CN109400690A - 促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用。Bursα蛋白具有如SEQUENCE LISTING NO.2所述的氨基酸序列，Bursβ蛋白具有如SEQUENCE LISTING NO.4所述的氨基酸序列。Bursα蛋白和Bursβ蛋白均具有在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量的有益效果。本发明将显著提高水产养殖虾蟹类的抗菌能力，显著降低养殖生产中的死亡率，保证虾蟹健康成长从而大大提高养殖产量和利润。

Description

促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用。

背景技术

在水产养殖过程中，由于疏于预防造成的疾病经常会给养殖者带来巨大的经济损失。水产养殖规模不断扩大化，为农民经济收益增长创造新方式。但传统养殖模式存在的问题，使虾蟹养殖常遇到各种疾病风险。虾蟹养殖过程中常发生疫病，包含细菌病、病毒病等，造成虾蟹厌食、烂鳃、体表溃疡、肌肉白浊等，给养殖生产带来重大损失。

甲壳动物属于无脊椎动物，主要依靠固有免疫系统来对病原微生物进行防御。固有免疫系统包括细胞免疫和体液免疫两类。甲壳动物的细胞免疫包括吞噬作用、包裹和结节反应等。吞噬作用首先是微粒和细胞表面的受体识别并结合，被膜包被后形成吞噬泡之后进一步形成吞噬体，通过吞噬-溶酶体途径抵抗病原微生物的侵染。包被是当病原的体积较大时，宿主用多层血细胞将其包裹并最终分解。结节反应是当病原菌较多的情况下，血细胞大量凝结将其固定并阻止扩散。此时血细胞之间以及血细胞与病原菌之间均有连接，与包被有所区别。

体液免疫是通过产生的免疫效应物质酚氧化酶、C型凝集素、抗菌肽分子等抵御病原微生物的入侵。激活机体包括酚氧化酶原激活途径、Toll通路、IMD通路以及JAK/STAT通路。酚氧化酶原激活途径是由位于细胞表面上的受体(PRRs)和病原微生物识别并结合引起丝氨酸蛋白酶级联反应，形成有活性的酚氧化酶进一步催化单酚化合物转化为邻二醌，最终形成黑色素参与病原体的黑化反应。在此过程中伴随有抗菌因子和调理素样因子的形成，对包裹反应有促进作用。Toll通路能够影响抗菌肽基因、一些小分子蛋白基因以及结节作用相关基因等的转录表达来调节免疫过程。在对虾中己找到Toll通路上的许多同源物质，如Toll样受体，MyD88，TRAF6，Dorsal等并且影响对虾抵抗细菌或病毒的能力。Toll通路主要识别革兰氏阳性菌和真菌而IMD通路主要识别革兰氏阴性菌。研究证实，在中国对虾和克氏原鳌虾中IMD通路对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)免疫应答中抗菌肽表达情况有调节作用。JAK/STAT通路是通过细胞受体和外源性配体分子结合诱发JAK酶酪氨酸磷酸化募招STAT因子，STAT磷酸化后进入细胞核调控免疫相关基因的表达。已经发现凡纳滨对虾和日本囊对虾中JAK/STAT

通路在免疫中发挥重要作用。此外抗菌肽能够清除和消灭病原微生物，可由Toll通路和IMD通路诱导生成，在甲壳动物的体液免疫中具有重要作用。

抗菌肽种类多样，包括是由多种类型以及亚型，如Anti-lipopolysaccharidefactor、Crustins、lysozyme等。Crustins具有亲水性并且富含半胱氨酸抗菌肽，其N端含有一段信号肽，C端有一段乳清酸蛋白(WAP)结构域。最早在青蟹(Carcinus maenas)的血细胞中分离出分子量大小为11.5kD的一种crustin。根据信号肽与WAP结构域之间组成结构可以将Crustins分为三类。Crustin I中信号肽和WAP结构域之间富含半胱氨酸但不会多于6个，“4DSC”结构域不完整，常见于蟹和龙虾中。Crustin II中信号肽和WAP结构域之间不仅富含半胱氨酸残基而且在信号后还有一段区域富含甘氨酸，常见于对虾中。Crustin III中信号肽和WAP结构域之间含有一段富含脯氨酸和精氨酸的区域，在斑节对虾(Penaeusmonodon)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneropenaeuschinensiss)中发现有Crustin III的存在。Crustins在甲壳动物的血细胞中表达的表达量比较高。RNA干扰技术沉默掉crustins基因后，虾在感染弧菌后死亡率升高，证实crustins对抑制革兰氏阴性菌的生长。同时发现crustins对革兰氏阳性菌的也有抑制作用。CrustinIII除了对细菌的抑制作用外还有蛋白酶抑制剂的活性。而蛋白酶抑制剂对微生物蛋白酶抵御作用，更有利于Crustin III发挥免疫调节作用。

