CN107986951A - 新型拓扑异构酶i抑制剂及其药物组合物与其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从蓝桉(Eucalyptus globulus)果实中分离得到的甲酰间苯三酚杂萜类化合物，以其为活性成分的药物组合物，及其制备方法，其在制备治疗肿瘤药物中的应用，以及其在制备功能性保健品中的应用。本发明的方法原料易得，方法简单，易操作，所得化合物通过生物实验证明本发明的化合物具有较好的抑制肿瘤细胞生长活性；而且化合物1,2,3和5具有类似于喜树碱的DNA抑制拓扑酶Ⅰ(TOP1)活性，化合物1和4具有较好的促进癌细胞凋亡的活性。
Description
技术领域：
本发明属于药物领域，具体涉及从蓝桉(Eucalyptus globulus)中分离得到的甲酰间苯三酚杂萜及其药物组合物，它们在制备治疗癌症药物中的应用，以及它们在制备功能性食品中的应用。
背景技术：
癌症是一个严重威胁人类健康和生命的疾病。近年来，癌症的发病率和死亡率都呈现一个急剧增加的趋势。据世界卫生组织报告，到2030年，全球预计患有癌症人数将新增2100万，每年癌症死亡人数将达到1320万(Wong A.S.T.,et al.Nat.Prod.Res.2015,32:256–272)。当前，临床上使用的化疗药物多为细胞毒类成分，对各类癌细胞具有明显的选择性；在消除癌细胞的过程中，该类成分也会对正常的细胞和组织产生不同程度损伤，从而极大影响到患者的生命质量和治疗效果。有研究表明，人的DNA抑制拓扑酶Ⅰ(TOP1)可在细胞的主要活动如DNA复制和基因转录等中调节DNA的机械性质(Pommier Y.,etal.Chem.Biol.2010,17:421-433)。近年来，拓扑异构酶I抑制剂被证明可以阻止癌细胞中共价复合体的形成从而起到较好的抗癌效果。DNA拓扑异构酶I抑制剂是21世纪一种新型的且具有重要成药前景的抗肿瘤药物。
天然产物因具有结构多样和骨架多变的特点，是治疗各类疾病药物及先导分子的重要来源。桃金娘科桉属全世界约有700种植物，我国大陆有100多个种及变种。蓝桉，作为一个民族药，主要用来预防和治疗流感，痢疾，湿疹，烫伤和风湿等疾病(Yang S.P.,etal.J.Med.Chem.2012,55:8183–818)。本发明涉及六个甲酰间苯三酚杂萜类化合物从蓝桉果实中分离得到的。目前，现有技术中没有关于这六个化合物作为拓扑异构酶I抑制剂及其药物组合物，它们在制备治疗癌症及由其引起的并发症的药物中的应用，以及在制备功能性食品中的应用的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供从蓝桉(Eucalyptus globulus)果实中分离得到的甲酰间苯三酚杂萜类化合物为药物活性成分的药物组合物，其制备方法，它们在癌症及由其引起的并发症的药物中的应用。本发明从蓝桉果实中分离得到的甲酰间苯三酚杂萜类化合物，经过多次药理试验研究表明，该类化合物为拓朴异构酶I抑制剂，具有显著的抑制癌细胞增长的活性；且化合物1和4具有较强的促进癌细胞凋亡的活性。
为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下的技术方案：
如下结构式所示的蓝桉中的甲酰间苯三酚杂萜类化合物蓝桉果实杂萜A
含有治疗有效量的如下结构式所示的化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusoneC(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)的任一种或两种的混合物和药学上可接受的载体的药物组合物，
本发明同时提供了化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备抗肿瘤的药物及由其引起的并发症的药物中的应用。
如所述的应用，其中所述的癌症为结肠癌、急性淋巴白血病、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌。
同时提供了化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备抑制肿瘤细胞生长剂中的应用。
和，化合物蓝桉果实杂萜A(1)，macrocarpal A(4)在制备促进癌细胞凋亡剂中的应用。
以及，化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)和macrocarpal B(5)在制备抑制拓扑酶活性剂中的应用。
本发明此外还提供了化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备功能食品中的应用。
