CN105238792A - 一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用。Esflol基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp，具有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列。所对应的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示；该序列编码426个氨基酸，序列编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD。实验结果显示：本发明筛选克隆到的中华绒螯蟹flotilin类似蛋白Esflol基因，其表达量提高了2.8倍，通过对其分子全长进行序列解析；在对河蟹的Esflol基因进行RNA干扰后，机体的葡萄糖水平下降，促使糖原累积到了肝脏。从而具有促使糖原累积到了肝脏，提高了熟蟹的营养物质含量，提升了熟蟹的风味的效果。

Description

一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用

本研究受到国家自然科学基金青年基金（31302168）；天津市应用基础与前沿技术研究计划(一般项目)（14JCYBJC30700）；天津师范大学博士基金（52XB1303）的支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用。

背景技术

甲壳动物高血糖激素（CHH），是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于节肢动物中，在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上的鸟苷酸环化酶（GC）已被公认为Y器官的CHH受体，但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。在本研究中，我们通过对河蟹转录组分析，筛选克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了2.8倍的基因—中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol）作为目标分子去研究。在对河蟹的Esflol基因进行RNA干扰后，机体的葡萄糖水平下降，促使糖原累积到了肝脏。中华绒螯蟹简称河蟹，每100克河蟹食用部分中含蛋白质14%，脂肪5.9%，碳水化合物7%，此外，还含有维生素A、核黄素、烟酸，其发热量超过一般鱼类的营养水平。其中富含的维生素A更是人体不可或缺的一种微量元素，行使着促进儿童生长发育，预防夜盲症与保持上皮组织的健康状态等重要生理作用。

河蟹自身所拥有的这些特点使其具有可观的市场经济价值，也推动了其养殖业的发展。目前，河蟹的养殖已经打破了传统的地域界限，河蟹的养殖已出现在江苏、安徽、河北、广东、福建等多个省份；养殖方式也由传统的资源放流型养殖发展为当下的集约化高密度养殖。近年，河蟹的出口量也在不断攀升，所以为了满足不断攀升的市场需求，发展河蟹的养殖业成为关键所在，而如何缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育，提高产品的质量与产量成为了这一行业发展中的重中之重。

肝胰腺是河蟹重要的组织器官，肩负着许多生理功能，其中包括合成并分泌消化酶、吸收营养物质、存储无机物，代谢糖类物质，除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理活动。河蟹的肝胰腺主要由多种细胞构成，根据细胞形态和功能可以分为四种，即胚细胞（E细胞）、分泌细胞（B细胞）、吸收细胞（F细胞）、储存细胞（R细胞）。其中R细胞主要形式储存功能，R细胞的胞质中具有圆形的小液泡，近圆形的细胞核靠近细胞基部，部分细胞具有大小不一的双核，两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬碱性强的脂滴，胞质中游离核糖体的数量同样非常之多，除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能，储存着河蟹生活必需的能量来源。

碳水化合物是细胞生命活动最直接的能源。在河蟹生长的初期阶段，饲料中的糖分含量是决定成活率的第一限制因素。一旦河蟹在发育阶段缺乏糖类营养物质，就会使体内的脂类作为能量物质被大量消耗，这样就会无法满足生殖腺发育对脂类物质的需求，影响河蟹个体的发育。作为食物来说，河蟹有三大可食部位：肌肉、肝胰腺和性腺，其中肝胰腺因具有独特的风味和较高的营养价值是最受食客青睐的重要部分之一。醛类化合物是影响熟蟹肝胰腺风味的重要挥发性物质，由脂质受热降解形成。河蟹中的蛋白质与脂质类物质具有很高的营养价值。所以肝细胞是否可以大量储存糖原物质，并高效转化为河蟹个体可以直接利用的能源对于缩短河蟹成熟期、使蛋白质与脂质富集有着重要意义。

甲壳动物高血糖素（CHH）属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的多肽，包括蜕皮抑制激素（MIH），卵黄/精巢抑制激素（VIH/GIH），大腭器抑制激素（MOIH）以及离子转运多肽（ITP）。所有这些成员都只在节肢动物中发现。