抗脂多糖因子(ALF)是一种可以与脂多糖(LPS)结合，介导细胞去颗粒作用导致细胞内凝集的抗菌肽。最先从中国鲎(Tachypleus tridentatus)和北美鲎(Limuluspoiyphemus)中的血细胞分离得到。ALF基因编码114-124个氨基酸，N端含有一段的信号肽，分泌蛋白分子量大小约11kD。一般情况下，ALF分泌蛋白的N端有一段高度疏水性氨基酸，C端包含有一个脂多糖结合结构域(LPS-BD)。ALF同样包含不同的亚型，其中大多数主要在血细胞中表达。斑节对虾中包含6中亚型的ALF。在凡纳滨对虾中鉴定出了两种ALF亚型。中华绒鳌蟹中有3种的ALF亚型而且在免疫过程中的作用有所差别。用双链RNA凡纳滨对虾的ALF基因敲降后感染V.penaeicida和F.Oxysporum，实验组死亡率明显比对照组高，说明ALFs对细菌和真菌感染有抵抗作用。在中华绒鳌蟹中发现ALF2对Listonella anguillarum和Pichia pastoris有抑制作用。以小龙虾为研究对象dsRNA使得ALF基因沉默后，造血组织细胞中WSSV的外周蛋白VP28表达量提升，猜想ALF对抑制病毒的感染中也有一定的作用。溶菌酶存在与多种生物中，可以依靠裂解细菌或非酶促抗菌途径来调节免疫反应。淋巴组织、血细胞、胃和鳃四种组织中菌存在溶菌酶。有研究表明溶菌酶有抗病毒的能力，如当虾感染WSSV时，溶菌酶表达量会增多。虾中的病原微生物种类不同时，抗菌肽免疫作用不同，提示虾体内存在复杂的抗菌网络从而有利的预防疾病的发生。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进米虾抗菌肽增多的Bursα蛋白。

本发明的另一目的是提供上述Bursα蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

本发明的另一目的是提供促进米虾抗菌肽增多的Bursβ蛋白。

本发明的另一目的是提供上述Bursβ蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种促进米虾抗菌肽增多的Bursα蛋白，该Bursα蛋白具有如SEQUENCELISTINGNO.2所述的氨基酸序列。

上述Bursα蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

在上述技术方案中，抗菌肽基因为ALF、Cru或Lyso。

在上述技术方案中，提高米虾抗菌肽基因表达量的步骤为：

1)将Bursα蛋白溶液装入透析袋，再将所述透析袋置于复性液中进行透析，透析六次，其中，所述复性液成分为：50mmol/L Tris-Cl、2mmol/L GSH还原型谷胱甘肽、0.2mmol/LGSSG氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L精氨酸和尿素，六次透析中尿素的浓度先后依次为8、6、4、3、2、1mol/L，每次透析的时间至少为4h，再将Bursα蛋白透析到1×PBS溶液中，得到α亚基同源二聚体；

2)向米虾注射所述α亚基同源二聚体，注射量为60～80ng。

在上述技术方案中，在所述步骤1)之前，对Bursα蛋白进行纯化。

一种促进米虾抗菌肽增多的Bursβ蛋白，该Bursβ蛋白具有如SEQUENCE LISTINGNO.4所述的氨基酸序列。

上述Bursβ蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

在上述技术方案中，抗菌肽基因为ALF、Cru或Lyso。

在上述技术方案中，提高米虾抗菌肽基因表达量的步骤为：将Bursβ蛋白透析到1×PBS溶液中，得到β亚基同源二聚体，向米虾注射所述β亚基同源二聚体，注射量为60～80ng。

