CN110699358B - 一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链rna及其应用 - Google Patents

一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链rna及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链RNA及其应用，本发明构建中华绒螯蟹参与天然免疫、细胞增殖、组织生成重要基因EsMMP‑14的RNAi载体，可用于提高中华绒螯蟹的抗病性，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。

Description

一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链RNA及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链RNA及其应用。
背景技术
基质金属蛋白酶是一种钙离子依赖的含锌离子的内肽酶。由于其内部含有Zn2+，活性部位包含金属蛋白酶残基，因此命名为基质金属蛋白酶。MMPs最早是由Gross和Lapier于1962年在蝌蚪断尾时发现的一种能够降解胶原纤维的蛋白酶。随着对MMPs家族研究的深入，被发现的基质金属蛋白酶家族中的成员多达50余种。MMPs家族成员具有多种功能，参与降解细胞与细胞之间的连接、细胞与基底膜之间的连接、降解基底膜和细胞外基质组分，如MMP-1参与细胞质外基质(ECM)的降解；MMP-7能够切割活化TNF-α等促炎因子。基质金属蛋白酶主要存在于细胞质外基质和细胞质内，细胞外基质中的MMPs一部分参与细胞外基质及基底膜组分的水解过程，一部分参与细胞表面上一些受体或信号分子的修饰、活化或信号传递过程，而在细胞质内的MMPs，参与蛋白质降解及其他生理过程。此外，有一小部分MMPs定位在细胞膜上，作为特定配体的受体或信号分子，也参与细胞迁移、血管生成等过程中细胞间通讯识别的分子。由于MMPs参与基底膜的重构过程，近年来主要研究其在哺乳动物肿瘤微环境中的作用和炎症过程中其发挥的功能，如MMP-1参与基底膜和坏死细胞组分的水解，因此在炎症组织中表达量较高；MMP-19参与上皮细胞迁移和新组织生成等过程，可能参与肿瘤形成和迁移过程，并且增强一些MMPs的活性可以增强或抑制肿瘤生长。在哺乳动物的研究中发现MMP-14不仅参与了肿瘤细胞迁移、上皮细胞迁移，还参与肾小管形成、胚胎发育等过程，同时也是一种抗炎因子。MMP-14参与上皮细胞增殖和迁移过程，可能参与了甲壳动物的蜕皮过程，与一些免疫分子相互作用，共同维护甲壳动物健康。这些研究都表明MMPs参与天然免疫、细胞增殖、组织生成等多种生理过程。
研究表明，凡纳滨对虾在感染对虾白斑综合征病毒后，其体内的MMP-2(LvMMP-2)表达量显著上升；此外，脂多糖LPS也可以使LvMMP-2的表达量显著上调。在凡纳滨对虾受到氧化损伤，LvMMP-2的表达水平也有显著提升。提示凡纳滨对虾体内的MMP-2参与其天然免疫及氧化损伤过程。同时，进一步研究发现，凡纳滨对虾原癌基因c-Jun可以增强LvMMP-2的启动子活性，促进其转录；而降低LvMMP-2的表达量，使对虾抗菌肽2(PEN2)和β-防御素的启动子活性显著降低。这些研究都提示MMPs家族参与了甲壳动物的天然免疫过程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，构建中华绒螯蟹参与天然免疫、细胞增殖、组织生成重要基因EsMMP-14的RNAi载体，可用于提高中华绒螯蟹的抗病性，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。
本发明的第一个方面是提供一种双链RNA，该双链RNA由正义链和反义链组成，正义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO.2所示序列。
正义链序列：