学界广泛认为，CHH是能够调控几种生理活性的多效分子，如血糖水平，脂类代谢，蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的主要靶标器官，肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量，肌肉亦是另一个糖原的储存场所。学者们认为，CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显不同的。肌肉的糖原只供给其自身，相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。

在外界环境的胁迫下，机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后，糖原磷酸化酶明显下降而糖原合成酶的明显上升，这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝脏的糖原代谢的，但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中，已经明确的证实了当减去眼柄之后，肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直接和CHH作用的分子依然悬而未决。

flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂筏（lipidraft）上的连接性蛋白。除此之外，它们能分布在细胞内体，吞噬体，高尔基体甚至细胞核，直到现在，关于flotilins是否只在质膜上存在还没有定论。

在flotilin家族中存在两种同源异构体，flotilin1和flotilin2。一般认为，这两类蛋白会相互结合形成异源多聚体，并参与到一些细胞活动中，如轴突再生，膜蛋白更新，以及内吞作用等等。虽然flotilin在种间进化上十分保守，但它的确切功能依然存在较大的争议并需要进一步的证据来证明许多的推断。最早，在金鱼的视网膜细胞轴突再生的研究中发现了flotilin，当时被命名为再生reggies。敲除flotilins可显著减弱机体对胆固醇的吸收，这意味着它在NPC1L1介导的胆固醇吸收机制中起着关键的作用。在T细胞中，flotilins被定位在细胞的一端，形成一个flotilin帽子结构，这个结构能够激活PrP^c导致主要的T细胞受体复合体CD3的回收，而连接这一受体和一类信号分子如Vav的通路也被人们发现。也就是说，flotilin形成的亚结构能作为T细胞的信号平台。

据推测，在细胞某些特定位置的Flotilins能够参与细胞膜以及膜表面蛋白的更新。在脂肪细胞，Flotilins能够从细胞深层将GLUT4回收到细胞表面。一些数据还支持说Reggie/flotilin蛋白能在细胞相互接触的区域参与信号过程。

作为理解甲壳动物中Flotilin类似蛋白功能的第一步，我们找到了一个了河蟹E.sinesisflotilin类似基因，命名为Esflol。在本研究中，我们分析了序列，表达特征，以及在肝脏器官的组织定位，并进行了RNA干涉实验。

发明内容

本发明公开了一种河蟹E.sinesisflotilin类似基因，命名为Esflol基因序列，其特征在于该基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

本发明所述Esflol基因序列，其所对应的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该序列编码426个氨基酸，序列编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD。

SEQIDNO.1所示的Esflol核苷酸序列：

ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCCAGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGCACCATCACAGTCCACTCACCTGATGTGTACACGGCCCGAGGTGTTGCCATCAAGGTTACAGGAGTAGCTCAGGTCAAAATCAACACCCAGCATCCCAAGGTCCTGGCGATGGCTTGCGAGCATTTCCTGAAGAAGAAGCAGAGCGAGATCGACACCCTCATCACTTCGACGCTGGAGGGTCACCAACGCGGCATTATGGGCACGATGAATGTTGAGGACATCTACAAAAATCGAAAGCTGTTCAACGAGCGAGTGTTTAACGTGGCCTCCAAGGACCTCTACAACCTTGGCCTCCACGTCATCTCCTACACCATCACGGATCTCAGTGACGACATGGGTTACCTAAAAGCTCTGGGCAAGGGGAGGACAGCCGAGGTACAACGTGACGCTCGGATCGGGGAGGCGGAGGCAAAGAAGGACGCAATGATAGAGAAATGCATTGCCTCGGAGCAGCTGATGAAGGCGAAGCTTGCCAATGACACGCTGGTAGCCGAATTTAACAGGGATTTCCAGTTGAAGAAAGCCACTTATGACCAGGAGGTTCGGGCTAAGCAAGCAGAAACCGACCTTGCGTTTGAACTTCGGACCTGCAAGACAAAACAGAAGATCAAAGAAGAAGTGATGGAGACGAAGGTGGTGGAGAGGAAGGCCAGGATCTTAGTGGCGGAGCAGCAAATTCAACTAACTGAGAAAAaGCTGGAGGCCGAGGTGAAGCAACCATCGGATGCGGAAAAATTCAGGCTGGAGACCATTGCCGGGGCCCAGAAACAAAGGCTGCTTCTGGAGGCTGAGGCGGCGGCGGAGGCGAAGCGGCTGATGGGCGAGGCTCAAGCACTGGCCATCACGGCTAAGGGTAATGCAGAGGCCACCAATATGCACCGCAAGGCAGAGGCGTGGAAGGAGTTCAAGGACGCGGCGATGTTAAGTATGTACCTGGAGACCCTGCCCAAGCTGGTGGGCGAGGTCGGCAGCGCCCTGGGCAATGTCAAAAGCATCAAGATGGTGTCCTCAGGTGACTCTCCTATCGGGGCACAGAAACTGACCCAGGAAATCATGGACATCAGCAGCAACGTGCCCGCCATGGTCAAGAATCTCACGGGCGTCAACTTCATGAAGAACCTCCGTGTAGCATGA

