CN102399221B - 双吲哚喹唑啉类生物碱在制备抗肿瘤、抗真菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双吲哚喹唑啉类生物碱及其衍生物，结构如右式，由二个不同的吲哚喹唑啉类生物碱通过C-C连接构成的双聚体类化合物。本发明还涉及这类化合物的制备方法及其抗肿瘤细胞活性和抗真菌活性，可用于医药领域。

Description

双吲哚喹唑啉类生物碱在制备抗肿瘤、抗真菌药物中的应用

一、技术领域：

本发明涉及一种双吲哚喹唑啉类生物碱，具有以下结构，由二个不同的吲哚喹唑啉类生物碱通过C-C连接构成的双聚体类化合物及制备方法。

本发明属于药物，涉及这类具有与天然的和合成的双吲哚喹唑啉类生物碱衍生物及其药物组合，其在抗肿瘤、抗真菌活性药学中的用途。

二、技术背景：

芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Evodia)全世界约有150种，分布于亚洲、非洲东部和大洋洲。我国有20种5变种，其中多数为民间常用中草药，早在《神农本草经》中就有吴茱萸的记载，应用历史悠久，临床效果显著，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻、疏肝解郁、行气止痛之功效，颇受人们的关注。吴茱萸属的主要化学成分：生物碱类、苦味素类、黄酮类、苯并吡喃酮类、降倍半萜类、挥发油等。主要药理活性有扩张血管、降压、强心、止泻、收缩子宫、杀虫、抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗胆碱酯酶、抗遗忘症和抗肿瘤作用。

分别对生吴茱萸和甘草制吴茱萸进行了系统的研究，首先应用HPLC技术分别进行了主要成分的含量测定及组分的确定，其次分别进行了化学成分的提取分离及结构鉴定，从生吴茱萸和甘草制吴茱萸中分离得到双吴茱萸碱。通过斑马鱼法等抗肿瘤和抗真菌活性试验，显示一定的抗癌和抑制我国常见致病真菌的作用。

目前临床应用的抗真菌药多数是合成的，不同程度地存在毒性或刺激性较大的缺点，因此，人们将目光转向了天然产物。

三、发明内容：

本发明公开了一类具有下列母核的双吲哚喹唑啉生物碱类化合物，其通式如下：

其中：R₁为H或8个碳以内的取代基，R₂为H或8个碳以内的取代基。而所述取代基包括8个碳以内或含N、O、S杂原子的直链、支链和环状。

优选的结构式：

化合物1的分子式为：C₃₈H₃₀N₆O₂，分子量：602。

命名为：双吴茱萸碱(dievodiamine)。

上述生物碱的制备方法，其特征在于以芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Evodia)植物吴茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth)、石虎(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benthvar.officinalis(Dode)Huang)及疏毛吴茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benthvar.bodinieri(Dode)Huang)为原料，经石油醚脱脂或没有经石油醚脱脂的原料；用乙醇或甲醇提取；减压浓缩；加水溶解至混悬液，依次用石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，或加酸水捏溶至混悬液，酸水用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取后的酸水加氨水碱化，用氯仿或乙酸乙酯萃取，得总生物碱较集中的浸膏，最后碱水调至中性用正丁醇萃取。氯仿或乙酸乙酯萃取部位经反复通过硅胶或球形硅胶、氧化铝常压(LC)、低压(LPLC)和中压柱层析(MPLC)；SephadexLH-20(Sep.)凝胶柱层析；大孔树脂D101、AB-8或HP-20分段柱层析；反相材料ODS中的一种或几种反复柱层析和重结晶等手段分离纯化得到化合物I。

本发明的化合物及其衍生物与医学上可接受的药用辅料组成药物制剂用于治疗癌症。可制备的剂型有：片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液和注射剂。