CUCUAGAUGUUCAACCCUCAGUCCGGCGCUCUGCUCUCCCAAGACAAGCUGAGAGAAAGCAUCAUGGAGUUCCAGGCGUUCGCUGGACUUGAUCAGACGGGUGAACUCGACAACUCGACUCUGGAGAUGAUGAACACCCCGCGUUGUGGCGUCAAGGACAAGGUCGGCUUCGGCACCAGAGCCAGGAGGAAGCGCUAUGCCCUGCAAGGAUCAAGGUGGAGGGUGAAGACUCGAAUUCG
反义链序列：
CGAAUUCGAGUCUUCACCCUCCACCUUGAUCCUUGCAGGGCAUAGCGCUUCCUCCUGGCUCUGGUGCCGAAGCCGACCUUGUCCUUGACGCCACAACGCGGGGUGUUCAUCAUCUCCAGAGUCGAGUUGUCGAGUUCACCCGUCUGAUCAAGUCCAGCGAACGCCUGGAACUCCAUGAUGCUUUCUCUCAGCUUGUCUUGGGAGAGCAGAGCGCCGGACUGAGGGUUGAACAUCUAGAG
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的双链RNA在沉默EsMMP-14基因中的应用，其中所述EsMMP-14基因为下列核苷酸序列之一：
1)中华绒螯蟹EsMMP-14基因，序列表中SEQ ID NO.3所示序列；
CTCTAGATGTTCAACCCTCAGTCCGGCGCTCTGCTCTCCCAAGACAAGCTGAGAGAAAGCATCATGGAGTTCCAGGCGTTCGCTGGACTTGATCAGACGGGTGAACTCGACAACTCGACTCTGGAGATGATGAACACCCCGCGTTGTGGCGTCAAGGACAAGGTCGGCTTCGGCACCAGAGCCAGGAGGAAGCGCTATGCCCTGCAAGGATCAAGGTGGAGGGTGAAGACTCGAATTCG
2)与中华绒螯蟹EsMMP-14基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明的第三个方面是提供第一个方面所述的双链RNA在制备中华绒螯蟹抗病试剂中的应用。
本发明的第四个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的双链RNA。
所述表达载体是多基因组装过程中承载与表达外源基因片段的载体，可以采用多基因组装过程中常用的载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述表达载体采用PetT7，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。
优选地，所述载体为PetT7，目标序列位于PetT7载体的Xba I和EcoR I两限制性内切酶位点之间。
本发明的第五个方面是提供本发明第四个方面所述的表达载体在沉默EsMMP-14基因中的应用，其中所述EsMMP-14基因为下列核苷酸序列之一：
1)中华绒螯蟹EsMMP-14基因，序列表中SEQ ID NO.3所示序列；
2)与中华绒螯蟹EsMMP-14基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明的第六个方面是提供第四个方面所述的表达载体在制备中华绒螯蟹抗病试剂中的应用。
本发明的第七个方面是提供一种提高中华绒螯蟹抗病性的方法，该发明通过将本发明第一个方面提供的一种双链RNA或由所述双链RNA制备获得的抗病试剂注射入中华绒螯蟹的体内。
本发明提供的双链RNA以及含有该双链RNA的表达载体能有效沉默EsMMP-14基因，可用于提供中华绒螯蟹的抗病性，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值，例如具体实施方式中将收集得到的本发明双链RNA注射入中华绒螯蟹体内，能够有效抑制EsMMP-14的表达，降低感染苏云金芽孢杆菌的中华绒螯蟹体的死亡率，有效提高中华绒螯蟹体的抗病性，从而提高养殖产量和利润。
附图说明
图1：中华绒螯蟹dsEsMM-14双链RNA琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2：dsEsMMP-14对EsMMP-14的抑制效果及感染苏云金芽孢杆菌后死亡率的影响；
图3：注射dsEsMMP-14与苏云金芽孢杆菌后，河蟹肠道和肝胰腺HE染色切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案
