CN112979778B - 介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法 - Google Patents

介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法，本发明从异足新米虾(Neocaridina heteropoda)卵黄蛋白原中找到了一段长度仅为40aa的多肽，该多肽具有出乎意料的介导外源蛋白内吞的效果，从而易于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，在异足新米虾的基因编辑中具有良好的应用前景。该技术的可被广泛应用于对胚胎显微注射技术尚不纯熟的非模式生物，对于Cas9介导的基因编辑具有重要意义。

Description

介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中 进行基因编辑的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法。
背景技术
CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromicrepeat/Cas9)系统是目前基因组编辑领域最受欢迎的方法。CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中，CRISPR的酶切位点通常由高度保守的重复序列组成，其长度为21-48bp，重复序列之间被26-72bp间隔序列隔开，这些间隔序列是CRISPR与靶基因进行识别的标记。Cas9存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在sgRNA(small guide RNA)引导下对靶位点邻近的PAM(protospacer adjacent motif)序列进行识别并在其附近切割。
在使用CRISPR-Cas9系统进行位点特异性基因编辑以来，该技术已被用于各种物种。成功应用CRISPR-Cas9进行基因编辑依赖于胚胎显微注射。然而对于非专业实验室而言，它需要昂贵的设备和培训才能实施。同时，许多非模型生物对该技术尚不纯熟，而且它们的卵在注射过程容易受损，这些极大地限制了CRISPR-Cas9技术在甲壳动物中的应用。
大多数雌性卵生动物通过卵巢和卵子成熟的保守过程将蛋白质物质传递给它们正在发育的卵巢，称为卵黄发生。在无脊椎动物中，卵黄蛋白前体(YPPs)在脂肪体或肝胰腺中合成，分泌到血淋巴中，并通过受体介导的内吞作用(RME)摄取到卵巢中。在卵黄发生过程中，卵母细胞膜中的多种受体结合YPP配体，内化，积累在内体囊泡中，并分选成卵黄颗粒，用于发育胚胎的营养储存。
假设来自甲壳动物YPPs的配体可以与Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物融合，并且将该融合蛋白注射到卵黄发生的雌性卵生动物血淋巴中，从而进入卵母细胞在胚胎中实现基因编辑。但是甲壳动物YPPs的分子量高达300kDa左右，将其整体作为YPP配体与Cas9融合后所形成的融合蛋白分子量过大，难于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，因此不具有实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能够高效介导外源蛋白内吞的多肽。
本发明的发明人在异足新米虾卵黄蛋白原的全长氨基酸序列中找到了一段长度仅为40aa的多肽，该多肽具有出乎意料的介导外源蛋白内吞的效果，从而易于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，在异足新米虾的基因编辑中具有良好的应用前景，由此得到了本发明。
本发明提供了一种多肽，该多肽能够介导外源蛋白的内吞该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，所述外源蛋白为Cas9，所述内吞发生在异足新米虾卵母细胞中。
本发明还提供了一种核酸，该核酸编码如上所述的多肽。
可选地，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种如上所述的多肽或如上所述的核酸在介导外源蛋白内吞中的应用。
可选地，所述外源蛋白为Cas9，所述内吞发生在异足新米虾卵母细胞中。
可选地，该应用包括如下步骤：将融合核酸构建进表达质粒，并导入至工程菌，通过工程菌表达收集目标蛋白，将目标蛋白通过显微注射仪注射入卵黄发生前期的米虾心腔附近；所述融合核酸含有融合在同一核酸链中的编码Cas9蛋白的核酸和如上所述的核酸。