在上述技术方案中，在所述步骤1)之前，对Bursβ蛋白进行纯化。

本发明的有益效果：

本发明将显著提高水产养殖虾蟹类的抗菌能力，显著降低养殖生产中的死亡率，保证虾蟹健康成长从而大大提高养殖产量和利润。

附图说明

图1为米虾bursicon-α核酸序列及预测的氨基酸序列；

图2为米虾bursicon-β核酸序列及预测的氨基酸序列；

图3为Bursα和Bursβ重组蛋白纯化前SDS-PAGE电泳分析；

图4为Bursα和Bursβ蛋白表达纯化后SDS-PAGE电泳图；

图5为α和β同源二聚体蛋白对米虾抗菌肽表达的影响。

具体实施方式

浙江米虾在浙江水产市场购买，体长约1.5-2.5cm，体重每只大约50-100mg，健康有活力。米虾购买回后养在实验室中。水曝气，温度约26-28℃。每日投喂两次虾粮，每隔两日更换新鲜的曝气水。

短离：时间为3s,1000rpm。

bursicon-α具有如SEQUENCE LISTING NO.1所述的DNA序列。

Bursα蛋白具有如SEQUENCE LISTING NO.2所述的氨基酸序列。

bursicon-β具有如SEQUENCE LISTING NO.3所述的DNA序列。

Bursβ蛋白具有如SEQUENCE LISTING NO.4所述的氨基酸序列。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

步骤1，Trizol法提取总RNA

取1.5ml的无酶的EP管置于液氮中预冷，挑选3-4只米虾迅速放入预冷过的EP管中，按Reagent(Thermo Fisher Scientific)试剂使用说明提取米虾总RNA，具体步骤如下：

(1)提前将研钵、剪刀镊子器皿置于烘箱中于180℃烘烤4h，用于防止RNA酶污染，将烘烤完的研钵在室温20～25℃冷却后倒入适量液氮再次降温，得到预冷的研钵，此时将冷冻的米虾置于预冷的研钵中，用研磨棒快速将其研磨成粉末；

(2)将50mg粉末转入到已加入1mLTRIzol(中文)的无酶EP管中，用振荡器充分混匀后，在室温20～25℃静置10min，于4℃离心10min，离心的离心力为12000g；

(3)离心后取上层清液到一个新的1.5mL无酶EP管中，室温20～25℃静置5min后加入200μL氯仿，用振荡器震荡15s，室温20～25℃静置10min；

(4)将静置的液体于4℃离心15min，离心的离心力为12000g，在EP管中液体分为三层：上层无色含有RNA，中间层白色絮状含有DNA，下层粉红色含有蛋白质；

(5)吸取无色的上层溶液于新的EP管中，吸取时要尽量小心以防吸到DNA，吸取后再在吸取后的溶液中加入500μL异丙醇，用手上下颠倒混匀后，室温20～25℃静置10min，将其置于冰箱于-20℃放置1h(因RNA含量较少)。

将含有RNA的EP管从冰箱中取出，于4℃离心10min，离心力为12000g，倒掉上层清液，EP管中残留液体用枪吸尽，在枪吸出的液体中加入1mL已配置好的75﹪(体积浓度)乙醇水溶液，用枪将RNA反复吹打，洗去杂质；

(6)将步骤(5)所得液体在EP管于4℃离心5min，离心力为7500g，弃去上层清液，用枪吸取EP管中残留液体后置于滤纸上倒置空干5-10min，以使乙醇挥发完全。其中，空干时间一般为5-10min，时间过长会导致RNA降解；

(7)根据提取到的RNA量的多少加入30μL的无酶水溶解RNA，得到RNA无酶水溶液。若RNA没有完全溶解，可再用55℃的水浴5min促进其溶解；

(8)用超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)检测RNA无酶水溶液中RNA的浓度：取1μLRNA无酶水溶液用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，RNA无酶水溶液冻存于-80℃冰箱中备用。

