CN103191106B - 京尼平氨基酸衍生物作为NF-κB抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种京尼平氨基酸衍生物的NF-κB抑制剂的用途，京尼平氨基酸衍生物作为NF-κB抑制剂控制参与肿瘤转移的各种炎性细胞因子、主要的组织适合性复合基因、粘着分子的表达，通过阻断核因子NF-κB活化来抑制和治疗因NF-κB活化引起的病理性病症，如恶性肿瘤，自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等），心脑血管疾病，急性、慢性炎症，神经系统疾病（如抑郁症，阿尔茨海默病等），而且京尼平氨基酸衍生物能以与剂量和时间依赖的方式抑制NF-κB活性。本发明为NF-κB抑制剂及其NF-κB控制的相关疾病提供了一种新的药物来源。

Description

京尼平氨基酸衍生物作为NF-κB抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及一种作为NF-κB抑制剂，用于预防、缓解和/或治疗情感性精神障碍神经系统疾病（抑郁症）及慢性、急性炎症等的药物或保健食品，特别涉及用于治疗NF-κB异常激活有关的药物或保健食品。

背景技术

核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappa-B，NF-κB)最早是从B细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异结合的核蛋白因子，因而称之为NF-κB。通常生理情况下NF-κB与抑制蛋白因子IκB(Inhibitor ofκB)在胞质中结合，处于非激活状态。

当受到外源性刺激后，IκB激酶（IKK，包括IKKα和IKKβ）被激活，能在氨基酸末端丝氨酸残基特异位点（IκBα和IκBβ)磷酸化抑制蛋白因子IκB。IκBα在32和36位氨基酸末端丝氨酸残基被磷酸化，而IκBβ在19和23位氨基酸末端丝氨酸残基被磷酸化。磷酸化后的IκB被E3泛素连接酶选择性泛素化，导致存在于胞浆内的已磷酸化及泛素化的IκB被26S蛋白酶降解。降解后的IκB与NF-κB分离，NF-κB由细胞质转移到细胞核内，启动众多细胞介质和炎症因子(如TNF-α,IL-6,IL-1β,iNOS,COX-2,G-CSF,sICAM-1,IL-1α,IL-1ra,KC,JE,MIP-1β,RANTES等)的基因转录和蛋白表达，从而参与组织细胞的生理、病理反应。

NF-κB通路激活后产生活化的NF-κB，而活化的NF-κB功能的失调与多种人类疾病相关，如恶性肿瘤，自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等），心脑血管疾病，急性、慢性炎症，神经系统疾病（如抑郁症，阿尔茨海默病等）。例如：在严重抑郁性障碍病症中，激活NF-κB通路后能够增加炎性因子的表达，并且能够增加5HT1A基因的表达，减少5-HT神经元和5-羟色胺能神经递质的释放，最终导致抑郁症。因此，NF-κB已成为一个重要的药物作用靶点。针对NF-κB通路激活途中的不同环节作为靶点进行拮抗，是治疗上述疾病的关键。寻找NF-κB通路抑制剂，对哮喘，严重抑郁性障碍等具有重要的临床治疗意义。

NF-κB是调控众多炎症基因表达的关键转录因子，其通常以非活性状态存在于细胞质中，当细胞受到LPS、TNF-α等刺激时，NF-κB得以活化并从细胞质易位到细胞核，启动多种炎症基因表达，使大量的炎性细胞浸润于炎症部位。巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用，它通过激活机体的免疫系统，释放细胞因子、具有生物活性的脂类介质等一系列炎症介质，参与炎症反应。NF-κB发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤，应用NF-κB抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。

京尼平氨基酸衍生物，又称京尼平蓝或栀子蓝色素，在东亚被作为天然食品添加剂广泛应用于食品加工业及化妆品和医药工业。栀子蓝色素是以栀子的果实为原料，通过酶促反应产生的一种纯天然蓝色素，它是栀子苷在β-葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平与含有伯胺基的氨基酸（甘氨酸，赖氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸等）在合适的条件下发生聚合反应的产物，京尼平与甘氨酸的反应方程式如图1所示。

京尼平氨基酸衍生物除上述作为天然食品添加剂用于食品、化妆品和医药工业外，未见其有抑制NF-κB活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供京尼平氨基酸衍生物在制备治疗人和动物因NF-κB因子异常激活相关疾病药物或保健品的应用；尤其是恶性肿瘤，自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等），心脑血管疾病，急性、慢性炎症，情感性精神障碍神经系统疾病（如抑郁症，阿尔茨海默病等）等相关疾病的应用；其次是该衍生物能够与其他药物连用，作为增敏剂用于治疗急性、慢性炎症及抑郁症等与NF-κB因子异常激活相关疾病的用途。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种京尼平氨基酸衍生物在制备核因子NF-κB抑制剂的用途。

京尼平氨基酸衍生物在制备用于预防、缓解和/或治疗由核因子NF-κB活化引起的病理性病症的药物或保健品中的用途。

其中，所述病理性病症为恶性肿瘤，自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等），心脑血管疾病，急性炎症、慢性炎症，神经系统疾病（如抑郁症，阿尔茨海默病等）中的一种或多种，优选为急性炎症、慢性炎症或抑郁症中的一种或多种。

其中，所述的京尼平氨基酸衍生物为京尼平与含有伯胺基的氨基酸的衍生物。

特别是，所述的含有伯胺基的氨基酸选择丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等中的一种或多种。

本发明的京尼平氨基酸衍生物按照如下顺序进行的步骤制备而成：

本发明选用的是茜草科(Rubiaceae)植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)果实的主要化学成分栀子苷(Geniposide)，在β-葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平与含有伯胺基的氨基酸（丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等）在合适的条件下发生聚合反应的产物。具体制备条件如下：

将等摩尔量的京尼平和氨基酸加入到PBS(100mmol，pH7.0)缓冲溶液中，80℃搅拌4h，接着将得到的京尼平氨基酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，进行分离，并收集吸光度值为590nm的洗脱液，将收集到的洗脱液冷冻干燥机干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8℃冷藏保存，待用。