可选地，所述融合核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种在异足新米虾中进行基因编辑的方法，该方法包括：将sgRNA和融合蛋白混合以形成RNP复合物，并且将RNP复合物通过显微注射仪注射入卵黄发生前期的米虾心腔附近；所述融合蛋白含有融合在同一肽链中的Cas9多肽和如上所述的多肽。
可选地，该方法还包括：向卵黄发生前期的米虾中导入外源基因模版。
本发明从异足新米虾(Neocaridina heteropoda)卵黄蛋白原中找出一段可以介导外源蛋白Cas9内吞入卵母细胞的多肽，该多肽相对于其它多肽具有出乎意料的介导外源蛋白内吞的效果。该技术的可被广泛应用于对胚胎显微注射技术尚不纯熟的非模式生物，对于Cas9介导的基因编辑具有重要意义。
附图说明
图1为异足新米虾卵黄蛋白原结构域琼脂糖凝胶电泳结果图。
图2为异足新米虾VWD1/VWD2-EGFP融合蛋白表达纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果图。
图3为异足新米虾VWD1-EGFP融合蛋白-卵巢体外孵育实验Western Blot检测结果图(泳道1-3：VWD1-EGFP-卵巢孵育3h 5h 7h；泳道4.5：VWD2-EGFP-卵巢孵育3h 7h；泳道7：对照；泳道9：阳性对照P2C-EGFP蛋白)。
图4为注射VWD1-EGFP和VWD2-EGFP融合蛋白不同时间点米虾性腺荧光检测结果图。
图5为注射VWD1-EGFP融合蛋白米虾性腺Western Blot检测结果图(泳道1：Marker；泳道3：对照；泳道5：注射VWD1-EGFP蛋白3h；泳道7：VWD1-EGFP蛋白)。
图6为VWD1-cas9-GFP融合蛋白表达纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果图(M蛋白分子量标准泳道1.VWD2-cas-GFP蛋白；2:VWD1-cas-GFP蛋白)。
图7为注射VWD1-cas9-GFP和VWD2-cas9-GFP融合蛋白米虾性腺荧光检测图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例中所使用的生物材料异足新米虾购买于浙江水产市场，体长约2cm，健康有活力。米虾购回后养在实验室中。淡水曝气，温度约26-28℃。每日投喂一次虾粮，每隔两周更换新鲜的曝气水。
步骤1.异足新米虾卵黄蛋白原结构域生物信息学分析
通过异足新米虾转录组数据，我们分析出异足新米虾卵黄蛋白原具有8607bp的全长序列，开放阅读框(ORF)为7674bp。
步骤2.Trizol法提取总RNA
取1.5ml的无酶EP管置于液氮中预冷。将米虾迅速放入预冷过的EP管中，按
Figure GDA0002507700240000041
Reagent(Thermo Fisher Scientific)试剂使用说明提取异足新米虾总RNA。具体步骤如下：
(1)提前将研钵等器皿置于烘箱中180℃烘烤至少4h，以防RNA酶污染。烘烤好的研钵在室温冷却后倒入适量液氮降温，此时将冷冻的组织置于预冷好研钵中。用研磨棒快速将其研磨成粉末状；
(2)将研磨好的粉末转入到已加入1mL TRIzol的无酶EP管中。用振荡器充分混匀后，在室温静置10min，4℃，12000g，离心10min；
(3)离心后取上清到一个新的1.5mL无酶EP管中，室温静置5min后加入200μL氯仿，振荡器震荡15s，室温静置10min；
(4)4℃，12000g，离心15min后EP管中液体分为三层：上层无色含有RNA，中间层白色絮状含有DNA，下层粉红色含有蛋白质；
(5)吸取无色上层溶液于新的EP管中，吸取时要尽量小心以防吸到DNA，之后加入500μL异丙醇，用手上下颠倒混匀后，室温静置10min。若RNA含量较少，可以将其置于-20℃冰箱放置0.5h-1h；
(6)将含有RNA的EP管从冰箱中取出，4℃，12000g，离心10min，倒掉上清，残留液体用枪吸尽；
(7)加入配置好的75﹪乙醇1mL，用枪将RNA重悬，洗去杂质；
(8)4℃，7500g，离心5min，弃上清，用枪吸取管中的残留液体后置于滤纸上倒置空干，尽量使乙醇挥发完全。一般为5-10min，时间过长会导致RNA降解；
(9)根据提取到的RNA量的多少加入10-30μL的无酶水溶解RNA。若RNA没有完全溶解，可用55℃的水浴5min促进其溶解；
(10)用超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)检测RNA的浓度。取1μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量。RNA冻存于-80℃冰箱中备用。
步骤3.合成cDNA第一条链