SEQIDNO.2所示的Esflol氨基酸序列：

MIPIFITCPPNEVLVVSGLGFTQPAMITGGRVLVVPGLMRWSRLSLNVRTITVHSPDVYTARGVAIKVTGVAQVKINTQHPKVLAMACEHFLKKKQSEIDTLITSTLEGHQRGIMGTMNVEDIYKNRKLFNERVFNVASKDLYNLGLHVISYTITDLSDDMGYLKALGKGRTAEVQRDARIGEAEAKKDAMIEKCIASEQLMKAKLANDTLVAEFNRDFQLKKATYDQEVRAKQAETDLAFELRTCKTKQKIKEEVMETKVVERKARILVAEQQIQLTEKKLEAEVKQPSDAEKFRLETIAGAQKQRLLLEAEAAAEAKRLMGEAQALAITAKGNAEATNMHRKAEAWKEFKDAAMLSMYLETLPKLVGEVGSALGNVKSIKMVSSGDSPIGAQKLTQEIMDISSNVPAMVKNLTGVNFMKNLRVA.

本发明进一步公开了河蟹E.sinesisflotilin类似基因序列在缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育，提高熟蟹的营养物质含量，提升熟蟹风味方面的应用方面的应用。特别是在提高河蟹肝胰腺糖原累积方面的应用。实验结果证实：

（1）本发明筛选克隆到的SEQIDNO.1核苷酸序列，是在去除河蟹眼柄后表达量提高了2.8倍的基因—中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol）。

（2）通过针对中华绒螯蟹flotilin类似蛋白进行的RNA干扰，证明能够使机体的葡萄糖水平下降，促使糖原累积到了肝脏。提高了熟蟹的营养物质含量，提升了熟蟹的风味。

本发明公开的提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用所具有的积极效果在于：

（1）能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的养殖周期，实现养殖户利润的最大化。

（2）提高养殖河蟹的平均重量，增加亩产。

（3）提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。

附图说明：

图1为中华绒螯蟹Esflol基因cDNA及其编码氨基酸序列；横线部分表示跨膜区域，阴影部分表示SPFH结构域；

图2为PET-T7-Esflol载体单克隆PCR检测电泳结果；

图3为双链RNA电泳结果；

图4为半定量检测EsflolRNAi效果；

图5为中华绒螯蟹不同实验组血糖水平；

图6、糖原染色对照；

图7、河蟹肝胰腺糖原染色。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售，

所用到的试剂均要提供来源，请加以审核。

实施例1

1.动物与组织取样

健康的中华绒螯蟹（E.sinesis）取自天津水生动物疾控中心，并在实验前于干净的水体中暂养两周，使用新鲜鱼每两天喂食一次。为了排除喂食带来的碳水化合物代谢干扰，受检测的河蟹在去除眼柄之后都进行了禁食处理。水温被控制在20±1oC，光周期为12h明：12h暗。各种组织通过解剖得到，实验用河蟹被提前放置冰上麻醉。然后取出河蟹的肝，肌肉，心，腮，肠，胸神经节，卵巢和精巢组织，放入液氮冷冻并研磨做RNA和蛋白抽提备用。