步骤2，合成cDNA第一条链

参考反转录试剂盒(one-step gDNA Remover and cDNA SynthesisSuperMix)使用说明书，反转录获得cDNA第一条链，具体步骤如下：

(1)处理复杂RNA

RNA无酶水成分：没有RNA酶的去离子水。

将RNA无酶水溶液吸打混匀后短离，于65℃孵育5min，再冰浴2min，冰浴的温度为0摄氏度。

(2)第一链cDNA合成和gDNA去除

继续加入上述试剂后短离，于42℃孵育30min。

(3)再于85℃加热5s，以使RT/RI与gDNA Remover失活。

步骤3，克隆bursicon-α和bursicon-β基因

(1)根据转录组的提示，设计用于扩增bursicon-α和bursicon-βORF区的特异性引物——(bursicon-αF、bursicon-αR、和bursicon-βF和bursicon-βR，见表1。

(2)以反转录获得的cDNA为模板，利用PCR仪扩增目的基因片段，反应体系如下：

在PCR小管中按照上述要求加入相应的试剂，反应体系是25μL。

PCR反应程序如下(其中bursicon-α和bursicon-β的退火温度分别为55℃和60℃)：

(3)连接：用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测后，扩大体系，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书，将目的片段切胶回收纯化，用超微量分光光度计检测切胶回收后的DNA浓度，将目的片段连接到pMDTM-18-T Vector上，于16℃下过夜(12小时)连接，得到连接产物pMD18-T-α和pMD18-T-β，其中，连接体系如下：

(4)转化：采用热激法将上述连接产物pMD18-T-α和pMD18-T-β分别转入DH5α感受态细胞中，每个连接物转入DH5α感受态细胞中的具体步骤如下：

①将DH5α菌株接种于6ml的LB培养基中并复摇至OD值为0.6，取1ml含有DH5α菌株的LB培养基中于1.5ml的EP管中并加入100μl 0.1M的Cacl₂水溶液进行处理：将EP管置于冰上5h后，以使EP管内溶液的温度下降至0摄氏度。

②将连接产物加入到DH5α感受态细胞中，轻轻吸打混匀后冰浴30min，得到混合物。

③将混合物在水浴锅中于42℃热激90s后迅速转移到冰上3min，以使混合物的温度降至0摄氏度。

④在混合物中加1mL LB液体培养基，于37℃和150r/min条件下培养45min。

⑤在3000rpm离心5min，离心后吸取900μl上层清液，剩下的菌液均匀后涂布于LB固体培养基上(培养基加有氨苄青霉素)，于37℃条件下培养12小时(过夜)。

(5)挑单克隆：用灭过菌的牙签挑取多个转入有连接产物的DH5α菌的单菌落于50μl有氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃和220r/min的条件下培养3h，得到菌液，以菌液为模板进行PCR检测，阳性克隆菌液抽提出质粒送至金唯智生物科技有限公司完成测序。

表1用于扩增bursicon-α和bursicon-βORF区的特异性引物

步骤4，序列的生物信息学分析

用DNAStar(version7.1)软件分析bursicon-α和bursicon-β基因序列和氨基酸序列，利用蛋白组学在线网址ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性质，用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白结构域，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)检测蛋白是否有信号肽。

bursicon两个亚基同源二聚体的原核表达蛋白

构建bursicon-α和bursicon-β基因表达载体

(1)根据克隆得到的结果，设计扩增两亚基基因去掉信号肽后核苷酸序列的特异性引物——bursicon-αF’、bursicon-αR’、bursicon-βF’、bursicon-βR’，见表2，其中，在特异性引物上游引物的5’端加入了BamH I酶切位点，在两对特异性引物上游引物的下游引物的3’端加入了Hind III酶切位点。