其中，所述京尼平氨基酸衍生物按照如下顺序进行的步骤制备而成：

1）将等摩尔的京尼平和氨基酸依次加入到PBS缓冲溶液（磷酸缓冲溶液）中，混匀；

2）加热并保持温度为60-80℃，电磁搅拌反应至少4h，即得。

特别是，步骤1）中所述京尼平为栀子苷(Geniposide)在β-葡糖糖苷酶的作用下水解而成；所述氨基酸为含有伯胺基的氨基酸，例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.0。

尤其是，所述氨基酸选择甘氨酸、酪氨酸。

其中，步骤1）中所述京尼平与所述PBS溶液的的摩尔数之比为8.8：100。

特别是，每100ml所述PBS溶液中加入2.2mmol所述京尼平。

其中，步骤2）中所述温度优选为80℃，电磁搅拌反应时间为4-8h。

特别是，还包括步骤3），将反应混合物通过HP-20大孔树脂柱，进行洗脱、分离，收集吸光度值为590nm的洗脱液，然后将洗脱液干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。

尤其是，所述的梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液，其中洗脱剂中乙酸乙酯-甲醇-水的体积之比为8：3：1。

其中，所述药物由京尼平氨基酸衍生物和药学上可接受的载体组成。

本发明中所述的京尼平氨基酸衍生物作为一种NF-κB抑制剂时，可以单独使用，也可以通过含有京尼平氨基酸衍生物的药物组合物的形式使用。

本发明所述药物是通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、尿道、阴道、静脉等途径给药。

药物组合物，通过本发明药物组合物含有0.1-99.9%重量的京尼平氨基酸衍生物，药物组合可以根据本领域已知的方法制备。

本发明所述所述京尼平氨基酸衍生物纯度超过90%。

本发明以京尼平氨基酸衍生物为活性成分，制备用于因核因子NF-κB活化引起疾病的抑制剂的药物制剂和相应的药物剂型。所述药物制剂是以所述京尼平氨基酸衍生物为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其它载体组分。

本发明所述药物以口服制剂、注射剂、局部给药制剂形式存在。其中所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂；注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂。

本发明中所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂形式存在，即药物制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式，但不局限于以上形式。

在制备口服制剂时可选用的载体可以是淀粉、糊精或环糊精及各种化学修饰环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规制药辅料。在制备冻干粉针剂时可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属于制药领域的常规技术，本发明对此不作限定。

本发明具有如下的明显优点：

1、本发明发掘了京尼平氨基酸衍生物新的用途，将其用于核因子NF-κB抑制剂，并可制备成预防、缓解和/或治疗由核因子NF-κB活化引起的病理性病症的药物或保健品，从而为京尼平氨基酸衍生物的应用开拓了一个新的领域。

2、本发明的京尼平氨基酸衍生物作为核因子NF-κB抑制剂的作用机理明确，疗效显著，毒副作用小、安全性好，能够长期服用，具有较高的成药性和良好的药用前景。

3、本发明的产品来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，使用方便，因此易于推广。

附图说明

图1是京尼平与甘氨酸的反应方程式。

图2是以β-actin作为内参，Western Blot分析P-IκB-α，IκB-α，IKK-α，IKK-β蛋白的表达的凝聚电泳图。

图3是与炎症相关40种蛋白表达的蛋白芯片扫描图；其中(a)为空白对照组蛋白芯片扫描图，(b)为模型组（LPS刺激组）蛋白芯片扫描图，(c)为京尼平甘氨酸衍生物组的蛋白芯片扫描图。

图4是蛋白芯片中与炎症相关40种蛋白表达结果的光密度分析图；其中LPS为模型组，Blue pigments为京尼平甘氨酸衍生物组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物或保健品的NF-κB抑制作用，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。

本发明采用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW274.7细胞株，给予京尼平甘氨酸衍生物(25,50,100μM)干预2h后，LPS（脂多糖200ng/mL）刺激0.5h后，验证药物对NF-κB通路的抑制作用。

本发明通过体外细胞实验验证京尼平氨基酸衍生物对炎症相关因子基因、蛋白的调节作用；通过体内动物模型(角叉菜胶诱导小鼠足趾肿胀，LPS腹腔注射诱导小鼠急性炎症模型)验证京尼平氨基酸衍生物对急性炎症的调节作用；通过小鼠行为绝望实验、小鼠开放场实验、小鼠利血平拮抗实验以及大鼠慢性温和不可预知性应激实验来验证京尼平氨基酸衍生物的抗抑郁作用。

本发明中使用的药物京尼平氨基酸衍生物为京尼平丙氨酸衍生物，京尼平缬氨酸衍生物，京尼平亮氨酸衍生物，京尼平异亮氨酸衍生物，京尼平苯丙氨酸衍生物，京尼平色氨酸衍生物，京尼平甲硫氨酸衍生物，京尼平脯氨酸衍生物，京尼平甘氨酸衍生物，京尼平丝氨酸衍生物，京尼平苏氨酸衍生物，京尼平半胱氨酸衍生物，京尼平酪氨酸衍生物，京尼平天冬酰胺氨酸衍生物，京尼平谷胺酰胺氨酸衍生物，京尼平组氨酸衍生物，京尼平赖氨酸衍生物，京尼平精氨酸衍生物，京尼平天冬氨酸衍生物，京尼平谷氨酸衍生物等。

本发明中使用的药物京尼平氨基酸衍生物按照如下方法制备而成：

将8.8mmol的京尼平和8.8mmol的氨基酸依次加入到400mL的PBS(100mmol，pH7.0)溶液中，80℃搅拌4h，接着将得到的京尼平氨基酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，进行洗脱分离，并收集吸光度值为590nm的洗脱液，将收集到的洗脱液冷冻干燥机干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8°C冷藏保存，待用。

试验例1NF-κB核因子转录试剂盒法（NF-κB Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay）和WesternBlot法检测NF-κB活性

