CN103275203A - 中华绒螯蟹高血糖激素的基因工程制备和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中华绒螯蟹高血糖激素基因（Ers -CHH）的基因工程制备和质谱鉴定方法。高血糖激素通过调控甲壳动物的血糖水平而维持着各个组织与器官的能量供应，对这一家族神经多肽激素的研究有助于揭示甲壳动物代谢生长和繁殖调控机制。我们在前期研究中克隆得到一个中华绒螯蟹高血糖激素基因（Ers -CHH,GenBank注册号：JX485664）。本发明利用基因工程的方法成功获得了重组蟹高血糖激素，其分子量约为9.4kD，纯化复性后得率为0.4g/L培养基，质谱鉴定结果验证了重组蛋白的正确性。由于甲壳动物体内的高血糖激素含量非常低，对其进行直接的纯化富集几乎是不可能的，本专利中利用基因工程的方法快速大量获得这类稀有的激素类蛋白，为后续开展其功能调节机制研究以及应用于养殖生产实践奠定了基础。

Description

中华绒螯蟹高血糖激素的基因工程制备和鉴定方法

本发明得到国家973计划项目（2012CB114405）、国家863计划项目（2012AA092205和2012AA10A401）、国家科技支撑计划项目（2011BAD13B04和2011BAD13B07）、天津市自然科学基金项目（10JCYBJC09200）和天津师范大学博士基金项目（52LX18和52LX19）的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种中华绒螯蟹高血糖激素基因（Ers-CHH）的基因工程制备和鉴定方法。

背景技术

中华绒螯蟹俗称河蟹、大闸蟹，是我国具有高经济价值的甲壳动物之一，其味道鲜美、营养丰富，含有丰富的蛋白质、维生素A、核黄素、烟酸等，其营养价值超过一般鱼类，因此经济价值与日俱增。

河蟹眼柄X器官-窦腺复合体（X-Organ-Sinus Gland complex, XO-SG）类似于哺乳动物的下丘脑-垂体系统，是甲壳动物的重要神经内分泌器官，其中窦腺是储存和排出激素的场所，X器官由神经内分泌细胞组成，是各类激素的分泌场所。眼柄X器官-窦腺复合体合成和分泌包括高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone, CHH）、蜕皮抑制激素（molt-inhibiting hormone, MIH）、性腺抑制激素（gonad-inhibiting hormone, GIH）和大颚器抑制激素（mandibular organ-inhibiting hormone, MOIH）在内的多种神经多肽激素，分别调控甲壳动物的能量代谢、蜕皮和性腺发育等重要生理活动。但是这些激素仅在大约200个细胞内合成，所以量很微少，每个细胞的储存量只有几个pg。由于这些神经多肽激素的氨基酸序列具有较高的相似性，被称为CHH家族神经多肽激素。迄今，CHH家族神经多肽激素仅在甲壳动物中被发现。

目前对中华绒螯蟹高血糖激素的研究仅见部分报道，周开亚等克隆到中华绒螯蟹高血糖激素基因的部分序列；康现江等以中华绒螯蟹眼柄视神经节为材料，通过蛋白液相色谱仪分离了具有提高血糖浓度的物质，进行的河蟹体内实验显示为高血糖素或含有高血糖素，对其部分生化性质进行分析后确定它是具有提高血糖作用和酸性等电点的热稳定物。本实验前期采用反相高效液相色谱技术（RP-HPLC）首次在中华绒螯蟹眼柄中分离纯化了眼柄神经多肽激素，获得了高血糖激素纯品，并验证其具有升高血糖的功能，并通过利用氮端氨基酸测序的方法设计了序列特异性引物，进而克隆了中华绒螯蟹高血糖激素基因的全长序列，并提交到了GenBank（GenBank注册号：JX485664），为后续该基因的功能验证和将其应用于养殖生产实践奠定了基础。

发明内容

本专利在现有技术研究的基础上，将目的基因（Ers-CHH）构建到表达载体后转化宿主菌，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性，最后通过质谱分析对表达产物进行鉴定。获得的重组目的蛋白为研究河蟹高血糖激素的生物学功能和调控机制奠定了基础，也为揭示甲壳动物代谢生长和繁殖的分子基础和高效健康养殖提供了借鉴。