2.Trizol法提取总RNA

取5只一龄成熟中华绒螯蟹，解剖出肝胰腺组织，立即置于1.5mLEP管中在液氮中急冻，按照TRIzol（Invitrogen）说明书中提供的方法提取肝胰腺总RNA：

3.第一链cDNA的合成

依据M-MLVReverseTremscriptase（TaKaRa）说明书进行操作，从各样品取1μg总RNA，作为反转录反应的模板，以AOLP为接头引物合成第一链cDNA，用于之后的实验。其余RNA置于-80℃冰箱中保存。

（1）RNA的的变性及样品中残余DNA的去除

将上述体系混匀，总体系共25μL。38℃2h，90-96℃15min。

4.Esflol基因的克隆

（1）根据转录组测序得到的提示序列信息和同源物种的flotillin-1基因序列

设计引物5R1(5'-ACCACCTTCGTCTCC-3')

和5R2(5'-TTTCTGCTTGCTTAGCCCGAACC-3')。

（2）以反转录获得的中华绒螯蟹肝胰腺cDNA为模板，在Bio-RadPCR仪上进行Esflol基因cDNA片段的扩增；

根据以上体积向PCR小管中加入试剂，总体积为25μl。PCR反应程序如下：

（3）以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果之后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照说明书将目的片段产物进行回收纯化，后取2μL回收产物根据TakarapMDTM-19-TVector试剂说明书，在16℃进行过夜连接，连接体系如下：

（4）连接产物经热击转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化产物在37℃150r/min的条件下振荡培养40min后均匀涂布于含有氨苄的LB固体培养基上，置于恒温生化培养箱中过夜培养（12~16h）。

（5）第二天随机挑选多个单一菌落，接种于100μL含有氨苄的LB液体培养基中37℃振荡培养3h后，以菌液作为模板进行PCR检测筛选出阳性克隆，后由生工生物工程有限公司进行测序。得到Esflol序列。

5.序列的生物信息学分析

运用DNAstar软件中的SeqMan程序对测序结果进行载体片段的去除和拼接。利用ORF(openreadingframe)finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找目的基因的开放读码框；用BLAST、ClustalX及DNAstar中的MegAlign等软件进行序列的验证、翻译及蛋白质相似性分析;使用ComputepI-Mw进行蛋白质等电点和相对分子质量的计算。SMART程序分析氨基酸结构，SignalP4.1Server预测信号肽，TMpred进行跨膜区域的预测。

6.双链RNAs的合成和注射

重组质粒（pET-T7）在多克隆位点两端各有一个相向的T7启动子。接下来，使用两个引物iF和iR（表1）扩增出一个含有Esflol基因667-bp的片段。这个扩增片段被XbaI和EcoRI剪切后被亚克隆进入pET-T7质粒。对照组的质粒构建是使用了一段359bp长的GFP基因的cDNA序列。将两个质粒分别转化进入大肠杆菌DH5α菌株内然后分别测序。测序后将重新抽提质粒并转化进入入HT115菌株内并进行培养扩增，双链RNA的提取和纯化依照Yodmuang（2006）等描述的方法。

7.EsflolRNAi载体的构建

（1）根据EsflolORF区设计一对引物

dsF(5’-TCTAGAAGAAAGCCACTTATGACC-3’)，

dsR(5’-AATTCTGTGCCTTCCCTTAGG-3’)，

并添加酶切位点EcoR1、Xba1。

（2）按照下表将试剂按顺序加入到PCR小管，混匀后在离心机内短离5s后，放入到PCR仪中进行扩增。具体程序见下表：

（3）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

（4）按照SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒说明书回收PCR产物中的目的片段。

（5）将目的片段连接到PMD-19vector，转化到DH5α菌种中进行测序。具体步骤同上

（6）将含有PET-T7质粒的DH5α菌种接种到两管3ml已加入四环素的LB液体培养基中（Tet10μg/mL）37℃过夜培养，第二天用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒按照说明书抽提HT115质粒。