本发明另外还提供了化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)的制备方法，其特征在于该方法包括采用石油醚提取、硅胶分离、凝胶除杂、反相硅胶Rp-18分离及半制备HPLC纯化后得所述化合物。
更具体的方法是：取蓝桉果实，粉碎后，用乙酸乙酯冷浸提取3次，每次48小时，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏。浸膏分用硅胶80～100目拌样，经硅胶(200～300目)柱层析，洗脱剂用石油醚–丙酮(30:1→1:1，v/v)梯度洗脱，TLC检测合并得到九个流份Fr.1–Fr.9；Fr.4、Fr.5和Fr.9经过结晶和重结晶，Rp-18反相柱层析MeCN-H2O-TFA，Saphadex LH-20和半制备HPLC等方法得到六个间苯三酚杂萜：蓝桉果实杂萜A，eucalrobusone C，eucarobustol C，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A。
本发明选择蓝桉果实为材料，进行提取、分离、结构鉴定和活性筛选等系统研究工作，从中得到六个甲酰间苯三酚杂萜，其中有一个新的化合物：蓝桉果实杂萜A(GlobulusalA)。
本发明选择所有化合物进行了体外对五株人癌细胞(HCT116，CCRF-CEM，DU145，Huh7和A549)细胞毒活性测试实验，发现所有化合物均对所有细胞株具有较好的抑制生长活性，如化合物2，3和6对A549细胞株的IC50值分别达到了5.2，5.3和4.9μM，化合物2和6对HCT116细胞株的IC50值为9.6μM，化合物6对DU145细胞株的IC50值为8.9μΜ,以上活性均强于阳性对照依托泊苷(VP-16)。进一步的活性测试实验表明，化合物1，2，3和5具有类似于喜树碱的抑制拓扑酶活性，化合物1和4具有较强的促进癌细胞凋亡的活性。
本发明的化合物和可用于制备治疗癌症及由其引起的并发症，以及在制备功能性食品中应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。所有化合物为有效成分组成的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行癌症及由其引起的并发症的治疗。
附图说明：
图1为本发明化合物的结构示意图；
图2为DNA松散实验结果；
图3为DNA缺口实验(A)，凝胶阻滞实验(B)和DNA嵌入实验结果；
图4为细胞凋亡实验结果；
图5为免疫荧光实验结果。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。
下述试验中，EIMS和HRESIMS由Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF质谱仪测定，其中EI-MS在70eV下测定；1H,13C NMR和2D NMR谱在Bruker Avance III-600核磁共振仪上测定；柱层析用硅胶G(200–300目)及薄层层析均为青岛海洋华工工厂产品。薄层层析通过10％三氯化铁-乙醇溶液观察其斑点。Saphadex LH-20为GE Healthcare公司产品。反相材料Rp-18及Rp-18薄层板为Merck公司产品。
实施例1：
蓝桉果实杂萜A(Globulusal A)、Macrocarpal A和Macrocarpal B三个化合物的制备：
取蓝桉果实(6.0kg)，粉碎后，用乙酸乙酯冷浸提取3次，每次48小时，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏(550g)。浸膏分用硅胶80～100目拌样，经硅胶(200～300目)柱层析，洗脱剂用石油醚–丙酮(30:1→1:1，v/v)梯度洗脱，TLC检测合并得到九个组份Fr.1–Fr.9。Fr.9(40g)经Rp-18反相柱层析(MeCN–H2O，50:50→100:0v/v)得到6个部分(Fr.9a–Fr.9f)。Fr.9d(1.8g)经Sephadex LH-20色谱(CHCl3–MeOH,1:1v/v)后经HPLC反相半制备(MeCN–H2O，含0.01％TFA，80:20→95:5v/v)进一步纯化得到桉果实杂萜A(1，9.0mg)。化合物Macrocarpal A(4，3.7g)和Macrocarpal B(5,62mg)分别从Fr.9e(6.8g)和Fr.9f(320mg)经结晶和重结晶的方法得到。
实施例2：
Eucalyptin A一个化合物的制备：