(2)以步骤3中(5)挑单克隆提取的质粒为模板，用PCR扩增目的基因片段，反应体系如下：

在PCR小管中按照上述要求加入相应的试剂，反应体系是25μL。

PCR反应程序如下(其中，bursicon-α和bursicon-β片段引物的退火温度分别依次为61℃和64℃)：

(3)参照质粒提取试剂盒说明书，提取pET-28a-c(+)质粒(质粒保存在DH5α菌中)。

(4)双酶切：PCR产物电泳检测后，扩大PCR体系，将目的片段切胶回收纯化并测定回收后的DNA浓度。用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切bursicon-α和bursicon-β的目的基因片段以及pET-28a-c(+)质粒。

酶切体系如下：

酶切完成后，分别回收纯化目的片段以及载体的大片段。测其浓度后电泳检测目的基因和质粒片段的回收质量。

(5)连接：用T4 DNA连接酶连接酶切好的目的片段及载体，反应条件为16℃，分别得到连接产物pET-28a-α和pET-28a-β。连接体系如下：

试剂	体积(μL)
		bursicon-α/bursicon-β目的基因片段	6
pET-28a-c(+)质粒片段	1
		T4 DNA连接酶	0.5
10×T4 Buffer	1
		SDW	1.5

步骤5，Bursα和Bursβ的表达

(1)制备Rosetta感受态细胞，提取表达质粒pET-28a-α或pET-28a-β，采用热激法将表达质粒pET-28a-α、pET-28a-β分别转入Rosetta感受态中，具体步骤同步骤3中的(4)转化。

将含有转化产物的菌体涂布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB固体培养基上，于37℃条件下培养12小时，同样用PCR检测进行挑克隆检测。

(2)将检测正确的成功导入，将pET-28a-α和pET-28a-β质粒的Rosetta表达菌分别接种于6ml的LB培养基中，并复摇到600ml的LB培养基中大量培养，培养条件为37℃，220rpm。测得OD值为0.6时，加入IPTG异丙基硫代半乳糖苷，在37℃下进行诱导(终浓度为1mM)，6h后于4℃离心10min，离心速度为10000rpm，收集菌体。

(3)破碎菌体：在每300ml离心得到的菌体中加入30ml破碎缓冲液Buffer A，其中，先加入15mL Buffer A重悬菌体，之后再将Buffer A补到30ml，每管破碎3次，每次破碎完之后要置于冰上降温，降温至0摄氏度。破碎完成后于4℃离心10min，离心速度为10000rpm，离心后的上层清液倒入一个新的离心管中。

(4)洗涤杂蛋白：再次离心，弃去上层清液，沉淀用15mL洗涤缓冲液Buffer B重悬，之后再将Buffer B补到30ml，双手剧烈震荡15min后于4℃离心10min，离心速度为10000rpm，弃去上层清液。

(5)溶解目的蛋白：向沉淀中加入15mL Wash I重悬菌体，之后再将Wash I补到30ml。双手剧烈震荡25min后于4℃离心10min，离心速度为10000rpm，目的蛋白溶解在上层清液中，得到Bursα蛋白和Bursβ蛋白。

在(3)～(5)中，用还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测溶解在Buffer A、Buffer B和Wash I中的蛋白。

步骤6，Bursα和Bursβ蛋白的纯化

(1)配制WashⅠ、WashⅡ、Elution、体积浓度为20％的乙醇水溶液。WashⅠ、WashⅡ、Elution、体积浓度为20％的乙醇水溶液、去离子水以及Bursα蛋白和Bursβ蛋白均用0.22μm的滤膜抽滤。

(2)目的蛋白上含有六个组氨酸，而镍柱可以与其特异性的结合，所以选用Ni-NTA纯化目的蛋白。

具体操作步骤如下：

依次打开电脑、纯化仪、软件Biotech，设计参数：流速1ml/min，进样Load状态，进样口B口，压强0.5MPa

i.去离子水洗

ii.体积浓度为20％的乙醇水溶液洗

iii.装柱子(注意此时系统不用暂停)

iv.体积浓度为20％的乙醇水溶液洗

v.水洗

vi.WashⅠ洗

vii.蛋白上样

viii.WashⅠ洗

ix.WashⅡ洗

x.Elution洗(收集洗脱峰液)

xi.Elution洗

xii.水洗

xiii.体积浓度为20％的乙醇水溶液洗

xiv.卸柱子(柱子保存在4℃)