参考反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)使用说明书，反转录获得cDNA第一条链：
按下列组份配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)。
Component Volume(μL)
5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 2μl
Total RNA 500ng
RNase Free dH2O up to 10μl
轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:
37℃ 15min(反转录反应)
85℃ 5s(反转录酶的失活反应)
4℃ ∞
步骤4.基因克隆
1.根据异足新米虾转录组提示利用软件Primer5.0设计卵黄蛋白原ORF区结构域的特异性引物。
表1本研究所用的引物序列
Tab.1 Primers used in the study
Figure GDA0002507700240000051
2.使用PCR技术对cDNA模板进行检测，反应体系如下：
Figure GDA0002507700240000061
PCR反应程序如下：
Figure GDA0002507700240000062
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.连接：1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测后，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书，将目的片段切胶回收纯化。用超微量分光光度计检测胶回收后的DNA浓度，将目的片段连接到pMDTM-18-T Vector上，16℃下过夜连接，连接体系如下：
Figure GDA0002507700240000063
4.转化：采用热激法将上述连接产物转入DH5α感受态中具体步骤为：
①将DH5α菌株接种与6ml的LB培养基中并与次日复摇至OD值为0.6，取1ml DH5α菌株于1.5ml的EP管中并加入100μl 0.1M的CaCl2进行处理，置于冰上3-5h后可用。
②将连接产物全部分别加入到DH5α感受态细胞中，轻轻吸打混匀后冰浴30min。
③将混合物在水浴锅中42℃热激90s后迅速转移到冰上2-3min。
④加LB液体培养基至1mL，37℃，150r/min培养45min-60min。
⑤3000rpm离心5min后，吸取900μl上清，剩下的菌液均匀后涂布于的LB固体培养基上(培养基加有氨苄青霉素)，37℃条件下过夜培养。
5.挑单克隆：次日用灭过菌的枪头挑取多个单菌落于100μl有氨苄抗性的LB液体培养基中，菌体在37℃，220r/min条件下培养3h。以菌液为模板进行PCR检测，阳性克隆菌液送至金唯智生物科技有限公司完成测序。
步骤5.构建Neo-VWD1/VWD2-EGFP-Pet28a表达载体
(1)以提取的质粒pMDTM-18T-VWD1/VWD2为模板，用PCR扩增目的基因片段，反应体系如下：
Figure GDA0002507700240000071
PCR反应程序如下：
Figure GDA0002507700240000072
(2)参照质粒提取试剂盒说明书，提取pET-28a-EGFP质粒(质粒保存在DH5α菌中)。
(3)双酶切：PCR产物电泳检测后，扩大PCR体系，将目的片段切胶回收纯化并测定回收后的DNA浓度。用限制性内切酶BamH I和ASC I酶切目的基因片段以及pET-28a-EGFP质粒。
酶切体系如下：
Figure GDA0002507700240000081
酶切完成后，分别回收纯化目的片段以及载体的大片段。测其浓度后电泳检测目的基因和质粒片段的回收质量。
(4)连接：用T4DNA连接酶连接酶切好的目的片段及载体，反应条件为16℃。连接体系如下：
Figure GDA0002507700240000082
(5)转化：制备大肠杆菌DH5α感受态并转化。将含有转化产物的菌体涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃条件下过夜培养。
(6)挑单克隆：用枪头挑取单菌落，PCR检测后进行测序。
步骤6.蛋白表达
(1)制备BL21(DE3)感受态细胞，提取表达质粒pET-28a-VWD1/VWD2转入BL21(DE3)感受态细胞细胞中。将含有转化产物的菌体涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃条件下过夜培养。同样用PCR检测进行挑克隆检测。