（7）将含有目的片段的质粒与PET-T7质粒分别进行双酶切，酶切体系如下表

（8）将酶切好的目的片段与质粒利用DNALigationkit按照说明书18℃过夜连接，连接体系如下，之后将连接产物进行转化至HT115菌株，挑选单克隆进行测序，具体步骤同上：

8.双链RNA的获得

（1）无菌的LB液体培养基200ml，加入Amp、Tet至使用浓度Amp（100μg/mL）,Tet(10μg/mL)，37℃培养至OD600（0.4-0.6），用0.4mM/LIPTG(母液浓度100mM/L)诱导4h。

（2）将菌液3000-6000rcf离心，10min，收集菌体。

（3）按Trizol法提取RNA具体实验方法同上。

（4）加入50-100μL水溶解RNA。

（5）将溶解的RNA80℃水浴35min，之后逐渐冷却至室温（关掉电源使水浴锅自然冷却），约2-3h后冷却完毕，按照DNA样品电泳方式进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果是否含有大量单链RNA。

（6）加入0.2μLRNase，30℃水浴10min，以去除单链RNA，后取1-2μL进行电泳检测（注意使用Rnase作用的时间不宜过长，以防止dsRNA降解）。

（7）加入RnaseAbuffer将体系稀释至300μL，再加入等量的酚氯仿[酚（PH4.5）：氯仿＝2:1,剧烈震荡，室温静置10min后，8000-14000g，4℃离心20min。

（8）转移上层水相至新的1.5mLEP管，加入2.5倍体积的无水乙醇，上下混匀，室温静置10min，沉淀RNA，若沉淀效果不佳可-20℃静置30min后取出继续上下混匀，直至沉淀完全。

（9）12000g，4℃离心15min，弃去上清。

（10）75%乙醇充分洗涤沉淀后，8000-14000g，4℃离心20min，倒置EP管使乙醇流尽，晾干。

（11）加入25μLDEPC水溶解dsRNA，Nanodrop检测浓度。

（12）用已构建好的GFP-HT115载体提取双链GFPRNA，步骤同上。

9.河蟹EsflolRNAi实验

（1）将中华绒螯蟹分为四个实验组，分别为空白对照组、去眼柄组、GFP组，Esflol组，每组五只螃蟹。

（2）将去眼柄组的中华绒螯蟹剪去眼柄，GFP组与Esflol组河蟹分别称重，按照15μg/只的量分别注射GFPdsRNA与EsfloldsRNA，注射位置同抽血位置。空白对照组不做任何处理。

（3）将四组中华绒螯蟹在相同条件下饥饿饲养，24h四组均注射葡萄糖溶液，为河蟹称重，以确定注射量，注射量为10μL/g。

（4）饲养48h，对四组中华绒螯蟹进行抽血，记录每次抽血量。用一次性注射器先抽取抗凝剂，保证抗凝剂体积大于等于抽血体积然后从螃蟹第四步足基部关节处抽取血液，每只约可抽取50-300μL，抽取血液后迅速与抗凝剂混匀，呈微蓝色，转移至1.5mLEP管（无酶管）中。将抽血后的螃中华绒螯蟹提取肝胰腺组织，提取RNA，方法同上。

（5）将抽取的血液样品进行离心，4℃,800g,10min。离心后将上清转移到新的EP管中冰上保存。

（6）用上海荣盛生物药业有限公司生产的葡萄糖测定试剂盒按照说明书对血液样品进行检测，并计算出血糖。

10.河蟹的血糖测定

使用皮下注射器从河蟹的步足基部抽取其血淋巴样本来检测血糖浓度，样品抽取出来之后马上与等体积的抗凝剂（0.3mol/LNaCl,20mmol/L柠檬酸三钠,26mmol/L柠檬酸,1mmol/LEDTA）混合。血糖的浓度使用血糖试剂盒测量（荣盛生物）

