃延伸1min(20个循环);72℃最后延伸2min,4℃保存。
1.2、获得载体片段:从目的片段插入位点的两侧设计引物对。
其中正向引物forward primer的DNA序列如SEQ ID NO.5所示,具体为:TGACTGCggccgcactcgag;反向引物reverse primer的DNA序列如SEQ ID NO.6所示,具体为:catggtatatctccttcttaaagttaaac。
进行PCR扩增获得载体片段,其扩增体系为:10μL 2×Taq mix、1μL正向引物、1μL反向引物、1μL模板、7μL H2O。扩增程序为:95℃预变性30s;95℃变性10s、54℃退火15s、72℃延伸2min 40s(20个循环);72℃最后延伸2min,4℃保存。
1.3、将目的片段和载体片段按照摩尔质量之比为5∶1(摩尔质量比为2∶1~10∶1均可)混合,加入等体积的Gibson assembly mix混匀,50℃孵育15min得到表达载体。
1.4、将构建好的表达载体,转入T1感受态。具体步骤为:取适量表达载体,加入到20μL以上的感受态细胞中,冰上静置15min。42℃,水浴热激60s(45~90s均可)。冰上静置2min。加入500μL无抗性培养基(无抗性培养基即未加抗生素的LB培养基)在37℃下,以220rpm复苏45min(30~60min均可)。再以7,000rpm离心1min。弃上清,剩余约50μL,重悬细胞,涂布平板。37℃过夜培养。
1.5、挑取步骤1.4中获得的单克隆至7mL LB培养基中(6~8mL均可),37℃,220rpm,培养过夜。使用诺唯赞质粒小提试剂盒进行质粒提取,并测定质粒浓度。将符合测序要求的质粒送到生工生物进行测序,序列正确的质粒即为可用于蛋白表达的重组质粒。
(2)目的蛋白的诱导表达:
2.1、将可用于蛋白表达的重组质粒,转化至BL21(DE3)感受态中。挑取单克隆至7mL LB培养基中(6~8mL均可),37℃,220rpm,培养10h(9~12h均可)得到菌液。
2.2、细菌扩大培养:取5mL菌液加入到500mL(500~1000mL均可)Kan培养基中,37℃,220rpm,培养3.5h(3~4h均可),至OD600为0.5~0.8。
2.3、加入IPTG至终浓度0.5mM,37℃诱导4h。4℃,3,500g,30min,收集菌体。
2.4、诱导结果检测:
取500μL未诱导菌液和诱导菌液至2mL EP管,12,000rpm,4℃,离心3min。使用50μLPBS重悬菌体沉淀,取20μL至200μL EP管,加入5μL 5×loading buffer,95℃,变性10min。
SDS-PAGE凝胶电泳,判断目的蛋白的表达情况。
(3)目的蛋白的纯化:利用镍柱特异性结合组氨酸标签(10×His tag),从细菌裂解液中分离目的蛋白,用含咪唑的Elution buffer进行洗脱,得到纯度较高的抗体-转座酶融合蛋白。
具体步骤为:
3.1、采用高压破碎法将大肠杆菌裂解。具体步骤为:提前将高压均质机打开制冷,并先后用水和Lysis buffer清洗机器3次,清洗结束后待用。用50mL Lysis buffer(成分参见表1)充分重悬菌体沉淀,加入500μL 100mM PMSF至终浓度为1mM,混匀后,倒入均质机。液体循环两次后,加压至850~1,000Mpa,裂解13min(10~15min均可)至液体澄清。收集裂解液,4℃,12,000g,离心20min。取离心后的上清液,用0.45μm的滤膜过滤上清。
表1:Lysis buffer(2L)的成分表
成分 | 终浓度 | 加入体积 |
1M Tris-HCl,pH=7.4 | 50mM | 100mL |
5M NaCl | 150mM | 60mL |
5M Imidazole | 20mM | 8mL |
2、镍柱亲和层析:将适量的平衡好的镍珠加入到过滤后的上清液中,4℃孵育15min。流穿至层析柱中,将镍珠和上清液分离。用10倍柱体积的Wash buffer(成分参见表2)进行洗杂,至少洗3次(3~5次均可)。用Elution buffer(成分参见表3)进行洗脱,单倍柱体积洗脱5~7次。SDS-PAGE凝胶电泳,检测蛋白纯度和浓度。
亲和层析结果参见图2。图2为蛋白洗脱结果,从图中可以看出,经过亲和层析纯化,我们得到纯度较高的融合蛋白。Con为已知浓度的蛋白,可以帮助我们比较,并判断目的蛋白的浓度。
表2:Wash buffer(2L)的成分表
成分 | 终浓度 | 加入体积 |
1M Tris-HCl,pH=7.4 | 50mM | 100mL |
5M NaCl | 300mM | 120mL |
5M Imidazole | 50mM | 20mL |
表3:Elution buffer(2L)的成分表
成分 | 终浓度 | 加入体积 |
1M Tris-HCl,pH=7.4 | 50mM | 100mL |
5M NaCl | 300mM | 120mL |
5M Imidazole | 250mM | 100mL |
(4)蛋白浓缩和保存:
1、用30KD的超滤管,浓缩含有目的蛋白的洗脱液,至原体积的1/50。
2、加入不含甘油的Storage buffer(成分参见表4)至原体积,再次浓缩50倍。
3、加入适量的Storage buffer,将蛋白稀释到0.2mg/mL,液氮迅速冷冻后,放入-80℃温度下长期保存。
表4:Storage buffer(200mL)的成分表
成分 | 终浓度 | 加入体积 |
1M Tris-HCl,pH=7.4 | 50 mM | 10mL |
5M NaCl | 800mM | 320mL |
0.5M EDTA | 1mM | 4mL |
Glycerol | 50% | 100mL |
实验一、将His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5蛋白进行Tn5活性检测,具体检测方法位:
(1)DNA片段化:在200μL PCR管中,配置如下反应体系:2×HMW buffer 25μL、DNA50ng、Tn5/pg 1μL、H2O补足体积至50μL。将配置好的体系放入PCR仪中,55℃孵育20min。体系中的DNA为任意大分子量的DNA片段或质粒。
(2)终止反应:向PCR管中加入1μL 10%SDS、1μL 0.5M EDTA和1μL蛋白酶K(proteinase K),混匀后,放入PCR仪中,60℃孵育30min。
(3)DNA纯化:终止完成后,向体系中加入等倍体积的DNA purification beads,混匀后静置10min。置于磁力架上吸附,待溶液澄清后,弃上清。加入200μL 80%乙醇,静置30s,吸出后晾干;使用无核酸酶水洗脱DNA。
(4)通过琼脂糖凝胶电泳,判断Tn5的活性。考察结果参见图3。
图3是对应Tn5活性检测步骤,该实验是利用不同数量的融合蛋白对大分子量的质粒进行打断,从而判断其活性,从图3中可以看出,Tn5可以有效的打断DNA,并未因与抗体蛋白融合表达而受到明显的影响。
实施例2
一种本发明的抗体-转座酶融合蛋白His-TEV-anti mouse IgG-Tn5,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例的抗体-转座酶融合蛋白His-TEV-anti mouse IgG-Tn5采用的制备方法与实施例1中的一致。