(2)将检测正确的成功导入pET-28a-VWD1/VWD2质粒的BL21(DE3)表达菌分别接种于6ml的LB培养基中，并于次日复摇到600ml的LB培养基中大量培养，培养条件为培养条件为37℃，220rpm。测得OD值为0.6时，加入IPTG在37℃下进行诱导(终浓度为1mM)，6h后4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。
(3)破碎菌体：每300ml离心得到的菌体加30ml破碎缓冲液BufferA。先加入15mLBufferA重悬菌体，之后再将BufferA补到30ml。每管破碎3次，每次破碎完之后要置于冰上降温。破碎完成后4℃，10000rpm，离心10min，上清倒入一个新的离心管中。
(4)洗涤杂蛋白：沉淀用15mL洗涤缓冲液BufferB重悬，之后再将BufferB补到30ml。双手剧烈震荡10-15min后4℃，10000rpm，离心10min，弃去清。
(5)溶解目的蛋白：向沉淀中加入15mL WashI重悬菌体，之后再将Wash I补到30ml。双手剧烈震荡20-25min后4℃，10000rpm，离心10min，目的蛋白溶解上清中。
(6)溶解在BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白用还原性SDS-PAGE凝胶电泳进行检测。
步骤7.蛋白的纯化
(1)配制Wash Ⅰ、Wash Ⅱ、Elution、20％乙醇溶液。上述溶液、去离子水以及目的蛋白均用0.22μm的滤膜抽滤。
(2)目的蛋白上含有六个组氨酸而镍柱可以与其特异性的结合，所以选用Ni-NTA纯化目的蛋白。
具体操作步骤如下：
依次打开开电脑、纯化仪、软件Biotech。设计参数：流速1ml/min，进样Load状态，进样100％，压强0.45MPa
①去离子水洗②20％乙醇洗③装柱子④20％乙醇洗⑤水洗⑥WashⅠ洗⑦蛋白上样⑧WashⅠ洗⑨WashⅡ洗⑩Elution洗(收集洗脱峰液)
Figure GDA0002507700240000099
Elution洗
Figure GDA0002507700240000098
水洗
Figure GDA0002507700240000097
20％乙醇洗
Figure GDA0002507700240000096
卸柱子
Figure GDA0002507700240000095
20％乙醇洗
(3)目的蛋白纯化后进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测。
步骤8.蛋白复性
先用尿素梯度透析复性纯化后的蛋白，在透析袋中装入10ml左右蛋白溶液置于的复性液中(已用0.22μm的滤膜抽滤)进行透析。复性液成分为：50mmol/L Tris-Cl，2mmol/L半胱氨酸，尿素浓度分别为8、6、4、3、2、1mol/L。每个浓度的尿素至少透析4h。最后将蛋白透析到1×PBS溶液中。重组蛋白复性完毕后进行还原性SDS-PAGE电泳检测。
步骤9.体外实验(目的蛋白和组织孵育实验-Western Blot检测)
1.解剖卵巢早期发育的米虾，取其卵巢组织置于等渗PBS中，用提前消毒、灭菌处理过的剪刀对卵巢组织进行修建，等渗PBS清洗三次；
2.将组织平均分到48孔板培养皿中，每孔的卵巢组织量约100mg(两只米虾卵巢重量)；
3.实验分为：VWD1-EGFP实验组，VWD2-EGFPS实验组以及对照组，孵育时间分别是3h5h7h，每个实验组均设计三个平行实验组，培养条件为20℃；实验浓度：每孔终浓度300ng/ul。
4.对应时间取出来之后，等渗PBS冲洗3次，为下一步组织提取做好准备(组织蛋白提取)。(1)组织样品制备：取100-200mg组织加入500ul蛋白提取液(已加蛋白酶抑制剂)，将组织样本充分匀浆，冰上静置30min(每10min振荡裂解)；(2)上柱，10000×g4℃离心5min，收集上清，冻存-80℃；(3)蛋白的定量：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(康为世纪)；
(4)取蛋白溶液中加入2×loading buffer，一般是按1：1，煮沸10min后室温冷却，冻存-20℃；
5.Western Blot
(1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)