xv.体积浓度为20％的乙醇水溶液洗

(3)Bursα和Bursβ目的蛋白纯化后进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测。

步骤7，Bursα和Bursβ蛋白的复性

先用谷胱甘肽氧化还原体系透析复性纯化后的Bursα蛋白，在透析袋中装入5mlBursα蛋白溶液，再将透析袋置于1ml的复性液中(已用0.22μm的滤膜抽滤)进行透析。复性液成分为：50mmol/L Tris-Cl、2mmol/L GSH还原型谷胱甘肽、0.2mmol/L GSSG氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L精氨酸和浓度分别先后依次为8、6、4、3、2、1mol/L的尿素，每个浓度的尿素至少透析4h。最后将Bursα蛋白透析到1×PBS溶液中，得到α亚基同源二聚体(Burα-α)。

将Bursβ直接透析到1×PBS中，得到β亚基同源二聚体(Burβ-β)。

两个重组蛋白复性完毕后分别进行还原性SDS-PAGE和非还原性SDS-PAGE电泳检测。

步骤8，实时荧光定量PCR分析注射bursicon同源二聚体蛋白后抗菌肽的表达

选取处于蜕皮间期(C期)的米虾作为实验材料。将米虾分为三组，用显微注射器分别向对照组米虾中注射PBS，向2个实验组米虾中各注射α亚基同源二聚体(Burα-α)和β亚基同源二聚体(Burβ-β)，注射量均为80ng。分别在注射后0.5h、1h、3h取样，提取九组米虾的RNA并进行反转录(方法同步骤2)，如图5所示。采用定量PCR检测三组抗菌肽相对表达量的变化。

(1)依据转录组提示，设计bursicon-α和bursicon-β的定量PCR引物(bursicon-αQPCRF、bursicon-αQPCR R、bursicon-βQPCR F、bursicon-βQPCR R，表2)。

(2)不同组织的cDNA用Nanodrop 2000检测浓度后，用无酶水将浓度都稀释为100ng/μL。使用实时荧光定量PCR仪FAST7500(ABI)，分别以bursicon-αQPCR F、bursicon-αQPCR R、bursicon-βQPCR F和bursicon-βQPCR R的cDNA为模板，检测bursicon-α和bursicon-β在不同组织中的相对表达量。反应按照FastStar Universal SYBR GreenMaster(Rox)说明书进行，反应体系为25μL：

两步法反应程序：

以β-actin为内参基因。每组样品设3个平行，按2-△△Ct法对得到的数值进行处理，用SPSS17.0软件分析不同组织中bursicon-α和bursicon-β的相对表达量是否有显著性差异，最后用Origin 8.0作图。

表2本发明所用到的引物序列

实验结果

1.bursiconα/β基因cDNA序列分析

米虾bursicon-α基因开放阅读框(ORF)为441bp，编码146个氨基酸，翻译的蛋白理论等电点为5.67，预测分子量为15993.65Da，氨基酸序列的1-26位是信号肽(GenBank登录号：MG766223)。经保守结构域预测bursicon-α基因翻译形成的氨基酸序列具有一个C末端胱氨酸结节状结构域(CTCK)，长度为89个氨基酸，位于氨基酸序列的第31-119位并且该结构域与二聚体的形成有关。此外α亚基含有11个半胱氨酸残基(图1)。bursicon-β基因开放阅读框(ORF)为411bp，编码136个氨基酸，翻译的蛋白理论等电点为6.07，预测分子量为15145.19Da，氨基酸序列的1-21位是信号肽(GenBank登录号：MG766224)。bursicon-β基因翻译形成的氨基酸序列同样含有一个C末端胱氨酸结节状结构域(CTCK)，长度为103个氨基酸，位于氨基酸序列的第30-132位。此外β亚基中也含有11个半胱氨酸残基(图2)。

在图1中，双下划线的氨基酸序列为预测的信号肽序列，单下划线的氨基酸序列为预测的CTCK结构域。灰色阴影部分即为11个半胱氨酸残基。终止密码子用星号(*)标记。在图2中，双下划线的氨基酸序列为预测的信号肽序列，单下划线的氨基酸序列为预测的CTCK结构域。灰色阴影部分即为11个半胱氨酸残基。终止密码子用星号(*)标记