11.河蟹肝胰腺糖原染色

石蜡切片的PAS（过碘酸雪夫氏）染色方法

1.切片：厚3-4um，连续切片，捞在载玻片上，60-62℃烘箱（DHG-9140A型电热恒温箱）烤片2h。

2.二甲苯脱蜡10分×2次，无水乙醇3分钟×2次、95%乙醇2分钟、80%乙醇2分钟、70%乙醇2分钟、至自然水水化。

3.0.5％高碘酸水溶液室温下氧化10分钟。

4.自然水洗，蒸馏水洗5分钟。

5.在室温下schiff试剂反应15分钟，避光。

6.流水冲洗10分钟。

7.Mayer苏木素染色液复染1分钟，流水蓝化。

8.梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

实施例2

1.Esflol基因cDNA序列分析

以中华绒螯蟹总cDNA为模板扩增获得序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp，编码426个氨基酸，序列编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD。利用SignalP软件对编码区进行分析，发现Esflol不存在信号肽序列，不属于分泌蛋白。推导出的Esflol氨基酸序列经SMART分析表明，包含有典型的SPFH超家族结构，此外还具有PHB结构域，属于Band7蛋白家族，这一家族蛋白为构成细胞膜的重要组成部分且具有调节阳离子电导的功能。经TMpred预测，Esflol蛋白具有一个跨膜结构。

2.多重序列比对

经BLASTx、BLASTn与多序列比对表明，此氨基酸序列与拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）等的flotillin-1氨基酸序列具有相似性，达到50%左右，由此确定此序列为中华绒螯蟹flotillin-1like（Esflol）序列。

3.PET-T7-Esflol载体构建结果

为对已构建好的PET-T7-Esflol载体进行PCR检测的电泳结果，图中在目的大小750bp的位置克隆得到一条清晰单一的条带，后经测序确定所挑选的单克隆中含有目的片段序列，证明载体构建成功。

4.Esflol与GFP双链RNA的获得

图3中显示，两种双链RNA琼脂糖凝胶电泳结果，条带清晰，单一，可用于下一步实验，对中华绒螯蟹进行注射。

5.半定量PCR检测EsflolRNAi效果

以各实验组中华绒螯蟹肝胰腺组织作为检测对象，通过半定量PCR检测Esflol表达情况。图4中下半部分为通过内参基因调整模板量电泳结果，图中各电泳条带亮度基本一致，表示模板量基本已经调整一致。图中上半部分为Esflol在不同实验组样品中的表达情况，条带亮度代表表达量的多少。两组条带相比较，GFP48h组亮度略大，Esf48h组亮度几乎为零。GFP48h组为注射空白对照组，Esflol表达可能由于注射这一行为的刺激，表达量略有提升，而Esf48h组Esflol表达量明显低于前两组，几乎为零。

6.去眼柄及沉默Esflol后中华绒螯蟹血糖水平分析

图5中结果表示经过不同处理48h后的中华绒螯蟹血糖水平。四个柱子分别代表，剪去眼柄48h后的实验组、不进行任何处理的正常组、注射双链GFPRNA实验组、注射双链EsflolRNA实验组的血糖水平。结果显示注射了双链GFPRNA的实验组血糖水平略高于正常组，但并未呈现出明显差异，而去眼柄组与注射双链EsflolRNA组血糖水平几乎一致，且明显低于正常组与双链GFP组，呈现出明显差异。

7.Esflol基因的沉默导致血糖降低以及干细胞的空泡化

注射GFP双链RNA的中华绒螯蟹幼体的肝胰腺（对照组），从细胞形态学上来看没有什么异常（图6），细胞的排列也很规矩。但是注射Esflol基因双链RNA的对照组的肝胰腺细胞就出现了严重的空泡性肿胀（图7）。经过糖原染色实验（PAS），箭头所示，河蟹的肝胰腺空泡化区域内部出现大量糖原阳性信号，这说明注射Esflol双链能导致其肝胰腺细胞内部糖原的累积，可以提高熟蟹的营养物质含量，提升熟蟹风味。