(2)电转：1.剪PVDF膜和两张8层滤纸(注：PVDF膜略大于滤纸，PVDF膜可适当修剪以便分清正反面)；2.PVDF膜在甲醇中浸泡20s，在SDW中浸泡2min，在转膜缓冲液中浸泡15min；3.8层滤纸在转膜缓冲液中泡15min，从胶板取下凝胶，去掉浓缩胶后，在转膜缓冲液中浸泡15min；4.用转膜缓冲液润湿机器底盘；5.按如下图方式组装好，12V恒压开始转膜，50-55min；6.封闭(block)：转膜完成后，将PVDF膜泡入5％脱脂奶粉封闭(4℃过夜或室温1h)；7.洗涤：取出PVDF膜，在T-TBS中洗三次，每次15min；8.孵育一抗：用1％封闭液(脱脂奶粉)稀释抗体，鼠源抗体(1:10000)，兔源抗体(1:5000)。将PVDF膜装入塑料密封袋中，加入一抗，封口，摇床室温2h(注：要分别做好标记)；9.洗涤：取出PVDF膜，在T-TBS中洗两次，每次10min，用2.5％封闭液，封闭40min；10.孵育二抗：将PVDF膜装入塑料密封袋中，根据一抗配制二抗1:5000稀释，封口，摇床室温2h；11.洗涤：取出PVDF膜，在T-TBS中洗两次，每次10min；
暗室显影(HRP酶)(1)先配置显影液和定影液。(可重复使用)，准备红色的灯。(2)准备三个搪瓷盘，分别倒入显影液，水，定影液。(3)准备保鲜膜，剪适合大小，放在压片盒内，保证不能起皱。(4)用发光液处理PVDF膜，处理好的膜放入压片盒内的保鲜膜上，保鲜膜大小适当，然后把保鲜膜多余的部分盖在膜上，防止膜变干。(5)放入胶片，盖上压片盒，适当的时间后拿出胶片，一次放入显影液(看见条带后)，水，定影液。(6)在定影液中泡至胶片变色。(7)结束后先收胶片，再开灯，回收显影液定影液。胶片放入水中清洗，使用晾衣夹夹住晾干，或者37度烤干，注意不要把胶片磨花。最后结果用扫描仪扫出来。挑选合适的显影图片保存，结束实验。
步骤10.体内实验(虾体内注射目的蛋白-荧光显微镜观察检测/Western Blot检测)
1.使用显微注射仪分别注射VWD1-EGFP蛋白、VWD2-EGFP蛋白及PBS于10只卵黄发生前期的米虾中(一只米虾血流量预计20ul)，注射量及部位：心腔附近注射10ug(5ul)，12h之后重复注射。
2.检测方法：(1)荧光显微镜观察：3h 5h 7h 12h后分别解剖3只米虾性腺进行观察。拍照记录。(2)Western Blot检测：3h 5h 7h 12h解剖的米虾性腺进行蛋白提取，酶标仪侧蛋白浓度，GFP抗体检测(实验组VWD1-EGFP蛋白注射3h空白对照阳性对照)。
步骤11，米虾VWD1卵黄蛋白-cas9-GFP及VWD2卵黄蛋白-cas9-EGFP载体构建(材料方法同步骤5参考无缝克隆说明书-北京全式金)
所述表达载体采用Cas9-GFP-1EA，目标序列位于该载体的HindIII和Bmt I两限制性内切酶位点之间。所述VWD1卵黄蛋白-cas9-GFP，如SEQ ID NO.3所示，所述VWD2卵黄蛋白-cas9-EGFP，如SEQ ID NO.6所示。
步骤12米虾VWD1卵黄蛋白-cas9-GFP及VWD2卵黄蛋白-cas9-EGFP表达纯化(材料方法同步骤7)
步骤13体内实验(材料方法同步骤10)
向虾体内注射VWD1卵黄蛋白-cas9-GFP及VWD2卵黄蛋白-cas9-EGFP，与对照组(注射PBS)进行荧光显微镜下的观察比较。
实验结果
1.异足新米虾卵黄蛋白原结构域基因克隆结果
将溶解在无酶水中的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果发现与预期大小一致的目的条带(图1)。图1中，1为标准DNA Marker，从上至下大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。克隆出来的目的基因分别是LPD_N结构域、DUF1943结构域和VWD结构域，VWD1，VWD2。
所述VWD1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VWD1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述VWD1卵黄蛋白-cas9-GFP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述VWD2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述VWD2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述VWD2卵黄蛋白-cas9-GFP核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.异足新米虾卵黄蛋白原-EGFP融合蛋白表达及纯化结果
重组蛋白的相对分子量大小约36kD。同时进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳发现目的条带VWD1-EGFP(图2A)和VWD2-EGFP(图2B)。
3.异足新米虾卵黄蛋白原内吞入卵母细胞体外实验(目的蛋白和组织孵育实验-WesternBlot检测)