四、附图说明：

以下图可作为附件材料上报。

图1、化合物I的化学结构图，即双吴茱萸碱的化学结构图。

图2、化合物I的IR谱，即双吴茱萸碱的红外图谱。

图3、化合物I的¹H-NMR谱，即双吴茱萸碱的氢谱。

图4、化合物I的¹³C-NMR谱，即双吴茱萸碱的碳谱。

图5、化合物I的DEPT谱，即双吴茱萸碱的DEPT谱。

图6、化合物I的ESI-MS谱，即双吴茱萸碱的质谱。

图7、化合物I的HR-ESI-MS谱，即双吴茱萸碱的高分辨质谱。

图8、化合物I的¹H-¹HCOSY的谱，即双吴茱萸碱的¹H-¹HCOSY谱。

图9、化合物I的HMQC谱，即双吴茱萸碱的HSQC谱。

图10、化合物I的HMBC谱，即双吴茱萸碱的HMBC谱。

图11、化合物I的NOESY谱，即双吴茱萸碱的NOESY谱。

五、具体实施方式：

结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1.从生吴茱萸中分离和鉴定化合物I

生吴茱萸4Kg，先取出200g用挥发油提取器提取吴茱萸挥发油约2ml，备用做GC-MS。药渣与剩下生吴茱萸合并用80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压浓缩得稠浸膏约800g，加水溶解至混悬液，依次用石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别浓缩成浸膏得石油醚部位14g、氯仿部位209g、乙酸乙酯部位26g、正丁醇部位210g、水部位316g。氯仿部位反复通过硅胶常压(LC)、低压(LPLC)和中压柱层析(MPLC)、SephadexLH-20(Sep.)凝胶柱层析、反相材料ODS柱层析和重结晶等手段分离纯化化合物I(26.7mg)。

化合物I：白色针晶(氯仿-甲醇)，m.p.259-260℃，易溶于氯仿、乙酸乙酯。改良碘化铋钾试剂显棕红色，提示该化合物可能是生物碱。212，283，363示为吲哚类生物碱的特征吸收峰，红外光谱显示有NH(3427cm^-1)、羰基(1629cm^-1)、双键(1517cm^-1)、苯环(1600cm^-1，1490cm^-1)，ESI-MS显示该化合物的准分子离子峰为625[M+Na]⁺(100)，表明其分子量为602，含偶数个N。HR-ESI-MS测得化合物的准分子离子峰为603.2509(calc.for[C₃₈H₃₀N₆O₂+H]⁺603.2508)，推断化合物的分子式为C₃₈H₃₀N₆O₂，不饱和度为27。

DEPT谱显示18个CH，2个CH₂，2个CH₃，碳谱显示38个碳信号，其中δ_C167.6、δ_C163.0是羰基信号，δ_C155.3-111.6之间有31个芳香碳信号，δ_C76.6是与2个N相连的季碳信号，δ_C37.1、δ_C39.1是氮甲基的碳信号，δ_C20.6、δ_C38.9是亚甲基的碳信号。

氢谱显示30个质子信号，其中δ_H11.92(1H，s)，δ_H11.34(1H，s)是2个氮氢质子信号，δ_H8.15-7.02之间有16个芳氢质子信号，δ_H6.54(1H，d，J＝16.0Hz)和δ_H6.31(1H，d，J＝16.0Hz)是2个反式烯质子信号，δ_H3.26(3H，s)和δ_H2.47(3H，s)是2个氮甲基氢信号，δ_H3.08(1H，dt，J＝12.6，3.9，3.7Hz)和δ_H4.86(1H，dd，J＝12.6，3.9，3.7Hz)分别是5α-H和5β-H质子信号，δ_H2.90(1H，dd，J＝12.9，5.1，4.5Hz)和δ_H2.76(1H，dt，J＝12.9，5.1，4.5Hz)分别是6α-H和6β-H质子信号。根据UV、IR、¹HNMR、¹³CNMR的特征，结合吴茱萸的生源特点推测该化合物具有2个A、B、C、D、E五环的骨架结构。