2米虾Bursα和Bursβ重组蛋白的表达结果

溶解在BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果发现在10-25kD间有一蛋白条带，表达量较其它蛋白大并且和预期大小基本一致，说明获得了Bursα和Bursβ重组蛋白。bursicon-α溶解含有8M尿素的Wash I中，以包涵体的形式大量表达。bursicon-β溶解不含尿素的Buffer A中，形成可溶性蛋白(图3)。在图3中：

M.蛋白分子量标准，1-5.导入pET-28a-α质粒的菌体蛋白1-2.BufferA，3.BufferB，4-5.Wash I；6-11.导入pET-28a-β质粒的菌体蛋白6-7.BufferA，8.BufferB，9-10.WashI

3重组蛋白Bursα、Bursβ的复性结果

α亚基去掉信号肽后蛋白的相对分子量大小约13.15kD，加上表达载体pET-28a-c(+)上的His标签蛋白后，重组Bursα蛋白的相对分子量大小约16.70kD；β亚基去掉信号肽后蛋白的相对分子量大小约12.70kD，加上表达载体pET-28a-c(+)上的His标签蛋白后，重组Bursβ蛋白的相对分子量大小约16.24kD(图4A，还原性胶)。此外Bursα和Bursβ蛋白进行非还原性SDS-PAGE凝胶电泳发现各自可形成部分的同源二聚体蛋白(图4B，非还原性胶)。在图4A和4B中：

M：蛋白分子量标准，A1：α亚基单体，A2：β亚基单体，B1：α亚基单体和同源二聚体，B2：β亚基单体和同源二聚体

4鞣化激素α和β亚基同源二聚体蛋白对米虾三组抗菌肽表达的影响

选取蜕皮周期处于C期米虾作为研究对象，用显微注射法将原核表达的α和β亚基同源二聚体蛋白注射到米虾体内。在处理后的不同时间(0.5h,1h,3h)取样，用定量PCR检测三组抗菌肽基因(ALF、Cru、Lyso)的表达情况，结果表明，与对照组相比，α和β亚基同源二聚体均可诱导三组抗菌肽表达量不同程度的提高(图5)。

在图5中，Control：注射PBS的对照组；Bursα：注射α同源二聚体蛋白的实验组；Bursβ：注射β同源二聚体蛋白的实验组。用SPSS Statistics 17.0进行单因素ANOVA分析，不同的大写字母表示组间存在显著性差异，不同的小写字母表示组内存在显著性差异(P<0.05,Duncan氏检验法)

讨论

本发明首次克隆获得了米虾鞣化激素两个亚基基因的ORF区序列。bursicon-α基因ORF区长441bp，编码146个氨基酸；bursicon-β基因ORF区长411bp，编码136个氨基酸(图1、图2)。序列分析表明，米虾中克隆得到的鞣化激素与其他甲壳纲和昆虫纲中的物种有较高的序列一致性，说明克隆得到的基因的确是鞣化激素基因。米虾Bursicon-α和Bursicon-β都有一个CT结构域，并且氨基酸序列中均含有11个半胱氨基酸残基(图1、图2)。在C1-7，C2-8，C3-9，C4-10，C5-C11间存在二硫键，而且C6是两个亚基即BURS和PBURS的聚合位点。在C3和C4之间的氨基酸序列为X-G-X(X代表任意氨基酸残基)，C6与C7紧密相邻，C9和C10间隔一个氨基酸残基。研究发现鞣化激素属于分泌蛋白，合成以后会分泌到血淋巴中发挥作用。米虾的bursicon-α和bursicon-β基因分别含有26和21个氨基酸的信号肽，属于分泌蛋白，与上述结果相吻合。目前已经在蓝蟹和斑节对虾中表达出了鞣化激素两个亚基基因的蛋白，但是关于米虾鞣化激素蛋白的表达还有待进一步研究。