His-TEV-anti mouse IgG-Tn5的氨基酸序列:
MSGHHHHHHHHHHSGENLYFQSSGSQVQLVECGGGWVQPGGSLRLSCAASGFTFSDTAMMWVRQAPGKGREWVAAIDTGGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTARYYCAKTYSGNYYSNYTVANYGTTGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHMITSALHRAADWAKSVFSSAALGDPRRTARLVNVAAQLAKYSGKSITISSEGSKAMQEGAYRFIRNPNVSAEAIRKAGAMQTVKLAQEFPELLAIEDTTSLSYRHQVAEELGKLGSIQDKSRGWWVHSVLLLEATTFRTVGLLHQEWWMRPDDPADADEKESGKWLAAAATSRLRMGSMMSNVIAVCDREADIHAYLQDKLAHNERFVVRSKHPRKDVESGLYLYDHLKNQPELGGYQISIPQKGVVDKRGKRKNRPARKASLSLRSGRITLKQGNITLNAVLAEEINPPKGETPLKWLLLTSEPVESLAQALRVIDIYTHRWRIEEFHKAWKTGAGAERQRMEEPDNLERMVSILSFVAVRLLQLRESFTPPQALRAQGLLKEAEHVESQSAETVLTPDECQLLGYLDKGKRKRKEKAGSLQWAYMAIARLGGFMDSKRTGIASWGALWEGWEALQSKLDGFLAAKDLMAQGIKI。
His-TEV-anti mouse IgG-Tn5的核苷酸序列为:
上述核苷酸序列中,具有双下划线标识的是His蛋白,具有单下划线标识的是TEV蛋白,加粗的是linker蛋白,加粗下划线标识的是Tn5蛋白。
实验二:将His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5和His-TEV-anti mouse IgG-Tn5蛋白进行nanobody活性检测:
(1)分别取适量的抗原(rabbit IgG、mouse IgG)偶联的琼脂糖凝胶珠,加入1.5mLEP管中(使用前用1%BSA处理,以减少管壁的吸附)。
(2)加入1mL PBS,轻柔吹打10次后,1,000rpm,4℃,离心3min,弃上清。
(3)重复步骤(2)三次。
(4)使用1mL含1%BSA的PBS重悬凝胶珠,4℃封闭30min。
(5)封闭结束后,1,000rpm,4℃,离心3min,弃上清。
(6)加入适量的anti rabbit IgG-Tn5蛋白,4℃孵育结合1h。
(7)加入1mL high salt buffer,轻柔吹打10次后,1,000rpm,4℃,离心3min,弃上清。
(8)重复步骤(7)三次。
(9)通过SDS-PAGE凝胶电泳进行nanobody亲和活性分析:将洗杂后的蛋白用考马斯亮蓝染色和脱色后,考察实施例1中抗体-转座酶融合蛋白与特定的表签蛋白的结合特异性。
结果参见图4:H-Tn5指代His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5,D-Tn5指代His-TEV-anti mouse IgG-Tn5,input指含有两种目的蛋白的溶液,S是指目的蛋白和mouse IgG或rabbit IgG beads结合后的上清,IP为结合后的beads,从图4中可以看出His-TEV-antirabbit IgG-Tn5和His-TEV-anti mouse IgG-Tn5能够结合特定的IgG,并且没有交叉反应,可以说明两种融合蛋白都有很好的亲和能力和种属特异性。
实验三:实施例1的抗体-转座酶在多蛋白靶点ChIP-seq实验中的应用,其应用方法参见https://doi.org/10.1038/s41467-019-09982-5:Cut&Tag(A375-50000 cells-H3K4)。具体包括以下步骤:
(1)ConA beads处理:取1.5mL离心管,用1%BSA润洗。加入100μl/样本的Bindingbuffer重悬ConA beads,轻微吹打混匀,置于磁力架上,静置澄清后,弃尽上清。
(2)细胞处理(室温,勿剧烈振荡):室温收集细胞并计数。吸取适量细胞悬液,加到含500μL Wash buffer的1.5mL的离心管,以600g转速离心3min,弃上清。取500μL/样本Washbuffer加入EP管中重悬,以600g转速离心3min,弃上清。
(3)细胞与ConA beads结合:取100μL/样本Wash buffer重悬细胞,加入步骤(1)中处理好的ConA beads,边加入边混匀,室温旋转孵育10min。短暂离心后,将EP管置于磁力架上,澄清后,弃尽上清。
(4)一抗孵育(细胞与ConA beads结合后,勿用枪吹打):取50μL/样本Antibodybuffer(预冷),轻轻吹打混匀,置于冰上。按推荐的免疫浓度向EP管中加入抗体,轻轻拨动混匀。室温下旋转2h(或过夜)。向EP管中加入500μL Dig-wash Buffer,上下颠倒10次或轻轻震荡混匀,确保Buffer与ConA beads充分混合。重复步骤3、4两次,最后一次洗涤后,勿去除Dig-wash Buffer,防止ConA beads暴露在空气中过分干燥。
(5)anti mouse Tn5和anti rabbit Tn5孵育:将EP管置于磁力架上,静置澄清后,弃尽上清。将适量的融合Tn5(15μL可做5万细胞)加入到Dig-300buffer中。按100μL/样本含融合Tn5的Dig-300buffer,加入到每个样品中,并轻拨混匀。室温孵育1h。瞬离,将EP管置于磁力架上,静止后,弃上清。500μL/样本的Dig-300buffer,轻拨混匀。重复步骤4、5两次。
(6)DNA片段化:瞬离,将EP管置于磁力架上,静置澄清后,弃尽上清。按300μL/样本的Tagmentation buffer,加入到每个样品中,并轻拨混匀。37℃孵育1h,可轻微振荡。
(7)DNA抽提:终止反应,每样本加入10μL 0.5M EDTA、3μL 10%SDS和2.5μL蛋白酶K(20mg/mL),轻拨混匀后,50℃孵育1h。瞬离,加入酚氯仿,单倍柱体积/样本,最高转速离心5min。取上层水相至已加有两倍柱体积无水乙醇的新的EP管中,上下颠倒混匀。加入40μg糖原,放入-80℃静置30min以上。4℃,最高转速离心15min,完成后,弃尽上清(可暂时保留)。加入1mL无水乙醇漂洗,最高转速离心15min。弃尽上清,并晾干。用25-30μL H2O溶解,静置5min。
(8)PCR扩增:取8μL产物,设置PCR体系:引物组合物和扩增文库,其中引物组合物的具体序列列于表5中。
表5引物组合物成分表
PCR扩增程序为:72℃5min;98℃30s、98℃10s、63℃15s(17个循环);72℃30s;72℃5min。