取蓝桉果实(6.0kg)，粉碎后，用乙酸乙酯冷浸提取3次，每次48小时，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏(550g)。浸膏分用硅胶80～100目拌样，经硅胶(200～300目)柱层析，洗脱剂用石油醚–丙酮(30:1→1:1，v/v)梯度洗脱，TLC检测合并得到九个组份Fr.1–Fr.9。Fr.5(20g)经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(CHCl3-MeOH,3:2v/v)除脂肪酸后经Rp-18反相柱层析(MeCN–H2O，60:40→100:0v/v)得到6个部分(Fr.5a–Fr.5f)。Fr.5e(50mg)经HPLC反相半制备(MeCN–H2O，H2O含0.01％TFA，75:25→95:5v/v)进一步纯化得到Eucalyptin A(6，13mg)。
实施例3：
Eucalrobusone C和Eucarobustol C两个化合物的制备：
取蓝桉果实(6.0kg)，粉碎后，用乙酸乙酯冷浸提取3次，每次48小时，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏(550g)。浸膏分用硅胶80～100目拌样，经硅胶(200～300目)柱层析，洗脱剂用石油醚–丙酮(30:1→1:1，v/v)梯度洗脱，TLC检测合并得到九个组份Fr.1–Fr.9。Fr.4(30g)经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(CHCl3-MeOH,3:2v/v)除脂肪酸后经Rp-18反相柱层析(MeCN–H2O，60:40→100:0v/v)得到5个部分(Fr.4a–Fr.4e)。Fr.4d(128mg)经HPLC反相半制备(MeCN–H2O，H2O含0.01％TFA，90:10→99:1v/v)进一步纯化得到Eucalrobusone C(2，8.2mg)和Eucarobustol C(3，6.5mg)。
蓝桉果实杂萜A(1)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；(c0.14,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)218(4.23)，298(4.39)，379(3.82)nm；ECD(MeOH)235(Δε–14.32)，305(Δε+12.64)nm nm；IR(KBr)νmax 3433，2931，1716，1628，1470，1023cm–1；1H(600MHz,CDCl3)和13C(150MHz,CDCl3)NMR数据见表一；(–)-HREIMS m/z 485.2558[M–H]–(计算值C28H37O7，485.2545)。
表1、蓝桉果实杂萜A的1H和13C NMR数据(在CDCl3中测定)
Eucalrobusone C(2)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；分子式为C28H38O5；ESI-MS m/z 455[M+H]+；1H NMR(CDCl3，600MHz)：δH 5.28(1H，d，J＝4.0Hz，H-6)，4.83(1H，br s，H-12a)，4.63(1H，br s，H-12b)，1.78(1H，s，Me-13)，1.17(1H，s，Me-14)，1.14(1H，s，Me-15)，10.12(1H，s，H-8')，0.99×2(6H，d，J＝6.6Hz，Me-12'，Me-13')，14.41(1H，s，OH-1')，15.36(1H，s，OH-3')；13C NMR(CDCl3，150MHz)：δC 49.2(d，C-1)，22.9(t，C-2)，32.8(t，C-3)，38.8(d，C-4)，148.0(s，C-5)，123.9(d，C-6)，41.4(d，C-7)，22.3(t，C-8)，34.4(t，C-9)，38.0(s，C-10)，148.1(s，C-11)，111.7(t，C-12)，22.2(q，Me-13)，21.4(q，Me-14)，22.4(q，Me-15)，168.1(s，C-1')，103.4(s，C-2')，172.1(s，C-3')，105.5(s，C-4')，161.7(s，C-5')，104.3(s，C-6')，22.4(t，C-7')，192.1(d，C-8')，206.6(s，C-9')，52.9(t，C-10')，22.8×2(q，Me-12'，Me-13')。