在¹H-¹HCOSY相关谱中可以找到8组有相关关系的质子即δ_H8.16(1H，d，J＝6.6Hz)，δ_H7.60(1H，t，J＝7.8，6.6Hz)，δ_H7.88(1H，t，J＝7.8，8.4Hz)，δ_H7.46(1H，d，J＝8.4Hz)；δ_H7.74(1H，d，J＝7.5Hz)，δ_H7.01(1H，t，J＝7.2，7.5Hz)，δ_H7.28(1H，t，J＝8.1，7.2Hz)，δ_H7.07(1H，d，J＝8.1Hz)；δ_H7.64(1H，d，J＝8.1Hz)，δ_H7.11(1H，t，J＝8.1，7.2Hz)，δ_H7.21(1H，t，J＝7.2，8.1Hz)，δ_H7.40(1H，d，J＝8.1Hz)；δ_H7.51(1H，d，J＝7.8，Hz)，δ_H7.05(1H，t，J＝7.8，7.5Hz)，δ_H7.13(1H，t，J＝7.5，8.1Hz)，δ_H7.33(1H，d，J＝8.1Hz)；δ_H6.54(1H，d，J＝16.0Hz)，δ_H6.31(1H，d，J＝16.0Hz)；δ_H4.86(1H，dd，J＝12.6，3.9，3.7Hz)，δ_H3.08(1H，dt，J＝12.6，3.9，3.7Hz)；δ_H2.76(1H，dt，J＝12.9，5.1，4.5Hz)，δ_H2.90(1H，dd，J＝12.9，5.1，4.5Hz)及δ_H3.08与δ_H2.76有相关关系。

在HMBC谱中，δ_H11.34与δ_C111.6、δ_C125.9、δ_C131.0、δ_C137.2；δ_H7.51与δ_C111.6、δ_C122.5、δ_C125.9、δ_C137.2；δ_H7.33与δ_C119.3、δ_C125.9；δ_H7.74与δ_C133.5、δ_C149.5、δ_C163.0；δ_H7.07与δ_C123.6、δ_C149.5、δ_C163.0；δ_H4.86与δ_C20.6、δ_C76.6、δ_C111.6、δ_C163.0；δH₂.76与δ_C111.6；δ_H2.47与δ_C76.6、δ_C149.5分别有远程相关信号。

δ_H11.92与δ_C113.2、δ_C125.0、δ_C129.2、δ_C136.7；δ_H8.16与δ_C134.4、δ_C141.8、δ_C167.6；δ_H7.64与δ_C113.2、δ_C124.2、δ_C136.7；δ_H7.46与δ_C120.3、δ_C126.8、δ_C167.6；δ_H7.40与δ_C121.0、δ_C125.0；δ_H3.26与δ_C141.8、δ_C155.3；δ_H6.54与δ_C76.6、113.2、δ_C125.0、δ_C129.2；δ_H6.31与δ_C76.6、δ_C113.2分别有远程相关信号。

δ_H6.54和δ_H6.31分别与δ_C76.6有远程相关信号，可以推出结构第一部分中的3位δ_C76.6与结构第二部分中的5’位δ_C128.8相连接。

在NOESY谱中，δ_H11.92与δ_H7.40、δ_H3.26；δ_H3.26与δ_H7.46；δ_H11.34与δ_H6.31、δ_H7.33；δ_H6.31与δ_H2.47、δ_H3.08、δ_H7.07、δ_H11.92；δ_H6.54与δ_H3.08、δ_H7.64分别有空间相关关系，δ_H6.31、δ_H6.54这两个烯质子分别与5位δ_H3.08的ax氢有空间相关关系，而与5位另一个δ_H4.86的eq氢没有空间相关关系，说明结构第一部分的3位δ_C76.6与结构第二部分的5’位δ_C128.8连接方式与δ_H3.08的ax氢相同，在同一侧。