(9)文库纯化:涡旋振荡混匀DNA纯化磁珠并吸取24μL(1.2×)至上述PCR反应产物中,涡旋振荡或使用移液器吹打10次保证整个体系均匀,室温孵育10min。将反应管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体,待溶液澄清后,小心移除上清,注意不要扰动磁珠。保持PCR管始终在磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30s,小心移除上清。重复步骤3,总计漂洗两次。保持PCR管始终处于磁力架上,开盖空气干燥3-5min。磁珠晾干后,将PCR管从磁力架上取出,加入10μL H2O洗脱,涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀磁珠,室温孵育10min。将PCR管短暂离心收集置于磁力架上分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μL上清转移到新的EP管中,-30℃~-15℃保存。bulk实验用试剂和流程参考Cut&Tag protocol:dx.doi.org/10.17504/protocols.io.wnufdew,仅将protein A-Tn5替换成我们设计的barcode后的nb-Tn5。
图5:第一行和第三行是在单独的样品中分别进行靶蛋白的Cut&Tag分析,第二行和第四行是在同一个样品中用anti mouse IgG-Tn5和anti rabbit IgG-Tn5进行两个靶蛋白的multi Cut&Tag分析,并根据barcode拆分的结果。证明在同一个样品中进行多蛋白Cut&Tag分析的可行性,以及拆分结果具有较好的质量。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下,都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰,均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 陈凯
云南中科灵长类生物医学重点实验室
<120> 抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Gly His His His His His His His His His His Ser Gly His
1 5 10 15
His His His His Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ser Gly Ser
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Cys Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
35 40 45
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ser Leu Asp Gly Ala
50 55 60
Thr Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
65 70 75 80
Ala Gly Ile Phe Trp Asp Glu Ile Gly Thr Glu Tyr Ala Asp Thr Ala
85 90 95
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
100 105 110
Leu Gln Met Thr Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
115 120 125
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Glu Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Met Ile Thr Ser Ala Leu His
165 170 175
Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val Phe Ser Ser Ala Ala Leu Gly
180 185 190
Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val Asn Val Ala Ala Gln Leu Ala
195 200 205
Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile Ser Ser Glu Gly Ser Lys Ala
210 215 220
Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile Arg Asn Pro Asn Val Ser Ala
225 230 235 240
Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met Gln Thr Val Lys Leu Ala Gln
245 250 255
Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu Asp Thr Thr Ser Leu Ser Tyr
260 265 270
Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile Gln Asp
275 280 285
Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser Val Leu Leu Leu Glu Ala Thr
290 295 300
Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His Gln Glu Trp Trp Met Arg Pro
305 310 315 320
Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys Glu Ser Gly Lys Trp Leu Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met Gly Ser Met Met Ser Asn Val
340 345 350
Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp Ile His Ala Tyr Leu Gln Asp
355 360 365
Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val Val Arg Ser Lys His Pro Arg
370 375 380
Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Asp His Leu Lys Asn Gln
385 390 395 400
Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser Ile Pro Gln Lys Gly Val Val
405 410 415
Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg Pro Ala Arg Lys Ala Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu Lys Gln Gly Asn Ile Thr Leu