因此，本发明的一个目的是提供一种重组河蟹高血糖激素，其特征在于该重组的河蟹高血糖激素的蛋白分子量约为9.4kD，纯化复性后得率为0.4g/L培养基。

本发明的另一个目的是提供一种重组河蟹高血糖激素的基因工程制备方法，其特征在于它是将河蟹高血糖激素基因（Ers-CHH, 我们前期已克隆并提交到了GenBank，GenBank注册号为JX485664）与表达载体连接，完成目的表达载体（pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Ers-CHH）的构建，并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性。

本发明采用含有测序正确质粒的菌体，进行重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析，诱导后发现在9.4kD附近出现了特异性条带，该蛋白的表达量随着诱导时间的延长而显著增加，5小时后表达量达到平台期，通过凝胶成像系统分析发现，目的蛋白谱带的表达量占宿主菌总蛋白含量的33%左右。

本发明对重组目的蛋白进行分离纯化及复性分析，电泳检测显示在9.4KD附近位置有单一条带，这与rErs-CHH的预期分子量相一致，纯化的目的蛋白复性后得率约为0.4g/L培养基。

本发明同时提供了重组河蟹高血糖激素的鉴定方法，将目的蛋白条带进行切胶、胶内酶解和离子阱质谱分析与鉴定，质谱鉴定结果显示重组目的蛋白中有2条肽段与数据库中收录的河蟹CHH（gi|76443802）推导的氨基酸序列完全匹配。由此可以判定，上述蛋白条带即为重组表达的目的蛋白rErs-CHH，河蟹高血糖激素成功地获得了体外重组表达。

本发明进一步公开了用于河蟹高血糖激素基因原核重组表达的特异性引物：

Es-CHHFM1: 5’-CATATGCAGGCCTACGACCGC-3’；

Es-CHHRM1:5’-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCAACCACCCGGA-3’

本发明也公开了河蟹高血糖激素在提高河蟹血淋巴中血糖水平、调控其代谢生长方面的应用。

本发明更加详细的制备方法如下：

一种河蟹高血糖激素基因（Ers-CHH）的基因工程制备和质谱鉴定方法，其特征是包括如下主要步骤：

(1) Ers-CHH原核表达载体的构建：

将测序正确的目的基因成熟肽区域与表达载体质粒pCR®T7/NT TOPO®TA进行连接，构建重组表达质粒pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Ers-CHH，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞后测序。

(2) 重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析：

利用诱导剂IPTG对含有重组表达质粒的菌体进行不同时间的诱导表达，收集样品进行电泳检测，以确定蛋白的最佳诱导时间。

(3) 重组蛋白的分离纯化及复性：

利用固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术对目的蛋白进行分离纯化，利用梯度尿素透析法进行蛋白的复性处理。

(4) 目的蛋白的质谱鉴定：

将目的蛋白进行切胶、酶解和离子阱质谱分析鉴定，发现其有两个个肽段与数据库中收录的河蟹CHH（gi|76443802）推导的氨基酸序列完全匹配，证明河蟹高血糖激素成功地获得了体外重组表达。

本发明的有益效果是：

（1）本发明首次对河蟹高血糖激素基因进行了体外原核重组表达和质谱鉴定，可以高效、大量的在体外获得河蟹高血糖激素。

（2）获得的重组目的蛋白为研究河蟹高血糖激素的生物学功能和调控机制奠定了基础，也为揭示甲壳动物代谢、生长、繁殖的分子基础和高效健康养殖提供了借鉴。

（3）根据我们已有的对该重组目的蛋白的活性和功能研究的结果，可以在河蟹生长发育的关键时期采用注射法或者与饵料共同投喂的方法使重组的rErs-CHH作用到河蟹体内，调控其代谢活动，有利于河蟹快速获得能量维持其生长发育活动的正常进行，从而实现快速生长。