本研究受到国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项“重要养殖虾蟹类种质创制与健康苗种繁育”项目“虾蟹类新种质创制技术平台”课题(2018YFD0901301)；天津市人才发展特殊支持计划高层次创新创业团队项目，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)，天津市高等学校创新团队建设(TD13-5076)支持。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所使用的生物材料中华绒螯蟹购买于盘锦，体长约3.3cm，体宽约3.5cm体重每只大约8.2-10.1g，健康有活力。河蟹购买回后养在实验室中。水曝气，温度约26-28℃。每日投喂一次新鲜玉米，每隔两日更换新鲜的曝气水。
步骤1，Trizol法提取总RNA
取1.5ml的无酶的EP管置于液氮中预冷，分别将5只河蟹的肝胰腺、肠道迅速放入预冷过的EP管中，按
Figure BDA0002281487740000041
Reagent(Thermo Fisher Scientific)试剂使用说明提取河蟹各组织总RNA，具体步骤如下：
(1)提前将研钵、剪刀和镊子置于烘箱中于180℃烘烤4h，用于防止RNA酶污染，将烘烤完的研钵在室温20～25℃冷却后倒入适量液氮再次降温，得到预冷的研钵，此时将冷冻的河蟹组织置于预冷的研钵中，用研磨棒快速将其研磨成粉末；
(2)将50mg粉末转入到已加入1mLTRIzol的无酶EP管中，用振荡器充分混匀后，在室温20～25℃静置10min，于4℃离心10min，离心的离心力为12000g；
(3)离心后取上层清液到一个新的1.5mL无酶EP管中，室温20～25℃静置5min后加入200μL氯仿，用振荡器震荡15s，室温20～25℃静置10min；
(4)将静置的液体于4℃离心15min，离心的离心力为12000g，在EP管中液体分为三层：上层无色含有RNA，中间层白色絮状含有DNA，下层粉红色含有蛋白质；
(5)吸取无色的上层溶液于新的EP管中，吸取时要尽量小心以防吸到DNA，吸取后再在吸取后的溶液中加入500μL异丙醇，用手上下颠倒混匀后，室温20～25℃静置10min，将其置于冰箱于-20℃放置1h(因RNA含量较少)。
将含有RNA的EP管从冰箱中取出，于4℃离心10min，离心力为12000g，倒掉上层清液，EP管中残留液体用枪吸尽，在枪吸出的液体中加入1mL已配置好的75﹪(体积浓度)乙醇水溶液，用枪将RNA反复吹打，洗去杂质；
(6)将步骤(5)所得液体在EP管于4℃离心5min，离心力为7500g，弃去上层清液，用枪吸取EP管中残留液体后置于滤纸上倒置空干5-10min，以使乙醇挥发完全。其中，空干时间一般为5-10min，时间过长会导致RNA降解；
(7)根据提取到的RNA量的多少加入30μL的无酶水溶解RNA，得到RNA无酶水溶液。若RNA没有完全溶解，可再用55℃的水浴5min促进其溶解；
(8)用超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)检测RNA无酶水溶液中RNA的浓度：取1μLRNA无酶水溶液用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，RNA无酶水溶液冻存于-80℃冰箱中备用。
步骤2，合成cDNA第一条链
参考反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time))使用说明书，反转录获得cDNA第一条链，具体步骤如下：
(1)合成cDNA第一条链
RNA无酶水成分：就是没有RNA酶的去离子水。
Figure BDA0002281487740000051
将RNA无酶水溶液吸打混匀后短离，于37℃孵育15min，80℃孵育5s，冰浴5min。冰浴的温度为0摄氏度。
步骤3，克隆EsMMP-14的ORF序列
(1)根据转录组的提示，设计用于扩增EsMMP-14 ORF区的特异性引物——EsMMP-14-F、EsMMP-14-R，见表1。
(2)以反转录获得的cDNA为模板，利用PCR仪扩增目的基因片段，反应体系如下：
Figure BDA0002281487740000061