通过¹HNMR、¹³CNMR、HMBC、HSQC、¹H-¹HCOSY、NOESY谱的综合解析，对化合物1的碳氢信号进行了全归属见Tab.1。经文献检索化合物1为新化合物，定名为双吴茱萸碱(dievodiamine)。

Tab1TheNMRdataand¹³C-¹Hcorrelationof1(inDMSO-d₆，at300MHz)

实施例2、从甘草制吴茱萸中分离和鉴定化合物I

甘制吴茱萸9.5Kg，经石油醚冷浸7天，得石油醚浸膏67g；脱脂后的药渣，用80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压浓缩得稠浸膏约1.5Kg；加2％的酸水捏溶至混悬液，酸水用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯浸膏263g；萃取后的酸水加氨水碱化至pH9-10，用氯仿萃取，得总生物碱较集中的氯仿浸膏126g；最后碱水调至中性用正丁醇萃取，得正丁醇浸膏293g。氯仿浸膏反复通过硅胶常压(LC)、低压(LPLC)和中压柱层析(MPLC)、SephadexLH-20(Sep.)凝胶柱层析、反相材料ODS柱层析和重结晶等手段分离纯化化合物I(32.9mg)。

实施例3、化合物1的斑马鱼法抗肿瘤活性评价实验

1.研究材料：

1.1斑马鱼胚胎

1.2筛选化合物

羟基吴茱萸碱、双吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸酰胺I、吴茱萸碱

2.实验方法

2.1斑马鱼模型

2.1.1模型依据

肿瘤的发生是一贯正常的细胞转化成癌细胞的复杂多环节的过程，肿瘤的大小超过0.2～2.0(大约10⁵～10⁶个细胞)时，开始建立自身的血液供应系统，即新的血管生成。血管生成(angiogenesis)是一个由在已存在的血管系统中伸出的侧芽所滋生出的新血管的过程，主要特征是衬附在新生血管内侧的内皮细胞(endothelialcell，EC)增殖。这种内皮细胞的增殖速度极其迅速，远远超过其他正常组织，而这种独特表型的内皮细胞易受药物的影响。血管生成为肿瘤的快速增长提供了物质基础。心血管生成为肿瘤的生长提供了旁分泌和持续刺激，因此，抑制新生血管生成成为肿瘤药物筛选的一个新靶点，而斑马鱼模型就是最近新采用的一个体内模型，用于筛选抗血管生成剂。

斑马鱼的胚胎是体外发育，胚胎是透明的，胚胎血管生成周期短，大量鱼胚胎养殖操作简单。鱼胚胎可在非血管系统条件下成活一周，血液生成受阻不会使生成鱼卵立刻死亡。最重要的一点是斑马鱼和哺乳动物血管生成系统过程的分子机理和信号传递具有相当的保留性。这样使得利用该法筛选结果做出的预测对哺乳动物的效用。所以该模型被公认为简单安全相对廉价的模型，是对研究抗血管生成药物的筛选领域一个很好的补充。

2.1.2效果评价

血管生成抑制率＝100％-血管生成％

2.1.3结果与讨论

本次共筛选6个化合物。化合物I在浓度5μM时血管生成抑制率39％。

实施例4、化合物I的体外抗癌活性筛选

药物筛选是整个抗肿瘤药物研究过程中一个非常重要的环节。利用实验动物移植瘤寻找具有抗肿瘤作用的化合物曾是抗肿瘤药物研究的主要方法。随着组织培养方法的发展和普及，利用体外培养的癌细胞寻找新抗肿瘤药物的研究已逐渐成为最重要的初筛手段。