附图说明：

图1为Ers-CHH成熟肽PCR扩增产物。M：标准分子量；1：Ex Taq酶克隆结果；2：La Taq酶克隆结果；

图2为不同诱导时间对重组河蟹高血糖激素（rEs-CHH）表达量的影响；

图3为重组蛋白 rEs-CHH 的纯化结果。M：蛋白质分子量标记；泳道1：纯化目的蛋白；

图4为重组蛋白rEs-CHH中与中华绒螯蟹相匹配的两个肽段A和B的二级质谱图；上图和下图分别为两个肽段-LEHVCDDCFNLYR-和-ENCYSNLVFR-的匹配分析结果；

图5为注射PBS、眼柄粗提物、重组CHH后中华绒螯蟹血淋巴中血糖浓度的变化。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。

实施例 1 ：河蟹高血糖激素基因原核表达载体的构建

克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，表达载体pCR®T7/NT TOPO®TA购自Invitrogen公司，大肠杆菌TOP-10F’和表达宿主菌BL21(DE3)plysS感受态细胞购均自北京市天根生化科技有限公司。DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、内切酶BamH

、内切酶Bst B

、dNTP、DNA marker DL2000均购自TaKaRa公司，Plasmid Mini Kit、Agarose gel DNA extraction Kit、LB培养基均购自上海生物工程有限公司；其它试剂为国产或进口的分析纯产品。实验所用引物为Es-CHHFM1 ( 5’-CATATGCAGGCCTACGACCGC-3’)和Es-CHHRM1 (5’-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCAACCACCCGGA-3’)，由上海生工合成。

（1）PCR扩增及产物的纯化：

根据河蟹高血糖激素基因的成熟肽编码区cDNA序列（GenBank注册号：JX485664）和pCR®T7/NT TOPO®TA质粒上存在的多克隆位点（MCS）设计原核表达所需的引物，上游引物Es-CHHFM1 (5’-CATATGCAGGCCTACGACCGC-3’)5’端含Nde I酶切位点，下游引物Es-CHHRM1(5’-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCAACCACCCGGA-3’)5’端含Hind III酶切位点、终止密码子和6个组氨酸的密码子。以河蟹眼柄mRNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性4 min，1个循环；94℃变性1min，58℃退火50sec，72℃延伸50sec；35个循环；72℃延伸10 min，1个循环；4℃保温。

PCR反应体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

反应组分	体积（μL）
		灭菌超纯水	17.25
10×buffer（Mg2+）	2.5
		dNTP（10 mM）	2
Es-CHHFM1	1
		Es-CHHRM1	1
cDNA	1
		Taq DNA聚合酶（5 U/μl）	0.25

本实验利用PCR扩增的方法在Es-CHH成熟肽的两端加上酶切位点，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶（含EB）上进行电泳，获得的PCR产物大小为252bp，凝胶成像系统观察照相，见图1。切下预期大小处特异性的目的条带，用Agarose gel DNA extraction Kit（上海生工）回收DNA，方法按试剂盒的说明手册进行，最后DNA溶解于适量超纯水中，-20℃保存备用。

（2）PCR产物连接到T-载体（TaKaRa公司）：总体系5μL，16℃连接过夜。连接体系如表2所示：

表2 连接反应体系

反应组分	体积（μl）
		回收的目的DNA	2.1
SolutionⅠ	2.5
		pMD18-T vector	0.4

（3）CaCl₂法制备感受态细胞：

将实验室保存的E.coli（TOP10）菌株复苏后取70μl接种至3ml LB液体培养基中，37℃ 180rpm振荡培养；培养至OD600约为0.6-0.8时转至冰预冷的1.5ml离心管中，在冰上放置10min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；弃上清，将管倒置1min，使培养基流尽；离心管中加入100μl冰预冷的0.1MCaCl₂重悬细胞备用；

（4）目的基因转化大肠杆菌TOP-10F’：

取100μl感受态细胞，加10μl连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰上放置2min；加500μl LB培养基，37℃ 200rpm振荡培养1h；室温4000rpm离心5min，吸出部分上清，用剩余培养基悬浮细胞；将菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板；将平板在37℃正向放置1h吸收多余液体，倒置培养过夜。

（5）单克隆培养和检测：

从长出白色单菌落的平板上面随机挑取5个单菌落分别接种到500μl含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养5-6小时。取1μl培养基作为模板，以Es-CHHFM1和Es-CHHRM1为引物进行PCR检测，PCR条件同前。将阳性克隆接种到3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜、保种、取菌液送华大基因生物公司进行测序。