在PCR小管中按照上述要求加入相应的试剂，反应体系是25μL。
PCR反应程序如下：
Figure BDA0002281487740000062
(3)连接：用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测后，扩大体系，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书，将目的片段切胶回收纯化，用超微量分光光度计检测切胶回收后的DNA浓度，将目的片段连接到pMDTM-18-T Vector上，于16℃下连接4h，得到连接产物pMD18-T-EsMMP-14，其中，连接体系如下：
Figure BDA0002281487740000063
(4)转化：采用热激法将上述连接产物pMD18-T-EsMMP-14转入DH5α感受态细胞中，每个连接物转入DH5α感受态细胞中的具体步骤如下：
①将DH5α菌株接种于6ml的LB培养基中并复摇至OD值为0.6，取1ml含有DH5α菌株的LB培养基于1.5ml的EP管中，于25℃，离心5min，离心转速为3000rpm。弃去上清液，向该EP管中加入100μl 0.1M的CaCl2水溶液，将离心下来的沉淀用CaCl2水溶液轻轻吹打混匀：将EP管置于冰上4h后，以使EP管内溶液的温度下降至0℃。
②将连接产物加入到DH5α感受态细胞中，轻轻吸打混匀后冰浴30min，得到混合物。
③将混合物在水浴锅中于42℃热激90s后迅速转移到冰上3min，以使混合物的温度降至0摄氏度。
④在混合物中加1mL LB液体培养基，于37℃和150r/min条件下培养45min。
⑤在3000rpm离心5min，离心后弃去900μl上层清液，剩下的菌液均匀后涂布于LB固体培养基上(培养基加有氨苄青霉素)，于37℃条件下静置培养12小时。
(5)挑单克隆：用灭过菌的牙签挑取多个转入有连接产物的DH5α菌的单菌落于50μl有氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃和220r/min的条件下培养3h，得到菌液，以菌液为模板进行PCR检测，阳性克隆菌液抽提出质粒送至金唯智生物科技有限公司完成测序。
表1用于扩增EsMMP-14 ORF区的特异性引物
Figure BDA0002281487740000071
步骤4，序列的生物信息学分析
用DNAStar(version7.1)软件分析EsMMP-14基因序列和氨基酸序列，利用蛋白组学在线网址ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性质，用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白结构域，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)检测蛋白是否有信号肽。
步骤5，构建dsMMP-14双链RNA表达载体
(1)根据克隆得到的结果，设计扩增用于构建RNA模板片段的引物，dsEsMMP-14-F，dsEsMMP-14-R，见表1，其中，在特异性引物上游引物的5’端加入了Xba I酶切位点，在两对特异性引物上游引物的下游引物的3’端加入了EcoR I酶切位点。
(2)以步骤3中(5)挑单克隆提取的质粒为模板，用PCR扩增目的基因片段，反应体系如下：
Figure BDA0002281487740000081
在PCR小管中按照上述要求加入相应的试剂，反应体系是25μL。
PCR反应程序如下dsEsMMP-14片段引物的退火温度为61℃：
Figure BDA0002281487740000082
(3)参照质粒提取试剂盒说明书，提取PetT7质粒(质粒保存在DH5α菌中)。
(4)双酶切：PCR产物电泳检测后，扩大PCR体系，将目的片段切胶回收纯化并测定回收后的DNA浓度。用限制性内切酶Xba I和EcoR I酶切dsEsMMP-14的目的基因片段以及PetT7质粒。
酶切体系如下：
Figure BDA0002281487740000083
Figure BDA0002281487740000091
酶切完成后，分别回收纯化目的片段以及载体的大片段。测其浓度后电泳检测目的基因和质粒片段的回收质量。