Eucarobustol C(3)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；分子式为C28H40O6；ESI-MS m/z 473[M+H]+；1H NMR(C5D5N,600MHz)：δH 3.32(1H，m，H-1)，6.02(1H，br s，H-6)，1.37(3H，s，Me-12)，1.36(3H，s，Me-13)，0.93(3H，d，J＝6.8Hz，Me-14)，1.36(3H，s，Me-15)，3.24(1H，d，J＝13.7Hz，H-7'a)，3.08(1H，d，J＝13.7Hz，H-7'b)，10.52(1H，H-8')，1.03(6H，d，J＝6.7Hz，Me-12'，Me-13')；13C NMR(C5D5N，150MHz)：δC 44.1(d，C-1)，29.1(t，C-2)，39.3(t，C-3)，51.0(s，C-4)，152.9(s，C-5)，122.5(d，C-6)，53.5(d，C-7)，26.3(t，C-8)，35.2(t，C-9)，35.9(d，C-10)，73.3(s，C-11)，28.4(q,Me-12)，28.0(q，Me-13)，18.7(q，Me-14)，27.0(q，Me-15)，173.4(s，C-1')，107.7(s，C-2')，168.1(s,C-3')，105.5(s,C-4')，170.0(s，C-5')，108.2(s，C-6')，35.9(d，C-7')，193.4(s，C-8')，206.9(s，C-9')，53.5(t，C-10')，25.8(d，C-11')，23.5×2(q，Me-12'，13')。
Macrocarpal A(4)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；分子式为C28H40O6；ESI-MSm/z 473[M+H]+；1H NMR(C5D5N，600MHz)：δH 1.58(1H，td，J＝10.4，4.1Hz，H-5)，0.69(1H，t，J＝9.8Hz，H-6)，1.19(3H，s，Me-12)，1.28(3H，s，Me-13)，1.39(3H，s，Me-14)，0.97(3H，s，Me-15)，10.53(1H，s，H-7')，10.56(1H，s，H-8')，0.95(3H，d，J＝6.6Hz，Me-12')，1.02(3H，d，J＝6.6Hz，Me-13')；13C NMR(C5D5N，150MHz)：δC 55.0(d，C-1)，25.3(t，C-2)，34.7(t，C-3)，48.8(s，C-4)，44.1(d，C-5)，28.0(d，C-6)，27.6(d，C-7)，21.0(t，C-8)，45.3(t，C-9)，74.6(s，C-10)，19.8(s，C-11)，17.8(q，Me-12)，29.1(q，Me-13)，20.8(q，Me-14)，22.5(q，Me-15)，171.7(s,C-1')，106.8(s，C-2')，171.0(s，C-3')，106.8(s，C-4')，171.7(s，C-5')，108.2(s，C-6')，192.0(d，C-7')，191.8(d，C-8')，35.7(d，C-9')，35.8(t，C-10')，26.3(d，C-11')，24.8(q，Me-12)，21.6(q，Me-12)。
Macrocarpal B(5)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；分子式为C28H40O6；ESI-MSm/z 473[M+H]+；1H NMR(CD3OD,400MHz)：δH 0.65(1H，t，J＝9.5Hz，H-6)，1.14(3H，s，Me-12)，1.08(3H，s，Me-13)，1.12(3H，s，Me-14)，1.11(3H，s，Me-15)，10.10(1H，s，H-7')，10.12(1H，s，H-8')，0.80(3H，d，J＝6.6Hz，Me-12')，0.86(3H，d，J＝6.6Hz，Me-13')；13C NMR(CD3OD，100MHz)：δC 58.2(d，C-1)，25.3(t，C-2)，40.7(t，C-3)，50.3(s，C-4)，42.0(d，C-5)，30.6(d，C-6)，28.2(d，C-7)，21.4(t，C-8)，45.9(t，C-9)，76.4(s,C-10)，20.1(s，C-11)，17.5(q，Me-12)，29.3(q，Me-13)，18.3(q，Me-14)，20.1(q，Me-15)，170.8(s，C-1')，106.0(s，C-2')，168.4(s，C-3')，106.0(s，C-4')，170.2(s，C-5')，111.8(s，C-6')，193.2(d，C-7')，193.0(d，C-8')，42.0(d，C-9')，36.6(t，C-10')，27.1(d，C-11')，25.0(q，Me-12')，21.8(q，Me-12')。
Eucalyptin A(6)的物理常数和波谱数据：无色胶状物；分子式为C28H40O6；