根据Western Blot检测，图3中与对照组相比，在排除蛋白与性腺物理吸附的条件下，实验组在与VWD1-EGFP蛋白孵育3h，7h的米虾性腺总蛋白中检测出了与阳性对照(VWD1-EGFP1蛋白)大小相似的蛋白，而与VWD2蛋白孵育3h，7h的米虾性腺总蛋白中并未检出与阳性对照(VWD2-EGFP蛋白)大小相似的蛋白。
4.异足新米虾卵黄蛋白原内吞入卵母细胞体内实验(虾体内注射目的蛋白-荧光显微镜观察检测/Western Blot检测)
通过荧光显微镜观察，在图4中，可以观察到与未经蛋白注射过的米虾性腺相比，实验组在VWD1-EGFP蛋白注射3h，12h后能在米虾性腺中观察到有荧光集聚的现象出现，而在进行VWD2-EGFP蛋白注射后3h，12h后未能在米虾性腺中观察到有荧光集聚的现象，说明VWD1能够携带EGFP被卵细胞内吞。
通过Western Blot检测验证，根据图五，进一步得出结论：该蛋白能被米虾性腺卵母细胞表面所内吞。
5.异足新米虾卵黄蛋白原-EGFP-cas9融合蛋白表达及纯化结果
如图6所示，重组蛋白的相对分子量大小约196kD。同时进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳发现目的条带。
6.异足新米虾卵黄蛋白原携带cas9蛋白内吞入卵母细胞体内实验(虾体内注射目的蛋白-荧光显微镜观察检测/Western Blot检测)
如图7所示，通过荧光显微镜观察，可以观察到与未经蛋白注射过的米虾性腺相比，实验组在VWD1-cas9-EGFP蛋白注射12h后能在米虾性腺中观察到有荧光集聚的现象出现，而VWD2-cas9-EGFP蛋白注射后12h未能观察到米虾性腺中荧光聚集。证实VWD1-cas9-EGFP融合蛋白被卵母细胞表面内吞。
讨论
通过荧光显微镜观察，可以观察到与未经蛋白注射过的米虾性腺相比，注射卵黄蛋白原-EGFP融合蛋白的实验组能在米虾性腺中观察到有荧光集聚的现象出现，而且通过Western Blot再次验证VWD1-EGFP融合蛋白能被卵母细胞表面内吞。卵黄蛋白原(Vitellogenin，Vg)是卵黄蛋白的前体，为卵生动物胚胎发育提供必需的营养物质。在卵黄发育期，在激素的诱导下，Vg经过修饰及蛋白酶剪切后，形成Vg聚合体，分泌到血淋巴中并运输至卵巢，由卵巢上的Vg受体识别，通过内吞作用入卵，并在卵内进一步加工成为成熟的卵黄蛋白。VG有营养运输功能，同时能携带部分外源物质一同被摄入卵母细胞中。本发明构建了卵黄蛋白-cas9-GFP载体体系，使用原核表达的方式将蛋白表达并进行了荧光蛋白注射和荧光检测，在蛋白注射12h后能在米虾性腺中观察到有荧光集聚的现象出现，实验证实VWD1-cas9融合蛋白被卵母细胞表面内吞。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的
方法
<130> 1
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<170> PatentIn version 3.5
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aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag 3780
cggatgctgg cttctgccgg cgaactgcag aagggaaacg agctggccct gccctccaaa 3840
tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat 3900
aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga gatcatcgag 3960
cagattagcg agttctccaa gcgcgtgatc ctggccgatg ccaacctgga caaggtgctg 4020
agcgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa tatcatccac 4080
ctgtttaccc tgaccaacct gggagcccct gccgccttca agtactttga caccaccatc 4140
gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc 4200
atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga ccccaagaaa 4260
aagcgcaaag tgctcgagag aagcggcagc ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc 4320
ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctagg atgagcgggg gcgaggagct gttcgccggc 4380