(5)连接：用T4 DNA连接酶连接酶切好的目的片段及载体，反应条件为16℃，得到连接产物PetT7-dsEsMMP-14。连接体系如下：
试剂 体积(μL)
dsEsMMP-14目的基因片段 6
PetT7质粒片段 1
T4 DNA连接酶 0.5
10×T4 Buffer 1
SDW 1.5
步骤6，表达dsMMP-14双链RNA
(1)制备HT115感受态细胞，提取表达质粒PetT7-dsEsMMP-14，采用热激法将表达质粒PetT7-dsEsMMP-14转入HT115感受态中，具体步骤同步骤3中的(4)转化。
将含有转化产物的菌体涂布在含有氨苄青霉素和盐酸四环素的LB固体培养基上，于37℃条件下培养12小时，同样用PCR检测进行挑克隆检测。
(2)将检测正确的成功导入，将含有PetT7-dsEsMMP-14质粒的HT115表达菌分别接种于6ml的LB培养基中，并复摇到600ml的LB培养基中大量培养，培养条件为37℃，220rpm。测得OD值为0.6时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，在37℃下进行诱导(终浓度为1mM)，6h后于4℃离心10min，离心速度为4420rcf，收集菌体。
(3)抽提RNA，向(2)中收集到的菌体中加入2ml Trizol，用枪反复吹打裂解菌体。加入Trizol后的步骤与步骤1中操作一致
(4)变性：将(3)中溶解得到的RNA于80℃温浴10min。
(5)复性：将(4)中变性的RNA置于水浴锅中，关闭水浴锅电源，静置12h使其自然冷却至室温。
琼脂糖凝胶电泳检测所得到的dsEsMMP-14双链RNA。
制备dsGFP双链RNA步骤与制备dsEsMMP-14双链RNA一致。
步骤7，干扰EsMMP-14，降低EsMMP-14表达量
(1)将步骤5中得到的dsEsMMP-14以1X PBS稀释至1μg/μL；
(2)每只河蟹自最后一对步足基部注射10μL dsEsMMP-14，即每只河蟹最终注射10μg双链RNA，这一组河蟹命名为ds组；
(3)每只河蟹自最后一对步足基部注射10μL dsGFP，即每只河蟹最终注射10μg双链RNA，这一组河蟹命名为Control组。
步骤8，检测dsEsMMP-14对EsMMP-14的干涉效率
选取ds组河蟹和Control组河蟹做材料，将河蟹分为两组，检测dsEsMMP-14的干涉效率。在注射dsEsMMP-14后2d，4d，6d分别取河蟹的肠道与肝胰腺检测dsEsMMP-14的干涉效率。以注射dsGFP组的河蟹作为参照。抽提总RNA与反转录合成第一链cDNA方法与步骤1、2一致。
采用定量PCR检测干涉效率
(1)根据转录组提示，设计RTMMP-F，RTMMP-R和RTGFP-F，RTGFP-R，用于定量PCR，见表2；
(2)不同组织的cDNA用Nanodrop 2000检测浓度后，用无酶水将浓度都稀释为100ng/μL。使用实时荧光定量PCR仪Roche Cycler 480(Roche)，以RTMMP-F和RTMMP-R的cDNA为模板，检测EsMMP-14在不同组织中的相对表达量，以中华绒螯蟹核糖体RNA 18s为内参基因，根据
Figure BDA0002281487740000101
法进行计算各组织表达量，分析干涉效率。反应按照
Figure BDA0002281487740000102
qPCR
Figure BDA0002281487740000103
Green Master Mix(High ROX Premixed)说明书进行，反应体系为25μL：
Figure BDA0002281487740000104
反应程序为：
Figure BDA0002281487740000105
Figure BDA0002281487740000111
(3)用SPSS17.0软件分析不同组织中EsMMP-14的相对表达量是否有显著性差异，最后用Origin 8.0作图。
表2本发明所用到的引物序列
Figure BDA0002281487740000112
步骤9，干涉EsMMP-14对感染苏云金芽孢杆菌的河蟹累计死亡率和组织形态影响