本发明以米虾为研究对象，利用BamH I和Hind III限制性内切酶，成功构建了鞣化激素两个亚基基因的表达载体pET-28a-α和pET-28a-β。将表达载体导入Rosetta表达菌中后，通过对表达条件的筛选发现在37℃，220rpm，IPTG终浓度为1mM时，能够大量表达Bursα和Bursβ蛋白。An等研究发现黑腹果蝇体(Drosophila melanogaster)中鞣化激素两个亚基基因蛋白大约为15kD。在甲壳纲的蓝蟹(Callinectes sapidus)中鞣化激素两个亚基基因蛋白也大约为15kD。在本实验中将原核表达获得的Bursα和Bursβ重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示Bursα和Bursβ重组蛋白的相对分子质量分别为16.70kD和16.24kD，与果蝇和蓝蟹中鞣化激素亚基的分子量大小相近，而且表达纯化后的Bursα和Bursβ蛋白为进一步研究其结构和功能奠定了基础。

将表达纯化后的Bursα和Bursβ蛋白，进行非还原性SDS-PAGE凝胶电泳发现各自形成了部分的同源二聚体。Luo等以黑腹果蝇为研究对象证实可以在体外形成α和β亚基的同源二聚体。此外在家蝇中也有关于Bursα和Bursβ两个亚基表达的相关研究。在蓝蟹中的研究发现bursicon-β的相对表达量几乎是bursicon-α相对表达量的3倍，说明两个亚基很可能形成各自的同源二聚体。

为了进一步证实该研究结果，分别构建了鞣化激素两个亚基的原核表达载体，利用表达菌Rosetta表达α和β亚基的同源二聚体蛋白Bursα-α和Bursβ-β。将二者注射到米虾体内，定量PCR检测上述三组抗菌肽的表达量。结果发现在注射后0.5h，1h，3h三组抗菌肽的相对表达量与对照组相比都有不同程度的上调。通过上述两个实验，猜测鞣化激素两个亚基的同源二聚体参与米虾的免疫相关反应。在果蝇中的研究发现，重组BURS或PBURS同源二聚体可以使得抗菌肽的相对表达量上调，并且能抑制革兰氏阴性细菌的生长。说明α和β亚基的同源二聚体可以参与机体的免疫调控。随后以埃及伊蚊为研究对象，也得到了类似的结果。虽然鞣化激素两个亚基同源二聚体调节抗菌肽表达具体机制尚不清楚，但是节肢动物刚刚蜕皮后，新形成的表皮比较柔软，容易感染病原微生物等，而抗菌肽可以起到有效的防护作用。

本研究受到天津市人才发展特殊支持计划高层次创新创业团队项目，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)支持。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进米虾抗菌肽增多的Bursα蛋白，其特征在于，该Bursα蛋白具有如SEQUENCELISTING NO.2所述的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的Bursα蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，抗菌肽基因为ALF、Cru或Lyso。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，提高米虾抗菌肽基因表达量的步骤为：

1)将Bursα蛋白溶液装入透析袋，再将所述透析袋置于复性液中进行透析，透析六次，其中，所述复性液成分为：50mmol/L Tris-Cl、2mmol/L GSH还原型谷胱甘肽、0.2mmol/LGSSG氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L精氨酸和尿素，六次透析中尿素的浓度先后依次为8、6、4、3、2、1mol/L，每次透析的时间至少为4h，再将Bursα蛋白透析到1×PBS溶液中，得到α亚基同源二聚体；

2)向米虾注射所述α亚基同源二聚体，注射量为60～80ng。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述步骤1)之前，对Bursα蛋白进行纯化。

6.一种促进米虾抗菌肽增多的Bursβ蛋白，其特征在于，该Bursβ蛋白具有如SEQUENCELISTING NO.4所述的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的Bursβ蛋白在诱导提高米虾抗菌肽基因表达量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抗菌肽基因为ALF、Cru或Lyso。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，提高米虾抗菌肽基因表达量的步骤为：将Bursβ蛋白透析到1×PBS溶液中，得到β亚基同源二聚体，向米虾注射所述β亚基同源二聚体，注射量为60～80ng。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述步骤1)之前，对Bursβ蛋白进行纯化。