1.1实验材料

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖培养基（干粉），Sigma-Aldrich公司（美国）。按照说明书用MilliQ级纯水配制并过滤除菌，2-8℃冷藏保存；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠，不含酚红配方的DMEM高糖培养基（液体），Hyclone公司（美国）；热灭活胎牛血清(HI-FBS)，Bioind公司（以色列）；核蛋白提取试剂盒，Active Motif公司（日本）；NF-κB Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay（NF-κB核因子转录试剂盒），Millipore公司（美国）；P-IκB-α，IκB-α，IKK-α，IKK-β单克隆抗体和过氧化物酶标记的二抗，Cell Singaling Technology公司（美国）；β-actin单克隆抗体，Sigma-Aldrich公司（美国）；Horseradishperoxidase substrate显色底物，Millipore公司（美国）；NF-κB inhibitor BAY11-7082，碧云天生物技术研究所（中国）；京尼平甘氨酸衍生物，京尼平酪氨酸衍生物，本实验室自制；Mammalian Cell Lysis细胞裂解试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司（中国）；BCA总蛋白测定试剂盒，Pierce公司（美国）；Tris Base，Sigma-Aldrich公司（美国）。

1.2实验方法

1.2.1核蛋白提取

1）将RAW264.7细胞以每孔5.0×10⁶个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，将供试细胞分成6组，空白对照组，模型组，京尼平甘氨酸衍生物高剂量组，京尼平甘氨酸衍生物中剂量组，京尼平甘氨酸衍生物低剂量组和对照药物组，其中空白对照组换入无酚红DMEM培养基组；模型组换入含LPS（200ng/mL）的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物高剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(100μM)+LPS(200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物中剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(50μM)+LPS(200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；京尼平甘氨酸衍生物低剂量组换入含有京尼平甘氨酸衍生物(25μM)+LPS(200ng/mL)的无酚红DMEM培养基；对照药物组换入含有NF-κB抑制剂BAY11-7082(10μM)+LPS(200ng/mL)的无酚红DMEM培养基。

2）换入无酚红DMEM培养基药物干预2h后，加入浓度为200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS（磷酸缓冲液，pH7.4）清洗细胞3次。加入细胞裂解液后按照核蛋白提取试剂盒(Active Motif)进行。将提取得到的核蛋白用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)进行蛋白定量，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为2mg/mL。

1.2.2NF-κB核因子转录实验

NF-κB是调控众多炎症基因表达的关键转录因子，其通常以非活性状态存在于细胞质中，当细胞受到LPS、TNF-α等刺激时，NF-κB得以活化并从细胞质易位到细胞核，启动多种炎症基因表达。NF-κB活化入核主要是其亚基P50和P65，因此测定其亚基P50和P65的活性，能够反映出NF-κB入核情况。核因子转录实验采用Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay试剂盒进行，将1.2.1提到的核蛋白，按照Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay试剂盒说明书进行操作。

1.2.3Western Blot法检测NF-κB活性

1）将RAW264.7细胞以每孔5.0×10⁶个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，换入含有药物的无酚红DMEM培养基，药物组分别为京尼平甘氨酸衍生物组（给药组），BAY11-7082组（阳性对照药组），和无酚红DMEM培养基组（空白对照组）。供试细胞分成6组，分别为(1)空白对照组，(2)模型组：LPS（200ng/mL），(3)京尼平甘氨酸衍生物高剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(100μM)+LPS(200ng/mL)，(4)京尼平甘氨酸衍生物中剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(50μM)+LPS(200ng/mL)，(5)京尼平甘氨酸衍生物低剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(25μM)+LPS(200ng/mL)(6)对照药物组：BAY11-7082(10μM)+LPS(200ng/mL)。

2）换入无酚红DMEM培养基药物干预2h后，加入浓度为200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS（磷酸缓冲液，pH7.4）清洗细胞3次。蛋白提取按照Mammalian Cell Lysis说明书进行。将提取得到的核蛋白用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)进行蛋白定量，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为2mg/mL。

5）配置蛋白电泳分离胶即配制浓度为8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离，其中，蛋白上样量为30μg；电泳条件为：层积胶电压80V，30min；分离胶电压100V，60min，电泳完后湿法转至PVDF膜，一抗(P-IκB-α，IκB-α，IKK-α，IKK-β，β-actin)4℃过夜，清洗干净后二抗室温孵育1h，二抗清洗干净后加入显色底物，X光片曝光显影，凝胶成像分析系统扫描，凝胶电泳分析结果如图2所示。

1.3实验结果

1.3.1Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay结果

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。核因子NF-κB p50和p65转录实验结果如表1所示。

表1  核因子NF-κB p50和p65转录(x±s,n=6)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：对照药物组（即NF-κB抑制剂BAY11-7082组）能够显著抑制NF-κB p50和p65的转录活性；与模型组（即LPS组）相比，京尼平甘氨酸衍生物高剂量组(100μM)能够显著降低NF-κB p50转录活性，具有统计学差异(P<0.01)；京尼平甘氨酸衍生物组(25，50，100μM)能够显著降低NF-κB p65转录活性，具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

1.3.2Western Blot法检测NF-κB活性的实验结果

根据蛋白凝胶电泳分析的结果如图2所示，与模型组（即LPS组）相比，本发明的京尼平甘氨酸衍生物组(25，50，100μM)能够显著抑制IκB-α蛋白的降解和磷酸化；同时，京尼平甘氨酸衍生物组(25，50，100μM)能够对LPS刺激引起的IKK-α，IKK-β蛋白上调具有一定的抑制作用，β-actin作为内参蛋白。说明京尼平甘氨酸衍生物抑制NF-κB p50和p65的转录活性是通过抑制IKK-α，IKK-β蛋白的降解以及抑制IκB-α蛋白的降解和磷酸化而实现的。

试验例2Real-time RT-PCR法检测炎症相关基因表达

2.1实验材料

UNIQ-10column Trizol总RNA提取试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司（中国）；

Improm-II Reverse Transcription System逆转录试剂盒，Promega公司（美国）；

FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)实时定量PCR试剂盒，Roche公司（德国）；

iNOS,COX-2,IL-6,TNF-α和β-actin等基因引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表2。