(1)将苏云金芽孢杆菌培养于6mL液体LB培养基中，培养条件为37℃，220rpm。培养至菌液浓度为3.8x108CFU/mL，取1mL菌液于3000g，25℃离心10min，收集菌体，将菌体重悬于PBS中，每只河蟹注射20μL重悬菌液。60只河蟹随机分为三组，实验组注射10μg dsEsMMP-1424h后，注射苏云金芽孢杆菌。对照组注射dsGFP 24h后，注射等量苏云金芽孢杆菌，空白组注射10μL PBS。统计6天内的累计死亡率。
(2)干涉组河蟹在最后一对步足基部注射10μg dsEsMMP-14，干涉24h后注射20μL浓度为3.8x108CFU/mL苏云金芽孢杆菌，对照组注射dsGFP干涉24h后注射等量苏云金芽孢杆菌，空白组注射10μg dsGFP 24h后再注射20μL PBS。在注射细菌48h后，将河蟹肠道和肝胰腺固定于4％多聚甲醛(BBI，Shanghai，China)中，于4℃固定24h。石蜡切片及HE染色由武汉塞维尔生物科技有限公司完成。
实验结果
1 中华绒螯蟹MMP-14双链RNA表达结果
将溶解在无酶水中的双链RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果发现在250bp附近有一条电泳条带，其大小与预期大小一致，说明获得了dsEsMMP-14双链RNA(图1)。图2中，1为标准DNA Marker，从上至下大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。2为所制备的dsEsMMP-14双链RNA。
2 dsEsMMP-14对EsMMP-14表达量的抑制效果感染及苏云金芽孢杆菌后死亡率的影响
向河蟹体内注射10μg dsMMP-14，分别在2天、4天、6天时检测干涉效率。图2(A)为注射dsMMP-14后取河蟹肠道检测干涉效率。在注射双链RNA后，在96h(4d)以内均可抑制EsMMP-14的表达，达到极显著水平(P<0.01)，而在144h(6d)时EsMMP-14相对表达量虽低于对照组，但已没有显著差异(P>0.05)，因此可以确定对肠道的干涉实验需在注射dsMMP-14后96h(4d)内进行。图2(B)为注射dsMMP-14后，检测河蟹肌肉的干涉效率。与肠道相同，在注射dsRNA后的96h(4d)内，Es-MMP-14的表达量被抑制，达极显著水平(P<0.01)，在144h(6d)时EsMMP-14的表达量相较于对照组已无显著性差异(P>0.05)。因此，可以确定，dsMMP-14干涉实验，需在注射双链后96h内进行。
在dsEsMMP-14干涉效率达到最大后，向河蟹体内注射苏云金芽孢杆菌，计算6天内累计死亡率图2(C)。每组共20只河蟹，对照组在注射PBS 4天后死亡两只，6天内共死亡两只。干涉组在注射2天后死亡一只，注射5天后死亡一只，6天内共死亡三只。dsGFP组在注射细菌后24h死亡四只，3天后累计死亡八只，第5天时又死亡一只，6天内累计死亡九只，累计死亡率为0.45，相比于对照组的0.1及干涉组的0.15有显著差异(P<0.05)，而dsMMP-14组与对照组的累计死亡率并无显著性差异(P>0.05)。
3 降低EsMMP-14表达量后，河蟹在感染细菌时肝胰腺及肠道形态的变化
如图3(A)所示，在干涉EsMMP-14后注射苏云金芽孢杆菌，其肝胰腺的肝管腺与对照组差异不大，能够维持组织形态，而注射了dsGFP+苏云金芽孢杆菌的河蟹，其肝胰腺的肝管腺出现了明显的变形与破损，肝胰腺组织形态严重受损，与注射dsMMP-14+苏云金芽孢杆菌的河蟹相比差异显著。从图3(B)中可以看出，相较于对照组，注射了dsGFP+苏云金芽孢杆菌的河蟹肠道，外肌层变薄，且柱状上皮细胞出现了明显的破损、溶解现象。而注射了dsMMP-14+苏云金芽孢杆菌的河蟹，其肠道外肌层更厚，肠道屏障基本完整，且细胞密度相比于dsGFP+苏云金芽孢杆菌组更大，说明在感染细菌的情况下，EsMMP-14参与了细胞及组织屏障的溶解。
讨论