美国国立肿瘤研究所(NCI)自80年代起致力于寻找一种针对某种肿瘤病(disease-oriented)而不是以肿瘤总体为对象(tumororiented)的筛选方法。该法以60种人体癌细胞系作为筛选模型，组成一个“板块”(panel)。此板块按肿瘤病种类再分成白血病，黑色素瘤，肺癌，结肠癌，肾癌，卵巢癌及中枢神经系统癌7个亚板块(subpanel)，每个亚板块由6～13种肿瘤细胞系组成。筛选时采用96孔平板作微培养，用MTT，SRB等方法观察细胞的杀伤或生长抑制。如果某种受试药物的细胞毒作用具有亚板块特异性，则有可能发现具有选择性的抗肿瘤药物。

为了实施规模性筛选，美国NCI采用了半自动的快速比色测定方法。并将最初的利用MTT还原反应测定活细胞数目的方法，换以更易操作的磺酰罗丹明B(SRB)蛋白质染色法。本试验所用的显色剂为四唑盐，是一种能接受氢原子的染料，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称为MTT，是一种淡黄色物质，。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(NADP)能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞、红细胞、培养液无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶标仪在570nm波长处测定其OD值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数呈直线相关。此法与集落形成法、生长曲线法等测定结果有良好相关性。通过MTT法初步筛选可获知具有影响肿瘤细胞增殖的活性化合物。

1实验方法

1.1操作步骤

接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度稀释至4×10⁴个/ml。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔。

培养：将培养板转入恒温CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

加药：将受试药物作6个稀释度，浓度依次为50、60、70、80、90、100μl/ml。96孔板换液，对于悬浮生长的细胞，需离心(4℃，500～1000rpm，5min)。加入受试药物，20μl/孔，每个浓度加三个孔，再培养48小时。

染色：将MTT加入96孔板中，20μl/孔，置于培养箱中反应4小时。小心吸弃孔内上清液，晾干，加入DMSO，150μl/孔，悬浮细胞必须经离心(4℃，2500～3000rpm，20min)吸出上清再加DMSO。置平板摇床上振摇10分钟。

比色：用酶标仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。

1.2注意事项

细胞悬液需充分混匀，以避免各孔之间细胞分布不均；加细胞的过程应控制在4小时以内，避免细胞活性受损。

各板需单独设定空白对照及阴性对照。

MTT配制及保存过程中均需避光，且在两周内使用有效。

悬浮细胞用MTT法时必须经离心后才能吸出上清再加DMSO。

1.3数据处理

细胞抑制率的计算：

2实验结果见表5

表1药物对体外培养肿瘤细胞的影响

3阳性药的肿瘤抑制率：

实验所选阳性药为长春新碱和5-FU，抑瘤率分别为87.9％和67.9％，IC₅₀(μg/ml)分别为：11.35，35.44。

实施例5、化合物I的体外抗真菌活性筛选

1、实验方法

参照试管稀释法进行试验。

2、结果

表2药物对体外真菌的影响

实施例6

片剂：取实施例1-2制得的双吴茱萸碱1g与可压淀粉0.5g，糊精1g混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

实施例7

胶囊：取双吴茱萸碱1g与可压淀粉0.7g，糊精1g，糖粉1g混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，加入适量硬脂酸镁混合，装入硬胶囊中。

实施例8

冻干粉针剂：取双吴茱萸碱1g，羟丙基-p-环糊精0.5g，加注射用水750mL，搅成糊状，再加70℃～85℃的注射用水750mL，溶解时温度控制在70℃～85℃，加甘露醇1.5g溶解，再用1moL/L盐酸溶液调pH值至5.6，加入针用炭后室温搅拌，过滤脱炭，精滤。滤液按每只10mL进行分装，采用速冻法干燥，将制品取出，进行封口，即得到性状为白色疏松块状物或粉末，即得粉针剂。

Claims (3)

1.一种双吲哚喹唑啉生物碱在制备治疗癌症和真菌感染药物方面的应用，其中所述的双吲哚喹唑啉生物碱的化学结构式为：

2.权利要求1所述的双吲哚喹唑啉生物碱与医学上可接受的药用辅料组成的药物制剂。

3.权利要求2所述的药物制剂，其特征在于制剂剂型为片剂、胶囊剂、注射剂。