表2  基因扩增引物序列表

2.2实验方法

2.1总RNA的提取

1）将RAW264.7细胞以每孔5.0×10⁶个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，换入含有药物的无酚红DMEM培养基，药物组分别为京尼平氨基酸衍生物组（给药组），无酚红DMEM培养基组（空白对照组）。供试细胞给药组别和给药量为(1)空白对照组，(2)模型组：LPS（200ng/mL），(3)京尼平甘氨酸衍生物高剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(100μM)+LPS(200ng/mL)，(4)京尼平甘氨酸衍生物中剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(50μM)+LPS(200ng/mL)，(5)京尼平甘氨酸衍生物低剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(25μM)+LPS(200ng/mL)。

2）药物按照以上剂量先干预2h后，除空白对照组外，各组加入终浓度为200ng/mL的LPS刺激6h，用PBS冲洗细胞后加入0.4ml Trizol提取RNA。RNA提取按照UNIQ-10column Trizol总RNA提取试剂盒说明书进行。

2.2总RNA浓度的测定

用96孔UV测试板进行测试，取2μL RNA溶液（2.1.2中提取得到），加入98μL DEPC水，以DEPC水作空白对照。于多功能读板机（FlexStation3，Molecular Devices公司，美国）上分别测定260nm、280nm波长下的光密度值(OD值)。计算OD_260/280。

按1OD₂₆₀=40μg RNA计算RNA的产率：总RNA浓度(μg/μL)=OD₂₆₀×40×稀释倍数/1000

2.3逆转录合成cDNA

将1μg总RNA与1μL随机引物（含有6个碱基的随即序列引物，含有4⁶种可能序列，宝生物工程大连有限公司）混匀，用灭菌水补至5μL；70℃加热5min后迅速置于冰上冷却5min；然后加入15μL逆转录混合液后，于25℃退火5min，42℃反应60min，70℃灭活逆转录酶15min。逆转录混合液的配置按照Improm-II Reverse Transcription System逆转录试剂盒说明书进行。

2.4Real-time PCR

采用SYBR Green I实时定量PCR，即在PCR反应液中加入荧光染料SYBR Green I，由于SYBR GreenI能够与双链DNA结合并发出荧光，从而能达到检测的目的。扩增结束之后进行溶解曲线分析，以确保目的基因得到了特异性的扩增。Real-time PCR反应液按照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)实时定量PCR试剂盒说明书配置。PCR反应条件包括三个步骤：(1)预变性阶段，温度为94℃，时间为2min，共1个循环；(2)变性阶段，温度为94℃，时间为15s；退火阶段，温度为60℃，时间为1min；延伸阶段，温度为72℃，时间为1min；共40个循环：(3)溶解曲线。

2.5实验结果

C_T值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，与拷贝量呈负对数关系。ΔC_T=目的基因C_T值-内参照基因(β-actin)C_T值。

应用ABI7300实时定量PCR仪分析软件调整基线和阈值后，查看并分析反应板数据，获得每个样品每次反应的C_T值，再计算得到其ΔC_T，与对照组比较后，取2^-ΔΔC _T值进行数据统计。

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。Real-time PCR检测炎症因子基因表达结果如表3所示。

表3  Real-time PCR实验结果(x±s,n=6)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：与模型组（LPS组）比较，京尼平甘氨酸衍生物组(25，50，100μM)能够抑制TNF-α,IL-6,COX-2和iNOS基因的表达(P<0.05或P<0.01)。

试验例3.ELISA法检测炎症相关蛋白的表达

3.1实验材料

TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒，Invitrogen(Biosource)公司，美国。

3.2细胞处理及样本的收集

1）将RAW264.7细胞以每孔1.0×10⁵个细胞种植到24孔细胞培养板，培养24h后换液，换入含有药物的无酚红DMEM培养基，药物组分别为京尼平甘氨酸衍生物组（给药组），无酚红DMEM培养基组（空白对照组）。供试细胞给药组别为(1)空白对照组，(2)模型组：LPS（200ng/mL），(3)京尼平甘氨酸衍生物高剂量组：京尼平氨基酸衍生物(100μM)+LPS(200ng/mL)，(4)京尼平甘氨酸衍生物中剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(50μM)+LPS(200ng/mL)，(5)京尼平甘氨酸衍生物低剂量组：京尼平甘氨酸衍生物(25μM)+LPS(200ng/mL)，(6)京尼平甘氨酸衍生物极低剂量组(12.5μM)+LPS(200ng/mL)。

2）将RAW264.7细胞按照3.1.1中给药浓度刺激18h后收集细胞培养上清液。

3.3测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-6的浓度

检测细胞上清液样本中TNF-α、IL-6的浓度超过试剂盒标准曲线的范围，用无酚红DMEM培养基将细胞上清液按10倍进行稀释，将稀释10倍后得到的样本，按照ELISA试剂盒(TNF-α、IL-6试剂盒)说明书进行。

TNF-α、IL-6测定结果如表4所示。实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。

表4  ELISA实验结果(x±s,n=6)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：与模型组（LPS组）比较，京尼平甘氨酸衍生物组(12.5，25，50，100μM)能够减少TNF-α的分泌，且京尼平甘氨酸衍生物(50μM)具有显著性差异(P<0.05)；京尼平甘氨酸衍生物组(25，50，100μM)能够减显著少IL-6的分泌，且具有显著性差异(P<0.01)。

试验例4蛋白芯片检测与炎症相关40种蛋白的变化

4.1实验材料

Mouse Cytokine Array Panel A Array蛋白芯片试剂盒，R&D公司，美国。

4.2总蛋白提取

1）将RAW264.7细胞以每孔5.0×10⁶个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，换入含有药物的无酚红DMEM培养基，药物组分别为京尼平氨基酸衍生物组（给药组），无酚红DMEM培养基组（空白对照组）。供试细胞给药组别为(1)空白对照组，(2)模型组：LPS(200ng/mL)，(3)京尼平甘氨酸衍生物组：京尼平甘氨酸衍生物(100μM)+LPS(200ng/mL)。