结论：

机体的生理过程是被体内的诸多神经多肽调节的。在节肢动物中，很多的神经多肽是通过G蛋白藕连信号通路，并且有环核苷酸的参与（cAMP和从cGMP）以及二价钙离子的参与。当十足目的甲壳动物受到外界环境刺激的时候，MIH和CHH通过激活信号通路增加cAMP和cGMP的含量来抑制蜕皮。之前的研究结果表明，蟹的Y器官细胞膜存在一个特异的MIH和CHH受体。CHH的受体很可能是在膜上的鸟氨酸环化酶。但是，CHH对蜕皮的抑制效果比MIH小10到20倍，这也明示着CHH的主要功能是调节葡萄糖代谢而不是抑制蜕皮。先前的研究已经表明，CHH调节糖代谢的主要效应器官是肝胰腺和肌肉，但是该多肽激素的受体一直没能确定下来。本研究中，为了理清CHH调节的糖代谢途径下游的效应分子，我们做了转录组分析和表达特征分析。在去除眼柄之后表达量有明显变化的所有单一基因中，由于其所在家族成员参与人的胰岛素信号通路，我们选择了Esflol这一基因作为研究对象。此外，该基因的表达量在去除眼柄之后有了2.8倍的提高。以上结果都显示出Esflol基因在河蟹肝胰腺中参与到了糖代谢的过程当中。

我们克隆到了Esflol基因的全长cDNA序列并将其与人的flotillin1基因进行比对，发现N端存在一个SPFH结构域（stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C），从第6个氨基酸残基到第188个氨基酸残基。SPFH结构域存在于多种真核以及原核生物的膜蛋白中，如prohibitin（抗增殖蛋白），stomatin（红细胞7.2b蛋白）和podocin（肾小球足细胞特异表达的跨膜蛋白），这些蛋白都有很多不同的功能。但是，flotillin不用于SPFH家族成员，它有一个特征性的输水跨膜区域。在我们的研究中，疏水性分析显示Esflol含有一个输水结构域，揭示了该蛋白为一个跨膜蛋白。之后，这一推断被肝胰腺组织切片的免疫组化结果进一步印证（图2）。有趣的是，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点（图1），这也暗示着Esflol或许参与到了cAMP/cGMP参与的信号通路中。所有这些结果都更加证明了Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。

虽然，flotillins在进化上较保守而且在很多组织都有表达，但其确切功能还是很有争议的。其中一个功能就是在许多细胞信号途径中起着活性信号伴侣的作用。在我们的研究中，使用Esflol基因双链RNA干涉过的河蟹血糖水平降低到和单独减去眼柄的河蟹血糖一样低的水平。同上面我们讨论过的结果一样，这个结果也说明Esflol参与到了CHH调控的葡萄糖代谢途径的信号通路当中。此外，由于该蛋白还有一个跨膜疏水区域，这也强烈提示着Esflol很可能是河蟹肝胰腺的细胞膜表面CHH受体。相反地，根据先前对人类中的研究，GLUT4和flotillin1在骨骼肌中被定位在胞内的核周区。在胰岛素的刺激下，肌细胞开始吸收葡萄糖，随之，GLUT4移动到了肌细胞膜，但是当使用类固醇螯合剂来干扰flotillin1之后，胰岛素就不能再引起葡萄糖的吸收和GLUT4的移动了。从该文章的观点来看，如果前提是骨骼肌细胞的糖代谢是被胰岛素调控的话，沉默掉flotillin1并不能是的血糖降低。然而，在细胞膜表面能够和CHH直接作用并将CHH信号向胞内传递的分子始终未能出现。当提高饲料中糊精的含量后，L.rohita的幼鱼和C.catla的幼苗肝脏细胞的增大的现象在之前的研究中就已经被报道过。这中增大可能是糖原累积引起的，因为肝脏过多的碳水化合物已经被证实是累积的糖原。既然，从人到果蝇都有flotillin的表达，那么他的诸多功能一定还未被完全发现，所以关于它的研究应该在更多的地方得到深入。总之，本研究筛选克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了2.8倍的基因—中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol），对其分子全长进行序列解析；在对河蟹的Esflol基因进行RNA干扰后，机体的葡萄糖水平下降，促使糖原累积到了肝脏。