435 440 445
Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn Pro Pro Lys Gly Glu Thr Pro
450 455 460
Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Val Glu Ser Leu Ala Gln
465 470 475 480
Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr His Arg Trp Arg Ile Glu Glu
485 490 495
Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala Gly Ala Glu Arg Gln Arg Met
500 505 510
Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met Val Ser Ile Leu Ser Phe Val
515 520 525
Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu Ser Phe Thr Pro Pro Gln Ala
530 535 540
Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu Ala Glu His Val Glu Ser Gln
545 550 555 560
Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr
565 570 575
Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln
580 585 590
Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys
595 600 605
Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu Gly Trp Glu Ala
610 615 620
Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys Asp Leu Met Ala
625 630 635 640
Gln Gly Ile Lys Ile
645
<210> 2
<211> 648
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Gly His His His His His His His His His His Ser Gly Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ser Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Cys
20 25 30
Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
35 40 45
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Thr Ala Met Met Trp Val Arg Gln
50 55 60
Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Thr Gly Gly
65 70 75 80
Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
100 105 110
Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Tyr Ser Gly Asn
115 120 125
Tyr Tyr Ser Asn Tyr Thr Val Ala Asn Tyr Gly Thr Thr Gly Arg Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Met Ile Thr Ser
165 170 175
Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val Phe Ser Ser Ala
180 185 190
Ala Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val Asn Val Ala Ala
195 200 205
Gln Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile Ser Ser Glu Gly
210 215 220
Ser Lys Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile Arg Asn Pro Asn
225 230 235 240
Val Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met Gln Thr Val Lys
245 250 255
Leu Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu Asp Thr Thr Ser
260 265 270
Leu Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Gly Ser
275 280 285
Ile Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser Val Leu Leu Leu
290 295 300
Glu Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His Gln Glu Trp Trp
305 310 315 320
Met Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys Glu Ser Gly Lys
325 330 335
Trp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met Gly Ser Met Met
340 345 350
Ser Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp Ile His Ala Tyr
355 360 365
Leu Gln Asp Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val Val Arg Ser Lys
370 375 380
His Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Asp His Leu
385 390 395 400
Lys Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser Ile Pro Gln Lys