2）RAW264.7细胞按照4.2.1中刺激18h后用冷的PBS清洗细胞，提取细胞的总蛋白，总蛋白提取按照Mammalian Cell Lysis说明书进行，提取得到的总蛋白按照BCA法蛋白测定试剂盒(Pierce)进行，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为3mg/mL。

4.3蛋白芯片实验

蛋白芯片测定细胞诱导40种蛋白的表达变化。40种蛋白包括：BLC,C5a,G-CSF,GM-CSF,I-309,Eotaxin,sICAM-1,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-1ra,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-16,IL-17,IL-23,IL-27,IP-10,I-TAC,KC,M-CSF,JE,MCP-5,MIG,MIP-1α,MIP-1β,MIP-2,RANTES,SDF-1,TARC,TIMP-1,TNF-α,TREM-1。蛋白芯片实验按照Mouse Cytokine Array Panel A Array蛋白芯片试剂盒说明书进行。

光密度分析采用Image-Pro Plus version6.0系统进行(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)。蛋白芯片实验结果如图3所示。图3中(a)为空白对照组，(b)为模型组（LPS刺激组），(c)为京尼平甘氨酸衍生物组的蛋白扫描图片，其中1为G-CSF,2为sICAM-1,3为IL-1α,4为IL-1β,5为IL-1ra,6为KC,7为JE,8为MIP-1α,9为MIP-1β,10为MIP-2,11为RANTES,12为TNF-α。图4中为细胞诱导后的采用光密度分析测定的各蛋白的光密度。

实验结果表明：

细胞加入LPS刺激后，G-CSF,sICAM-1,IL-1α,IL-1β,IL-1ra,KC,JE,MIP-1α,MIP-1β,MIP-2,RANTES和TNF-α等细胞炎性因子或蛋白的表达被上调，京尼平甘氨酸衍生物(100μM)能够抑制上述炎性因子或蛋白表达的上调，与模型组相比，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

试验例5角叉菜胶诱导小鼠足趾肿胀试验

5.1实验材料

健康ICR小鼠，雄性，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2009-0003。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，适应性喂养5-7天后进行实验，每只动物仅使用一次。

阳性对照药物：地塞米松磷酸钠注射液，上海通用药业股份第三公司（中国）。

角叉菜胶：Sigma-Aldrich公司（美国）。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。京尼平甘氨酸衍生物给药浓度分别为(120mg/kg)、(60mg/kg)、(30mg/kg)，地塞米松磷酸钠注射液(10mg/kg)。

5.2实验方法

将ICR小鼠随机分成5组，每组10只，即空白对照组、阳性药物组(地塞米松磷酸钠注射液，10mg/kg)、京尼平甘氨酸衍生物高(120mg/kg)、中(60mg/kg)、低(30mg/kg)剂量组。各组均按0.2mL/20g体重腹腔注射给药，空白对照组给予等量的生理盐水。给药1h后每只小鼠的右脚趾注射0.05mL的1%的角叉菜胶，空白组注射生理盐水。注射角叉菜胶1h，2h，3h，4h后分别用容积测量器测量小鼠足趾注射角叉菜胶前后溶积的变化，可反映其肿胀程度。

5.3实验结果

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。角叉菜胶诱导小鼠足趾肿胀实验结果如表5所示。

表5角叉菜胶诱导小鼠足趾肿胀实验结果(x±s,n=10)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：小鼠注射1%的角叉菜胶后，与空白组比较，模型组的肿胀程度显著增大；与模型组比较，给予阳性药物(地塞米松磷酸钠注射液，10mg/kg)后，在不同时间点内(1，2，3，4h)肿胀程度显著减小(P<0.01)；京尼平甘氨酸衍生物组也能够降低不同时间点内(1，2，3，4h)的足趾肿胀程度(P<0.05或P<0.01)。

试验例6腹腔注射LPS诱导小鼠急性炎症试验

6.1实验材料

健康ICR小鼠，雄性，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2009-0003。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，适应性喂养5-7天后进行实验，每只动物仅使用一次。

阳性对照药物：地塞米松磷酸钠注射液，上海通用药业股份第三公司（中国）。

LPS：Sigma-Aldrich公司（美国）。

TNF-α，IL-6ELISA试剂盒：Invitrogen(Biosource)公司（美国）。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。京尼平甘氨酸衍生物给药浓度分别为(120mg/kg)、(60mg/kg)、(30mg/kg)，地塞米松磷酸钠注射液(10mg/kg)。

6.2实验方法

将ICR小鼠随机分成5组，每组8只，即空白对照组、阳性药物组(地塞米松磷酸钠注射液，10mg/kg)、京尼平甘氨酸衍生物高(120mg/kg)、中(60mg/kg)、低(30mg/kg)剂量组。各组均按0.2mL/20g体重腹腔注射给药，空白对照组给予等量的生理盐水。给药30min后每只小鼠按0.2mL/20g体重注射(1mg/kg)的LPS200μL，空白组注射生理盐水。注射LPS90min后用已肝素化好的1.5mL离心管采用股动脉取血，取得的样本离心机2500rpm离心20min，得到血浆样本，-20°C保存，用于ELISA实验。ELISA实验按照说明书进行，样本在测定前用生理盐水进行5倍稀释，测定血浆中的TNF-α，IL-6的含量。

6.3实验结果

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。腹腔注射LPS诱导小鼠急性炎症结果如表6所示。

表6腹腔注射LPS诱导小鼠急性炎症结果(x±s,n=8)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：小鼠注射LPS(1mg/kg)，与空白组比较，模型组血浆中的TNF-α，IL-6分泌迅速上调。与模型组比较，给予阳性药物(地塞米松磷酸钠注射液，10mg/kg)后，TNF-α，IL-6的分泌被显著下调(P<0.01)；与模型组比较，给予京尼平甘氨酸衍生物组也能够降低LPS注射后小鼠血浆中TNF-α，IL-6的浓度。(P<0.05或P<0.01)。

试验例7小鼠行为绝望试验

7.1实验材料

健康ICR小鼠，雄性，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2009-0003。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，适应性喂养5-7天后进行实验，每只动物仅使用一次，仅在试验前1h给药1次。