SEQUENCELISTING

<110>天津师范大学

<120>一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1281

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgattcccattttcatcacgtgtccgcccaatgaagtcctggtggtgtctggcctcggg60

ttcacgcagccagccatgatcactggaggccgcgtgctcgtcgtgcccggcctgatgaga120

tggagcagactgtccctgaacgttcgcaccatcacagtccactcacctgatgtgtacacg180

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atggacatcagcagcaacgtgcccgccatggtcaagaatctcacgggcgtcaacttcatg1260

aagaacctccgtgtagcatga1281

<210>2

<211>426

<212>PRT

<213>河蟹Esflol基因编码的氨基酸序列

<400>2

MetIleProIlePheIleThrCysProProAsnGluValLeuValVal

151015

SerGlyLeuGlyPheThrGlnProAlaMetIleThrGlyGlyArgVal

202530

LeuValValProGlyLeuMetArgTrpSerArgLeuSerLeuAsnVal

354045

ArgThrIleThrValHisSerProAspValTyrThrAlaArgGlyVal

505560

AlaIleLysValThrGlyValAlaGlnValLysIleAsnThrGlnHis

65707580

ProLysValLeuAlaMetAlaCysGluHisPheLeuLysLysLysGln

859095

SerGluIleAspThrLeuIleThrSerThrLeuGluGlyHisGlnArg

100105110

GlyIleMetGlyThrMetAsnValGluAspIleTyrLysAsnArgLys

115120125

LeuPheAsnGluArgValPheAsnValAlaSerLysAspLeuTyrAsn

130135140

LeuGlyLeuHisValIleSerTyrThrIleThrAspLeuSerAspAsp

145150155160

MetGlyTyrLeuLysAlaLeuGlyLysGlyArgThrAlaGluValGln

165170175

ArgAspAlaArgIleGlyGluAlaGluAlaLysLysAspAlaMetIle

180185190

GluLysCysIleAlaSerGluGlnLeuMetLysAlaLysLeuAlaAsn

195200205

AspThrLeuValAlaGluPheAsnArgAspPheGlnLeuLysLysAla

210215220

ThrTyrAspGlnGluValArgAlaLysGlnAlaGluThrAspLeuAla

225230235240

PheGluLeuArgThrCysLysThrLysGlnLysIleLysGluGluVal

245250255

MetGluThrLysValValGluArgLysAlaArgIleLeuValAlaGlu

260265270

GlnGlnIleGlnLeuThrGluLysLysLeuGluAlaGluValLysGln

275280285

ProSerAspAlaGluLysPheArgLeuGluThrIleAlaGlyAlaGln

290295300

LysGlnArgLeuLeuLeuGluAlaGluAlaAlaAlaGluAlaLysArg

305310315320

LeuMetGlyGluAlaGlnAlaLeuAlaIleThrAlaLysGlyAsnAla

325330335

GluAlaThrAsnMetHisArgLysAlaGluAlaTrpLysGluPheLys

340345350

AspAlaAlaMetLeuSerMetTyrLeuGluThrLeuProLysLeuVal

355360365

GlyGluValGlySerAlaLeuGlyAsnValLysSerIleLysMetVal

370375380

SerSerGlyAspSerProIleGlyAlaGlnLysLeuThrGlnGluIle

385390395400

MetAspIleSerSerAsnValProAlaMetValLysAsnLeuThrGly

405410415

ValAsnPheMetLysAsnLeuArgValAla

420425

Claims (4)

1.一种河蟹E.sinesisflotilin类似基因，命名为Esflol基因序列，其特征在于该基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述Esflol基因序列，其特征在于所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该序列编码426个氨基酸，序列编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD。

3.权利要求1所述河蟹E.sinesisflotilin类似基因序列在缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育，提高熟蟹的营养物质含量，提升熟蟹风味方面的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中缩短中华绒螯蟹的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原累积。