根据切片结果可以看出EsMMP-14确实参与到了免疫过程，引起组织溶解。在肝胰腺内，干涉EsMMP-14能够维持肝胰腺组织形态，而注射dsGFP+苏云金芽孢杆菌的河蟹，肝胰腺出现了严重损伤，组织形态遭到严重破坏。肠道是甲壳动物最主要的消化器官之一，对营养物质的正常吸收，是维持动物健康的物质基础，因此完整的肠道屏障，对维持动物免疫系统正常运转有着至关重要的作用。本实验中，干涉dsMMP-14后可以维持在感染细菌时肠道外肌层形态，保护肠道屏障，维持动物对营养物质的吸收，确保其有充足的物质基础和能量基础合成免疫物质抵抗病原侵袭。注射dsGFP+苏云金芽孢杆菌的河蟹其肠道外肌层与对照组相比外肌层更薄，肠道屏障受到严重损伤，可以证明干涉EsMMP-14后可以维持肠道屏障结构，减弱外界病源对肠道的侵袭力，维持河蟹先天免疫系统正常工作。此外，注射dsMMP-14+苏云金芽孢杆菌后的河蟹肠道的肌层比对照组更厚，可能是由于降低EsMMP-14表达量后，其对外肌层的溶解作用减弱，因而使肠道外肌层生成速度大于溶解速度，而更致密的屏障结构更有利于阻挡病原侵袭，进而提高河蟹在病原侵染时的存活率。但外肌层增厚的具体机制仍有待于进一步实验进行研究。可以肯定的是，干涉EsMMP-14后，可以在一定程度上保护河蟹各免疫器官组织屏障完整，使它们能够充分发挥免疫作用，提高河蟹在疾病过程中的存活率。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种提高中华绒螯蟹抗病性的双链RNA及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 239
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
cucuagaugu ucaacccuca guccggcgcu cugcucuccc aagacaagcu gagagaaagc 60
aucauggagu uccaggcguu cgcuggacuu gaucagacgg gugaacucga caacucgacu 120
cuggagauga ugaacacccc gcguuguggc gucaaggaca aggucggcuu cggcaccaga 180
gccaggagga agcgcuaugc ccugcaagga ucaaggugga gggugaagac ucgaauucg 239
<210> 2
<211> 239
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgaauucgag ucuucacccu ccaccuugau ccuugcaggg cauagcgcuu ccuccuggcu 60
cuggugccga agccgaccuu guccuugacg ccacaacgcg ggguguucau caucuccaga 120
gucgaguugu cgaguucacc cgucugauca aguccagcga acgccuggaa cuccaugaug 180
cuuucucuca gcuugucuug ggagagcaga gcgccggacu gaggguugaa caucuagag 239
<210> 3
<211> 239
<212> DNA
<213> Eriocheir sinensis
<400> 3
ctctagatgt tcaaccctca gtccggcgct ctgctctccc aagacaagct gagagaaagc 60
atcatggagt tccaggcgtt cgctggactt gatcagacgg gtgaactcga caactcgact 120
ctggagatga tgaacacccc gcgttgtggc gtcaaggaca aggtcggctt cggcaccaga 180
gccaggagga agcgctatgc cctgcaagga tcaaggtgga gggtgaagac tcgaattcg 239

Claims (5)

1.一种双链RNA，其特征在于，由正义链和反义链组成，正义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示序列。
2.权利要求1所述的双链RNA在制备感染苏云金芽孢杆菌的中华绒螯蟹的抗病试剂中的应用。
3.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的双链RNA。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体为Pet32，目标序列位于Pet32载体的XbaI和EcoRI两限制性内切酶位点之间。
5.权利要求3或4所述的表达载体在制备感染苏云金芽孢杆菌的中华绒螯蟹的抗病试剂中的应用。
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