ESI-MS m/z 473[M+H]+；1H NMR(CD3OD，600MHz)：δH 0.57(1H，t，J＝10.7Hz，H-6)，1.10(3H,s,Me-12)，1.07(3H，s，Me-13)，1.15(3H，s，Me-14)，0.81(3H，s，Me-15)，10.06(1H，s，H-8')，0.98×2(6H，d，J＝6.5Hz，Me-12'，Me-13')；13C NMR(CD3OD，150MHz)：δC 56.1(d，C-1)，25.5(t，C-2)，40.6(t，C-3)，48.7(s，C-4)，48.8(d，C-5)，28.4(d，C-6)，27.8(d，C-7)，21.4(t，C-8)，45.4(t，C-9)，76.6(s，C-10)，20.5(s，C-11)，29.5(q，Me-12)，17.4(q，Me-13)，20.3(q，Me-14)，19.6(q，Me-15)，172.5(s，C-1')，108.1(s，C-2')，167.0(s，C-3')，106.2(s，C-4')，169.3(s，C-5')，105.4(s，C-6')，32.7(t，C-7')，193.5(d，C-8')，207.7(s，C-9')，54.2(t，C-10')，26.6(d，C-11')，23.3×2(q，C-12'，C-13')。
实施例4：
按实施例1和2的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例5：
按实施2和3的方法先制得eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C三个化合物，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例6：
按实施例1和2的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例7：
按实施3和4的方法先制得eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C三个化合物，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例8：
将实施例1和2所分离得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例9：
按实施2和3的方法先制得eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C三个化合物与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例10：
按实施例1和2的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物，按其与赋形剂重量比为1:5–1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例11：
按实施2和3的方法先制得eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C三个化合物，按其与赋形剂重量比为1:5–1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例12：
按实施例1和2的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物，按常规口服液制法制成口服液。
实施例13：
按实施3和4的方法先制得eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C三个化合物，按常规口服液制法制成口服液。
实施例14：
按实施例1–3的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A四个化合物及eucalrobusone C和eucarobustol C两个化合物，按常规口服液制法制成口服液。
实施例15：
按实施例1–3的方法先制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B，eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C六个化合物，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
实施例16：
取按实施例1–3的方法制得蓝桉果实杂萜A，macrocarpal A，macrocarpal B，eucalyptin A，eucalrobusone C和eucarobustol C六个化合物12.4克，加入淀粉600克，乳糖200克，薄荷醇5克，羧甲基淀粉钠183克，制成含片，作为功能食品。