（6）质粒提取和酶切反应：

用质粒提取试剂盒，抽提测序正确的含有目的片段的pMD18-T-Ers-CHH质粒，步骤参照说明书。在37℃以Nde

和Hind III分别对pCR®T7/NT TOPO®TA和pMDl8-T-Ers-CHH质粒进行双酶切，酶切过夜。反应体系如表3所示：

表3 酶切反应体系

反应组分	体积（μL）
		10×K Buffer	5
BamH	2
		Bst B	2
pCR®T7/NT topO®TA或pMDl8-T-Ers-CHH	25
		ddH2O	16

（7）连接和转化：将上述两种酶切后的基因片段用T₄DNA连接酶进行连接，16℃恒温水浴过夜，反应体系如表4所示：

表4 连接反应体系

试剂	体积（μl）
		Ers-CHH基因片段	20
pCR®T7/NT topO®TA	2
		10×Ligation Buffer	2.5
T4 DNA Ligase	1

连接完成后转化BL21(DE3)plysS感受态细胞（方法同前）；随机挑取5个单克隆接种于500 ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃ 180rpm振荡6-8小时，取菌液进行PCR检测，将检测正确的克隆送公司测序，测序正确后-20℃保种待用。

实施例 2 ：重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析

所需主要试剂：异丙醇、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、甘氨酸、SDS、TEMED、丙稀酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝、DTT、甘油、Tris等试剂均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白marker购自Fermentas公司；其它试剂均为国产或进口的分析纯级别。

所需主要仪器：蛋白质电泳槽、脱色摇床（北京六一仪器）、低温离心机（Ependdorf）等。

取实施例1中保存的含有表达载体的菌液接种于20ml含有氨苄青霉素（含100μg/mL氨苄青霉素）的新鲜LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.6-0.8。取1ml未加IPTG诱导的培养液至1.5ml离心管中作为空白组，其余的菌液用终浓度为1mM的IPTG进行诱导，在37℃摇床中180rpm继续培养，在培养1h、2h、3h、4h和5h分别取样（1ml/次），将所有收集到的样品在4℃，10000rpm条件下离心5min，收集沉淀，在每个样品中各加100μl上样缓冲液（1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，1%溴酚蓝，0.154g DTT，10% SDS，10%甘油）处理。当所用时间点的样品都收集后，沸水浴10min使菌体细胞裂解，释放蛋白。利用SDS-PAGE法检测蛋白产物，凝胶配制方法如表5和表6所示：

表5 18% 分离胶（10ml）制备组分

试剂	体积（ml）
		ddH2O	1.3
30% Acrylamide	6.0
		1.5M Tris-HCl（pH=8.8）	2.5
10%SDS	0.1
		10%过硫酸铵	0.1
TEMED	0.004

表6 5% 浓缩胶（5ml）制备组分

试剂	体积（ml）
		ddH2O	3.44ml
30% Acrylamide	0.83ml
		1.0M Tris-HCl（pH=6.8）	0.63ml
10%SDS	0.05ml
		10%过硫酸铵	0.05ml
TEMED	0.005ml

按照上面的SDS-PAGE凝胶配方，依次灌注分离胶和浓缩胶，注意保证两层胶完全凝固。将上述菌体裂解液低速离心，每一时间点取悬液10μl加样于SDS-PAGE上，其中没有诱导的样品作为0h的对照组。浓缩胶电压90V，分离胶电压120V，电泳完成后用考马斯亮蓝染液染色约2h，用1.8%KCl溶液脱色过夜至凝胶背景清晰透明，观察结果并扫描凝胶，以确定蛋白的最佳诱导时间，以此最佳诱导时间进行目的蛋白的大量表达。

经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，结果如图2所示：在预期分子量稍大于9.4KD附近的位置出现了特异条带，该蛋白的表达量与诱导时间显著相关，随着诱导时间的延长而显著增加，5h后表达量达到平台期，继续培养，目的蛋白表达量相对稳定。由于重组目的蛋白带有一个组氨酸标签（-MRGSHHHHHHGM-），故分子量略大于其预测理论值，所以推断该谱带处的蛋白可能为重组目的蛋白。通过Quantity One 4.4.0（Bio-Rad）分析诱导表达5h后的SDS-PAGE图像，结果表明重组蛋白的表达量占到了宿主菌总蛋白含量的33%左右。