阳性对照药物：盐酸氟西汀胶囊（百优解），礼来苏州制药有限公司，批号：9902A。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。京尼平酪氨酸衍生物给药浓度分别为(100mg/kg)、(50mg/kg)、(25mg/kg)，盐酸氟西汀(15mg/kg)。

Digibehave双画面动物行为视频分析系统2.1版(上海吉量软件科技有限公司)；温度计；多道电子计时器；有机玻璃缸；悬挂钩；50mL刻度离心管(Corning公司)；动物灌胃器(北京吉安得尔科技有限公司)等。

所有实验均于上午9时至下午3时之间进行。

7.2实验方法

7.2.1小鼠强迫游泳实验

将ICR小鼠随机分成5组，每组8只，即空白对照组、阳性药物组（盐酸氟西汀，15mg/kg）、京尼平酪氨酸衍生物高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）剂量组。各组均按0.5mL/20g体重灌胃给药，空白对照组给予等量的生理盐水。于给药1h后将各组小鼠分别置于高20cm，直径10cm的有机玻璃缸中，有机玻璃缸中放入25±1℃的水，高度15cm，每次操作一只，并且使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的游泳行为，分析后4min内小鼠强迫游泳的累计不动时间(s)。不动时间判断为动物在水中停止挣扎，呈漂浮状态，只有细小的肢体运动以保持头部浮在水面上。

7.2.2小鼠悬尾实验

将ICR小鼠随机分成5组，每组8只，即空白对照组、阳性药对照组（盐酸氟西汀，15mg/kg）、京尼平酪氨酸衍生物高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）剂量组。各组均按0.5mL/20g体重灌胃给药，空白对照组给予等量的生理盐水。于给药1h后将各组小鼠的尾尖1cm处黏贴倒置悬挂，用胶布固定在挂钩上，使其呈倒悬状态，头部离实验台约15cm，每次操作一只，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的绝望行为，分析后4min内的累计不动时间(s)。判断不动的标准为小鼠停止挣扎，呈倒悬垂状态，静止不动。

7.3实验结果

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。小鼠行为绝望实验结果如表7所示。

表7  行为绝望实验中小鼠的不动时间(x±s,n=10)

与空白对照组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：与空白对照组比较，京尼平酪氨酸衍生物中剂量和高剂量能显著减少小鼠强迫游泳和悬尾实验的不动时间(P<0.05或P<0.01)，高剂量作用效果与阳性药氟西汀效果相当。

试验例8小鼠开放场实验

8.1实验材料

健康ICR小鼠，雄性，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2009-0003。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，适应性喂养5-7天后进行实验，每只动物仅使用一次。

阳性对照药物：盐酸氟西汀胶囊（百优解），礼来苏州制药有限公司，批号：9902A。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。

实验仪器：Digibehave双画面动物行为视频分析系统2.1版(上海吉量软件科技有限公司)；50mL刻度离心管(Corning公司)；动物灌胃器(北京吉安得尔科技有限公司)；开场行为观察箱等。

所有实验均于上午9时至下午3时之间进行。

8.2实验方法

将ICR小鼠随机分成5组，每组8只，即空白对照组、阳性药对照组（盐酸氟西汀，15mg/kg）、京尼平酪氨酸衍生物高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）。各组均按0.5mL/20g体重灌胃给药，空白对照组给予等量的生理盐水。于给药1h后将各组小鼠分别置于50×50×40cm敞口箱子(内壁为黑色，底部用白线平均分成25格)中央，使用动物行为视频分析系统记录4min内小鼠的自主活动行为，分析后3min内小鼠穿越横格数量和直立的次数，其中，穿越横格以至少3爪跨过边界；直立次数以两前爪离开地面。

8.3实验结果与分析

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。开场实验结果见表8。

表8小鼠开场实验中穿越横格数和直立次数(x±s,n=10)

实验结果表明，开场实验中各给药组与空白对照组比较，小鼠穿越横格数和直立次数都没有显著地差异，说明氟西汀和京尼平酪氨酸衍生物对于小鼠不动时间的减少并不是由于起中枢神经系统的兴奋作用所致。

试验例9小鼠利血平拮抗实验

9.1实验材料

健康ICR小鼠，雄性，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2009-0003。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，适应性喂养5-7天后进行实验，每只动物仅使用一次。

阳性对照药物：盐酸氟西汀胶囊（百优解），礼来苏州制药有限公司，批号：9902A。

利血平注射液(1mg/mL)：广东邦民制药有限公司。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。

实验仪器：数字式电子体温计(山东东阿阿胶阿华医疗器械有限公司)；多道电子计时器等。

所有实验均于上午9时至下午3时之间进行。

9.2实验方法

将60只ICR小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、利血平模型组、阳性药对照组(盐酸氟西汀，15mg/kg)和京尼平酪氨酸衍生物高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）。空白对照组、利血平模型组均给予等量生理盐水，其余各组均按0.5mL/20g体重灌胃给药。

各组小鼠灌胃给药1h后，除空白对照组外，利血平模型组和各给药组立即腹腔注射2.0mg/kg利血平，空白对照组腹腔注射等量生理盐水。注射利血平1h后观察小鼠眼睑状态，将小鼠置于和测试者水平视线高度一致的平面上，以眼睑状态为标准进行评分，即眼睑全部睁开：0分；四分之三睁开：1分；一半睁开：2分；四分之一睁开：3分；不能睁开：4分。注射利血平2h后，测定小鼠肛温(将数字式电子体温计探头插入小鼠肛门内约1.5cm处)。

9.3实验结果与分析

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。小鼠利血平拮抗实验结果如表9所示。

表9  小鼠利血平拮抗实验结果(x±s,n=10)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：

1、小鼠腹腔注射利血平1h后，利血平模型组与空白对照组比较，眼睑下垂评分明显增大，具有显著性差异(P<0.01)。

2、阳性药对照组，京尼平酪氨酸衍生物低、中、高剂量组与利血平模型组比较，眼睑下垂评分减小，具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，表明京尼平酪氨酸衍生物低、中、高剂量组均能显著对抗利血平所致小鼠眼睑下垂。