405 410 415
Gly Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg Pro Ala Arg Lys
420 425 430
Ala Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu Lys Gln Gly Asn
435 440 445
Ile Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn Pro Pro Lys Gly
450 455 460
Glu Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Val Glu Ser
465 470 475 480
Leu Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr His Arg Trp Arg
485 490 495
Ile Glu Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala Gly Ala Glu Arg
500 505 510
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515 520 525
Ser Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu Ser Phe Thr Pro
530 535 540
Pro Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu Ala Glu His Val
545 550 555 560
Glu Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln Leu
565 570 575
Leu Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly
580 585 590
Ser Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met
595 600 605
Asp Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu Gly
610 615 620
Trp Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys Asp
625 630 635 640
Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
645
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttaacttt aagaaggaga tataccatga gtggtcacca tcatcatca 49
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggcgcaggg cattaaaatc tgactgcggc cgcactcgag 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgactgcggc cgcactcgag 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catggtatat ctccttctta aagttaaac 29
Claims (9)
1.一种抗体-转座酶融合蛋白,其特征在于,所述抗体-转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白,所述His蛋白依次与TEV蛋白、抗体蛋白、Tn5蛋白通过linker蛋白进行融合连接。
2.根据权利要求1所述的抗体-转座酶融合蛋白,其特征在于,所述抗体-转座酶融合蛋白为His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5和His-TEV-anti mouse IgG-Tn5中的一种或多种;
所述His-TEV-anti rabbit IgG-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述His-TEV-anti mouse IgG-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1或2所述抗体-转座酶融合蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将目的基因插入到载体质粒的克隆位点获得可用于蛋白表达的重组质粒;
S2、将所述重组质粒转化至感受态细胞中,进行诱导表达得到抗体-转座酶融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括以下步骤:
S3、将所述抗体-转座酶融合蛋白用镍柱特异性结合组氨酸标签进行分离纯化。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述S1具体为:
S1-1、根据重链抗体序列的起始密码子和终止密码子设计引物对A1和A2,进行PCR扩增获得目的片段;
S1-2、从目的片段插入位点的两侧设计引物对B1和B2,进行PCR扩增获得载体片段;
S1-3、将目的片段和载体片段进行混合,孵育得到可用于蛋白表达的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述A1的DNA序列如SEQ IDNO.3所示;所述A2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示;所述B1的DNA序列如SEQID NO.5所示;所述B2的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述S2具体为:
S2-1、将重组质粒转化至感受态细胞中获得转化菌落;
S2-1、挑取单克隆进行扩大培养;
S2-3、加入IPTG诱导表达获得抗体-转座酶融合蛋白。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述S3具体为:
S3-1、采用高压破碎法将大肠杆菌裂解,将裂解液过滤取上清液;
S3-2、将镍珠加入到上清液中,孵育,用Wash buffer进行洗杂,用Elution buffer进行洗脱,获得纯化的蛋白。
9.一种权利要求1或2所述抗体-转座酶融合蛋白在制备单细胞的多蛋白位点的ChIP-seq分析的检测试剂盒中的应用。
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---|---|
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115386966A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-11-25 | 北京寻因生物科技有限公司 | Dna表观修饰的建库方法、测序方法及其建库试剂盒 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018042776A1 (ja) * | 2016-08-30 | 2018-03-08 | 国立大学法人九州大学 | Dna結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のdna断片を挿入する方法 |