atcgtgcccg tgctgatcga gctggacggc gacgtgcacg gccacaagtt cagcgtgcgc 4440
ggcgagggcg agggcgacgc cgactacggc aagctggaga tcaagttcat ctgcaccacc 4500
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctg gtgaccaccc tctgctacgg catccagtgc 4560
ttcgcccgct accccgagca catgaagatg aacgacttct tcaagagcgc catgcccgag 4620
ggctacatcc aggagcgcac catccagttc caggacgacg gcaagtacaa gacccgcggc 4680
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg caaggacttc 4740
aaggaggacg gcaacatcct gggccacaag ctggagtaca gcttcaacag ccacaacgtg 4800
tacatccgcc ccgacaaggc caacaacggc ctggaggcta acttcaagac ccgccacaac 4860
atcgagggcg gcggcgtgca gctggccgac cactaccaga ccaacgtgcc cctgggcgac 4920
ggccccgtgc tgatccccat caaccactac ctgagcactc agaccaagat cagcaaggac 4980
cgcaacgagg cccgcgacca catggtgctc ctggagtcct tcagcgcctg ctgccacacc 5040
cacggcatgg acgagctgta caggtga 5067

Claims (8)

1.一种多肽，该多肽能够介导外源蛋白的内吞，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种核酸，其特征在于：该核酸编码权利要求1所述的多肽。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于：该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种如权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸在介导外源蛋白内吞中的应用，其特征在于：所述外源蛋白为Cas9，所述内吞发生在异足新米虾卵母细胞中。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：将融合核酸构建进表达质粒，并导入至工程菌，通过工程菌表达收集目标蛋白，将目标蛋白通过显微注射仪注射入卵黄发生前期的米虾心腔附近；所述融合核酸含有融合在同一核酸链中的编码Cas9蛋白的核酸和权利要求2或3所述的核酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述融合核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.一种在异足新米虾中进行基因编辑的方法，其特征在于，该方法包括：将sgRNA和融合蛋白混合以形成RNP复合物，并且将RNP复合物通过显微注射仪注射入卵黄发生前期的米虾心腔附近；所述融合蛋白含有融合在同一肽链中的Cas9多肽和权利要求1所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法还包括：向卵黄发生前期的米虾中导入外源基因模版。
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CN104193814A (zh) * 2014-09-09 2014-12-10 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用
CN108048468A (zh) * 2017-12-27 2018-05-18 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 青虾视蛋白基因及其编码的蛋白和应用
CN109400690A (zh) * 2018-10-30 2019-03-01 天津师范大学 促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用

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