实施例 3 ：重组蛋白的分离纯化及复性

（1）破碎菌体：

将实施例1中保存的菌体发酵至OD600 nm为0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导培养5 h后，取300ml菌液4 ℃条件下10000 rpm离心10 min收集菌体。按1g湿菌/l0ml破碎缓冲液（1% TritonX-100, 2 mM EDTA）的比例重悬菌体，冰浴条件下超声破碎（工作条件：功率400 W，工作5s，间歇5 s，共15min，反复3次），待破碎完成后4 ℃，10000 r/min离心10min收集包涵体。

（2）包涵体的洗涤：

取超声破碎后收集的菌体沉淀，加入30ml的包涵体洗涤缓冲液（300mM KCL, 50mM KH₂PO4, 5mM Iminazole, 1M Urea, pH 7.4）洗涤3次，收集沉淀，取50μl上清留做电泳对照样品。上述洗涤获得的包涵体溶于包涵体裂解液（300mM KCL，50mM KH₂PO4，5mM Iminazole，8M Urea，pH 7.4），置于振荡器上振荡20 min，4℃，10000 rpm离心10 min， 取上清。以5h为诱导时间大量发酵菌体，对超声破碎处理及洗涤过程中离心后收集的沉淀和上清进行电泳检测，发现重组蛋白大部分以不溶的包涵体形式存在于破碎后的沉淀中。

（3）目的蛋白的纯化：

采用亲和层析的方法，用Bio-Scale Mini profanity IMAC镍柱将上清溶液应用快速蛋白液相系统（BioLogic DuoFlow, Bio-Rad），通过固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术进行目的蛋白的分离纯化，具体操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手册进行，所有进入系统的液体都要过0.22μm的微孔滤膜。最后用SDS-PAGE进行检测。包涵体洗涤多次后用高浓度的尿素溶解，利用Ni-IDA技术对目的蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳检测如图3。

（4）目的蛋白的复性：

本研究采用透析复性的方法，通过逐步降低透析液中尿素的浓度，使蛋白在稳定的环境中能够正确折叠，最终恢复蛋白的生物学活性。纯化后的重组蛋白置于处理好的透析袋中，依次放入含有8 mol/L、6mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0 mol/L尿素的Tris-HCl缓冲液中（50 mmol/L，pH7.4），并在透析液中加入少量的半胱氨酸做还原剂以助于蛋白的折叠，每一浓度梯度均在4℃磁力搅拌器搅拌透析约4h，将复性后的蛋白脱盐后冻干称重，保存于-80 ℃。利用抽真空冻干后对得到的粉末称重，计算重组目的蛋白的得率约为0.4g/L。

实施例 4 ：目的蛋白的质谱鉴定

将SDS-PAGE胶上的目的条带切下，用超纯水反复冲洗3遍后，利用胰蛋白酶进行胶内酶解，取25µl酶解后的样品进行离子阱质谱分析（LCQ DECA XPplusMS, ThermoFirmigan, USA），利用Bioworks软件与SEQUEST数据库进行比对。质谱鉴定结果如图4所示，重组河蟹高血糖激素中有2条肽段（-LEHVCDDCFNLYR-和-ENCYSNLVFR-）与数据库中收录的河蟹CHH（gi|76443802）推导的氨基酸序列完全匹配。由此可以判定，上述蛋白条带即为重组表达的目的蛋白rErs-CHH，河蟹高血糖激素成功地获得了体外重组表达。

实施例 5 ：

重组河蟹高血糖激素在提高河蟹血淋巴中血糖水平、调控其代谢生长方面的应用。

实验动物：中华绒螯蟹由天津宁河七里海河蟹养殖场提供的一龄幼蟹，平均体重为10.851g，室温暂养与实验室养殖箱内，每天傍晚喂养剪成丁状的鲫鱼肉，次日清晨换新鲜河水。