CN108219006A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-06-29 | 上海欣百诺生物科技有限公司 | 一种转座酶-抗体结合蛋白的融合蛋白及其制备与应用 |
WO2019060907A1 (en) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | HIGH PERFORMANCE TARGETED IN SITU PANGENOMIC PROFILING |
CN110372799A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-10-25 | 北京大学 | 一种用于单细胞ChIP-seq文库制备的融合蛋白及其应用 |
WO2021016239A1 (en) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Becton, Dickinson And Company | Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay |
WO2021097252A1 (en) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bradley Bernstein | Methylation assays and uses thereof |
CN113322254A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-08-31 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 多靶点蛋白质-dna相互作用的研究方法和工具 |
CN113444768A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-28 | 中山大学 | 一种检测染色体互作的方法 |
-
2021
- 2021-10-29 CN CN202111275800.0A patent/CN114106196A/zh active Pending
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018042776A1 (ja) * | 2016-08-30 | 2018-03-08 | 国立大学法人九州大学 | Dna結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のdna断片を挿入する方法 |
WO2019060907A1 (en) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | HIGH PERFORMANCE TARGETED IN SITU PANGENOMIC PROFILING |
CN111727248A (zh) * | 2017-09-25 | 2020-09-29 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 高效靶向原位全基因组剖析 |
CN108219006A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-06-29 | 上海欣百诺生物科技有限公司 | 一种转座酶-抗体结合蛋白的融合蛋白及其制备与应用 |
WO2019184044A1 (zh) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 上海欣百诺生物科技有限公司 | 一种转座酶-抗体结合蛋白的融合蛋白及其制备与应用 |
WO2021016239A1 (en) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Becton, Dickinson And Company | Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay |
CN110372799A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-10-25 | 北京大学 | 一种用于单细胞ChIP-seq文库制备的融合蛋白及其应用 |
WO2021097252A1 (en) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bradley Bernstein | Methylation assays and uses thereof |
CN113322254A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-08-31 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 多靶点蛋白质-dna相互作用的研究方法和工具 |
CN113444768A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-28 | 中山大学 | 一种检测染色体互作的方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CONNOR H.LUDWIG等: "Mapping chromatin modifications at the single cell level", 《DEVELOPMENT》 * |
MAREK BARTOSOVIC等: "Multimodal chromatin profiling using nanobody-based single-cell CUT&Tag", 《BIORXIV》 * |
TIM STUART等: "Nanobody-tethered transposition allows for multifactorial chromatin profiling at single-cell resolution", 《BIORXIV》 * |
彭昂惠等: "非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序技术建库方法的优化", 《南方医科大学学报》 * |
陈桂芳等: "染色质免疫共沉淀测序技术研究进展", 《生物技术通报》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115386966A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-11-25 | 北京寻因生物科技有限公司 | Dna表观修饰的建库方法、测序方法及其建库试剂盒 |
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