3、小鼠腹腔注射利血平2h后测定其肛温，利血平模型组的小鼠肛温降低，与空白对照组比较，具有显著性差异(P<0.01)；而阳性药对照组、京尼平酪氨酸衍生物低、中、高剂量组均能显著对抗利血平所致小鼠体温下降，与利血平模型组比较具有显著性差异(P<0.01)。

试验例10大鼠慢性温和不可预知性应激实验

10.1实验材料

健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，体重140-160g，购自天津山川红实验科技有限公司，动物合格证号SCXK(津)2009-0001。动物饲养于天津中医药大学实验动物中心，环境温度为24±1°C，湿度为55±5%，实验前适应性喂养一周。

阳性对照药物：盐酸氟西汀胶囊（百优解），礼来苏州制药有限公司，批号：9902A。

全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液。

10.2实验方法

10.2.1实验分组和给药

将大鼠分别置于50×50×40cm敞口箱子(内壁为黑色，底部用白线平均分成25格)中央，使用动物行为视频分析系统记录4min内大鼠的自主活动行为，分析后3min内大鼠穿越横格数量和直立的次数，选择行为比较接近的大鼠72只，随机分为6组，分别为正常空白对照组、模型组、阳性药对照组(盐酸氟西汀，10mg/kg)和京尼平酪氨酸衍生物高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg），每组12只，分笼饲养。实验前正常供给饲料及饮水，并且进行1%蔗糖水训练。除正常对照组外，各组均接受随机设计的应激，并且在刺激14天后按1.0mL/100g体重给大鼠口服氟西汀或京尼平酪氨酸衍生物，正常对照组和模型组则给予等量生理盐水，连续7天，给药同时继续进行相应刺激。在实验前和在实验的第7天、第14天、第21天分别称定大鼠体重；测定大鼠1h内1%蔗糖水消耗量。

在实验的第22天再次使用开场实验进行行为学测试，记录大鼠穿越横格数和直立次数。

10.2.2建立慢性应激大鼠抑郁模型

参照Willner等的方法并加以改进，建立慢性应激大鼠抑郁模型。正常对照组的大鼠正常供给饲料及饮水(1%蔗糖水消耗实验前禁水24h除外)，不接受任何刺激。其它各组接受21天慢性温和不可预知性应激，主要包括冰水游泳、足底电击、热刺激、夹尾、振荡、禁食和禁水等。每组动物每天随机给予一种刺激，同一种刺激累计使用不超过5次。每种应激的具体操作方法如下：

冰水游泳：将大鼠放入盛有4℃冷水的有机玻璃缸中，水深约15cm，以大鼠后足尖刚能触及缸底为宜，5min后将其捞出，并用毛巾擦干皮毛后归笼；

足底电击：将大鼠置于足底电击箱中，电压为36V，每隔15s电击一次，每次持续10s，共15次；

热刺激：将大鼠置于45℃恒温电热烘箱中，10min后取出归笼；

夹尾：将大鼠适当固定，露出尾巴，用止血钳夹住距尾根部1cm处(使大鼠发出哀鸣即可)，持续2min；

振荡：将大鼠置于水平振荡器中，振荡2min后停止；

禁食：停止供给饲料24h；

禁水：停止供给饮水24h。

10.2.3慢性应激大鼠体重变化

在实验前和在实验的第7天、第14天、第21天、第28天、第35天时分别称定每只大鼠体重，并且将实验后第35天的体重减去实验后第21天的体重，观察各组大鼠的体重变化及给药14天后体重的增加情况。

10.2.4慢性应激大鼠1%蔗糖水消耗量测定

在实验前和在实验的第7天、第14天、第21天时分别测定每只大鼠1%蔗糖水消耗量，并且将实验后第21天的糖水消耗量减去实验后第14天的糖水消耗量，观察各组大鼠糖水偏爱程度及给药7天后糖水消耗量的增加情况。

10.2.5行为学测试

在应激刺激结束后，也就是实验第22天对全部大鼠进行行为活动测试，将各组大鼠分别置于50×50×40cm敞口箱子(内壁为黑色，底部用白线平均分成25格)中央，使用动物行为视频分析系统记录5min内大鼠的自主活动行为，分析后4min内大鼠穿越横格(三爪以上跨入即可)和直立(两前肢离地面1cm即可)的次数。每次测试后及时清理动物排泄物。

10.3实验结果与分析

实验数据以平均值±标准偏差(x±s)表示，使用SPSS11.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法，以P<0.05和P<0.01为具有统计学意义。

10.3.1京尼平酪氨酸衍生物对慢性应激大鼠体重的影响。

慢性应激大鼠体重测定结果如表10所示。

表10慢性应激大鼠体重测定结果(x±s,n=12)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：实验前各组大鼠体重无显著性差异。实验的第7天、第14天及第21天后，空白对照组大鼠体重明显增加，与实验前比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而模型组接受应激刺激14天后体重增加缓慢，与实验前比较无显著性差异。在给药7天以后，京尼平酪氨酸衍生物三个剂量组，氟西汀组大鼠体重明显，与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，表明京尼平酪氨酸衍生物对由于慢性应激导致的大鼠体重增加速率下降具有显著的抵抗作用，说明京尼平酪氨酸衍生物具有抵抗由于抑郁引起的消化系统功能失常的药理活性。

10.3.2京尼平氨基酸衍生物对慢性应激大鼠1%蔗糖水消耗量的影响

慢性应激大鼠1%蔗糖水消耗量测定结果如表11所示。

表11慢性应激大鼠蔗糖水消耗测定结果(x±s,n=12)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：实验前各组大鼠糖水消耗没有显著性差异。实验第7天及第14天时空白对照组糖水消耗量逐渐增加，而模型组糖水消耗量逐渐减少，且与实验前比较均显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在给药7天后，大鼠糖水消耗量显著增加，且与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