实验试剂：PBS缓冲液（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）、考马斯亮蓝G-250（上海生工）、牛血清蛋白（上海生工）、葡萄糖测定试剂盒（南京建成）、冻干的重组河蟹高血糖激素（rErs-CHH）蛋白粉末、眼柄粗提物本实验室制备并储存（详细制备方法已发表：王雪惠等. 中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及活性鉴定. 水产学报. 2006. 30(2): 151-155）。

主要仪器及耗材：酶标仪（Bio-Rad）、冷冻离心机（eppendorf）、移液器（eppendorf）、1.5mL离心管（Axygen）、微量进样器（上海生工）、注射器（北京普博欣）、高压灭菌锅（TsaoHisn）等。

1：重组河蟹高血糖激素的处理：

（1）溶解蛋白：取一管冻干后的蛋白干粉，先加200μL PBS缓冲液，用移液器吹打，使蛋白溶解，然后4℃，10000rpm，离心5min，取出上清至一新的1.5mL离心管中，剩下的沉淀再加100μL PBS，用移液器吹打，使蛋白溶解，然后4℃，10000rpm，离心5min，取出上清至一新的1.5mL离心管，再重复一次，三管蛋白溶液要一直放在冰上，并做好标记，准备测定蛋白浓度。

（2）做蛋白标准曲线：用1.5mL离心管配制各浓度的标准蛋白溶液，每一离心管体系如表7所示（试剂加入的顺序如表中所示，体积单位为uL），试剂加好后反应5min，用移液器吸取200μL入酶标板中，每一浓度有4个平行，酶标仪测其吸光度，处理数据求平均值，做标准曲线，得出公式和相关系数R2（一般R2>0.99可用）。

表7 蛋白标准曲线绘制体系

试剂/蛋白含量（μg）	0	2.5	5	7.5	10	12.5	15	17.5	20
										PBS	100	95	90	85	80	75	70	65	60
蛋白标准液（0.5mg/ml）	0	5	10	15	20	25	30	35	40
										考马斯亮蓝G-250	900	900	900	900	900	900	900	900	900

（3）测定重组河蟹高血糖激素浓度：方法同做标准曲线的方法，测出OD值后带入公式，求出蛋白含量（取得蛋白体积里的所有蛋白单位μg）。

2：重组河蟹高血糖激素（rErs-CHH）提高河蟹血淋巴中血糖浓度的验证：

(1)实验动物处理：随机称20只螃蟹体重，求平均值。然后取75只剪掉眼柄后用烧红的镊子烫，并饥饿处理两天。

(2)实验材料分组：本实验分为实验组，阳性对照，阴性对照。每组有4个平行，每个平行5只螃蟹，每一个平行组暂养到一个水盆中。

(3)注射前处理：对实验组、阳性对照组，阴性对照组在实验前先抽血，用注射器从河蟹步足基部的血窦抽取血淋巴，并按照1:1的比例加入抗凝剂，每个平行5只螃蟹各抽取40μL血淋巴，然后混合在一起。

(4)注射：用微量进样器进行注射，注射位点在螃蟹第五步足基部。阴性对照每只螃蟹注射35μL PBS（10mM），共20只；阳性对照每只注射35μL眼柄粗提物，事先测好蛋白浓度然后稀释至蛋白浓度为50ng/μL，共20只；实验组每只注射35μl重组的河蟹高血糖激素（见实施例3），取事先测好浓度的蛋白稀释至50ng/μL，共20只。

(5)取样：注射后分0.5h，1h，2h，4h，6h抽血，用注射器从从步足基部的血窦抽取血淋巴，并按照1:1的比例加入抗凝剂每只抽40μl血，每个平行的5只螃蟹的血混在1.5mL离心管中，4℃，800g，离心10min，转移上清至另一个1.5mL离心管中，准备测定葡萄糖含量。

(6)血糖浓度的测定（使用葡萄糖测定试剂盒）：

①试配制剂工作液配制：将试剂盒中的R1试剂和R2试剂等量混合均匀。

②试验条件：温度37℃，波长505nm，反应时间900s，样品用量10μL，工作液用量1000μL，测定方法为终点法。

③校准及质量控制程序如表8所示：

表8 校准及质量控制体系

试剂	空白管	校准管	质控管	样本管
					工作液（μl）	1000	1000	1000	1000
蒸馏水（μl）	10
					校准品（μl）		10
质控品（μl）			10
					样本（μl）				10