10.3.3京尼平酪氨酸衍生物对应激大鼠开场行为的影响

慢性应激大鼠连续给药14天后，开场行为测定结果如表12所示。

表12慢性应激大鼠开场行为测定结果(x±s,n=12)

与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

测试结果表明：

1、模型组大鼠经过21天的慢性应激刺激后穿越横格数和直立次数明显减少，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。给药7天后，京尼平酪氨酸衍生物各剂量组及氟西汀组大鼠穿越横格数和直立次数显著增加，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。京尼平酪氨酸衍生物对由于慢性应激导致的大鼠水平穿越格数和垂直运动直立次数下降具有显著的抵抗作用，说明京尼平酪氨酸衍生物具有抵抗由于抑郁引起的自主活动减少的药理活性。

2、从开场行为活动、体重和对糖水消耗量试验结果显示，京尼平酪氨酸衍生物能有效改善慢性温和不可预知性应激抑郁模型大鼠的抑郁行为，对抑郁症具有治疗作用，作用效果与阳性对照药盐酸氟西汀相当。

以上结果说明，本发明中涉及的京尼平氨基酸衍生物作为一种NF-κB抑制剂，能够抑制NF-κB亚基P50和P65的核转移和IκB-α蛋白的降解和磷酸化，还能够抑制IKK-α，IKK-β蛋白的表达。对炎性因子基因、蛋白的表达有显著地抑制作用。体内抗炎研究中京尼平氨基酸衍生物能够显著降低角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀程度，与模型组比较，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；同时能够抑制腹腔注射LPS后炎性因子(TNF-α,IL-6)的产生，与模型组比较，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。京尼平氨基酸衍生物能显著减少小鼠强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，并且不会使小鼠自主行为活动明显增加；同时能够拮抗利血平诱导的小鼠眼睑下垂和体温降低；在大鼠慢性温和不可预知性应激实验中给予京尼平氨基酸衍生物7天后能够显著增加大鼠体重和糖水消耗量，以及开场实验中大鼠穿越横格数和直立次数，使大鼠自主活动性明显增强，表明京尼平氨基酸衍生物对上述三种抑郁症动物模型是有效的。

因此，京尼平氨基酸衍生物作为一种良好的NF-κB抑制剂，可以用来治疗NF-κB因子异常激活引起动物和人的恶性肿瘤，自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等），心脑血管疾病，急性、慢性炎症，神经系统疾病（如阿尔茨海默病，抑郁症等）。

下列实施例均能实现上述试验例的效果：

实施例1  制备京尼平氨基酸衍生物

参照Fujikama等的方法制备京尼平氨基酸衍生物（Fujikama S,Fukui Y,Koga K,Kumada J.(1987)Brilliant skyblue pigment formation from Gardenia fruits.Journal of Fermentation Technology65:419-424）。

将8.8mmol的京尼平和8.8mmol的氨基酸依次加入到400mL的PBS(100mmol，pH7.0)溶液中，80℃搅拌4h，接着将得到的京尼平氨基酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，进行分离，并收集吸光度值为590nm的洗脱液，将收集到的洗脱液冷冻干燥机干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8℃冷藏保存，待用。

京尼平与含有伯胺基的氨基酸均能反应生成本发明所述的京尼平氨基酸衍生物，例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等。

实施例2  制备京尼平甘氨酸衍生物

将8.8mmol的京尼平和8.8mmol的甘氨酸依次加入到400mL的PBS(100mmol，pH7.0)溶液中，80℃搅拌4h，接着将得到的京尼平甘氨酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，以乙酸乙酯、甲醇、水的混合溶液为洗脱剂进行洗脱分离，其中洗脱剂中乙酸乙酯-甲醇-水的体积之比为：8：3：1，收集洗脱液，并进行冷冻干燥机干燥，即得京尼平甘氨酸衍生物成品。得到的京尼平甘氨酸衍生物于2-8℃冷藏密封保存，待用。

实施例3  制备京尼平酪氨酸衍生物

将8.8mmol的京尼平和8.8mmol的酪氨酸依次加入到400mL的PBS(100mmol，pH7.0)溶液中，80℃搅拌4h，接着将得到的京尼平酪氨酸衍生物过HP-20大孔树脂柱，以乙酸乙酯、甲醇、水的混合溶液为洗脱剂进行洗脱分离，其中洗脱剂中乙酸乙酯-甲醇-水的体积之比为：8：3：1，收集洗脱液，并进行冷冻干燥机干燥，即得京尼平酪氨酸衍生物成品。得到的京尼平酪氨酸衍生物于2-8℃冷藏密封保存，待用。

实施例4  胶囊剂的制备

京尼平丙氨酸衍生物100g，药用淀粉900g混匀，直接装入明胶硬胶囊中，每粒0.2g。

实施例5  片剂的制备

京尼平甘氨酸衍生物100g，药用淀粉900g混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，60℃以下干燥，整粒，加入适量的硬脂酸镁混匀，送入压片机内进行压片，每片0.2g。

实施例6  颗粒剂的制备

将京尼平酪氨酸衍生物10g，药用淀粉1000g，糖粉100g混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥，分装即得，每袋5g。

实施例7  注射剂的制备

取京尼平谷氨酸衍生物10g，加入氯化钠90g，加入注射用水，搅拌使其溶解，加注射用水至1000mL，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装灌封，灭菌即可。

Claims (7)

1.京尼平氨基酸衍生物在制备用于预防、缓解和/或治疗由核因子NF-κB活化引起的病理性病症的药物或保健品中的用途，其中，所述病理性病症为神经系统疾病，其中，所述的京尼平氨基酸衍生物即栀子蓝色素，为京尼平与含有伯胺基的氨基酸的衍生物；所述神经系统疾病为抑郁症。

2.如权利要求1所述的用途，其特征是所述的含有伯胺基的氨基酸选择丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷胺酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸中的一种或多种。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物由京尼平氨基酸衍生物和药学上可接受的载体组成。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物是通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、尿道、阴道、静脉途径给药。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征是所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。

7.如权利要求1或2所述的应用，其特征是所述京尼平氨基酸衍生物纯度超过90％。