充分混匀，置于37℃水浴15分钟。显色后，颜色至少可以稳定2小时。在波长505nm处，以空白调零，读取校准管和样本管的吸光度值（A）。

④试验结果的计算方法：

葡萄糖（mmol/L）=样本管吸光度（A）/校准管吸光度（A）*校准液浓度 葡萄糖（mg/dl）=mmol/L*18

利用测血糖试剂盒测得注射PBS缓冲液，眼柄粗提物和重组河蟹高血糖激素蛋白后，中华绒螯蟹血淋巴中血糖浓度的变化特征。结果显示如图5和表9所示：注射PBS缓冲液后在0.5h，1h，2h，4h，6h各个时间点血糖浓度与0h无明显变化（P>0.05）；注射眼柄粗提物的阳性对照组后1h的血糖浓度上升幅度增加与空白组相比有显著性差异（0.01<P<0.05），2h后血糖浓度达到最高与空白组有极显著性差异（P<0.01）；注射重组河蟹高血糖激素后河蟹血糖浓度也发生了显著变化，注射后1h血糖浓度上升后与空白组相比有显著性差异（0.01<P<0.05），2h血糖浓度继续升高，与空白组相比具有极显著性差异（P<0.01）。

表9 注射PBS、眼柄粗提物、重组CHH后中华绒螯蟹血淋巴中血糖浓度的变化数值

所得结论：

（1）本专利研发的重组河蟹高血糖激素与河蟹眼柄粗提物类似可以在短时间内使河蟹血糖浓度快速提高；

（2）在此研究基础上，我们可以在河蟹生长发育的关键时期采用注射法或者投喂的方法把重组的河蟹高血糖激素作用到河蟹体内，可以显著提高其血淋巴中的血糖水平，调控其代谢活动，有利于河蟹快速获得能量，维持其生长发育活动的正常进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120>中华绒螯蟹高血糖激素的基因工程制备和鉴定方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catatgcagg cctacgaccg c 21

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagctttcag tggtggtggt ggtggtggcc aaccacccgg a 41

Claims (5)

1.一种重组中华绒螯蟹（河蟹）高血糖激素（rErs-CHH），其特征在于该重组高血糖激素的蛋白分子量约为9.4kD，纯化复性后得率为0.4g/L培养基。

2.权利要求1所述重组中华绒螯蟹（河蟹）高血糖激素（rErs-CHH）的原核重组表达方法，其特征在于它是将河蟹高血糖激素基因与表达载体连接，完成目的表达载体（pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Ers -CHH）的构建，并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性。

3.权利要求2所述的河蟹高血糖激素基因的原核重组表达方法特征在于：

(1) Ers -CHH原核表达载体的构建：

将已知的目的基因Ers -CHH（GenBank注册号：JX485664）成熟肽区域与表达载体质粒pCR®T7/NT TOPO®TA进行连接，构建重组表达质粒pCR^®T7/NT TOPO^®TA- Ers-CHH，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞后测序；

(2) 重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析：

利用诱导剂IPTG对含有重组表达质粒的菌体进行不同时间的诱导表达，收集样品进行电泳检测，以确定蛋白的最佳诱导时间；

(3) 重组蛋白的分离纯化及复性：

利用固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术对目的蛋白进行分离纯化，利用梯度尿素透析法进行蛋白的复性处理；

(4)目的蛋白的质谱鉴定：

将目的蛋白进行切胶、酶解和离子阱质谱分析鉴定。

4.一对用于河蟹高血糖激素基因原核重组表达的特异性引物：

Es-CHHFM1: 5’-CATATGCAGGCCTACGACCGC-3’

Es-CHHRM1: 5’-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCAACCACCCGGA-3’。

5.权利要求1所述的重组中华绒螯蟹（河蟹）高血糖激素（rErs-CHH）在提高河蟹血淋巴中血糖水平、调控其代谢生长方面的应用。

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