为了更好地理解本发明的优异性，下面将用本发明所有化合物作用结果即试验例子来说明，但并不以此来限定本发明。
试验例1：
杂萜化合物1–6对抑制五株癌细胞生长及拓扑异构酶I的影响：
参照文献方法(Mosmann,T.Rapid colorimetric assay for cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicityassays.J.Immunol.Methods.1983,65:55–63)。贴壁细胞MTT法的实验步骤：收集对数期细胞，调整细胞密度为5×104个/mL；按照100μL/孔，接种至96孔板中，于37℃，5％CO2条件下培养24小时；
去除96孔板中旧培养基，加入不同浓度(100μM,10μM,1μM,0.1μM,0.01μM)的含药培养基，100μL/孔，并于37℃、5％CO2条件下培养72小时；每孔加入20μL 2.5mg/mL的MTT溶液，并于37℃、5％CO2条件下培养4小时；除去溶液，并于每孔加入100μL DMSO；将96孔板置于酶标仪，检测570/490处的吸光值；计算化合物对细胞的抑制率，公式为：抑制率＝[1–(A实验–A空白)]/(A控制–A空白)，并根据抑制率求出半数抑制浓度IC50值。
悬浮细胞MTT法的实验步骤：收集对数期细胞，调整细胞密度为1×105个/mL；按照50μL/孔，接种至96孔板中，加入不同浓度(200μM,20μM,2μM,0.2μM,0.02μM)的含药培养基，50μL/孔，并于37℃、5％CO2条件下培养72小时；每孔加入20μL 2.5mg/mL的MTT溶液，并于37℃、5％CO2条件下培养4小时；每孔加入100μL三联裂解液，并于37℃、5％CO2条件下孵育过夜；将96孔板置于酶标仪，检测570/490处的吸光值；计算化合物对细胞的抑制率，公式为：抑制率＝[1–(A实验–A空白)]/(A控制–A空白)，并根据抑制率求出半数抑制浓度IC50值。
DNA松散实验(Top1-mediated Relaxation Assay)：制作1％的琼脂糖凝胶；Top1(浓度为20U/μL)用Top1缓冲液稀释一百倍，得到浓度为1U/μL的Top1溶液，待用；用DMSO将化合物配制成一定的浓度梯度；20μL的反应体系中分别加入以下试剂：1μL稀释后的pBR322DNA溶液，1μL稀释后的Top1溶液，1μL化合物溶液，加Top1缓冲液补足体积；其中，第一个样品为pBR322DNA，不需加Top1和化合物，第二个样品为pBR322DNA和Top1，不需加化合物；配制好样品后，放入37℃水浴中孵育30min；每个样品中加入4μL 6×loading buffer混合，加入琼脂糖凝胶的样品孔中，100V电压下电泳1.5小时；电泳完毕后，在1×gel red溶液中染色半个小时，照相。
DNA缺口实验(Top1-mediated Cleavage Assay)：制作1％的琼脂糖凝胶；用DMSO将化合物配制成一定的浓度梯度；20μL的反应体系中分别加入以下试剂：1μL pBR322DNA溶液(浓度0.5μg/μL)，1μL Top1溶液(浓度10U/μL)，1μL化合物溶液，加Top1缓冲液补足体积；其中，第一个样品为pBR322DNA，不需加Top1和化合物，第二个样品为pBR322DNA和Top1，不需加化合物。
配制好样品后，放入37℃水浴中孵育30min；孵育完毕后每个样品中加入一定量的10％的SDS溶液，使得样品中SDS的终浓度为1％；在每个样品中加入蛋白水解酶K，使其浓度为1mg/mL，50℃水浴中孵育10min；每个样品中加入5μL 6×loading buffer混合，加入琼脂糖凝胶的样品孔中，60V电压下电泳0.5小时；电泳完毕后，将琼脂糖凝胶放入含有0.125μg/mL溴乙锭的1×TAE缓冲溶液中染色半个小时，再次放入电泳槽中电泳半个小时；电泳完毕后，照相。
凝胶阻滞实验(Top1-mediated EMSA)：制作含有5mg/L溴乙锭的1％的琼脂糖凝胶；20μL的反应体系中分别加入以下试剂：1μL稀释后的pBR322DNA溶液，1μL稀释后的Top1溶液，1μL化合物溶液，加Top1缓冲液补足体积；其中，第一个样品为pBR322DNA，不需加Top1和化合物，第二个样品为pBR322DNA和Top1，不需加化合物；配制好样品后，室温孵育3min；每个样品中加入4μL 6×loading buffer混合，加入琼脂糖凝胶的样品孔中，20V电压下电泳6.5小时；电泳完毕后，直接照相。
DNA嵌入实验(Top1-mediated Unwinding)：制作1％的琼脂糖凝胶；用DMSO将化合物配制成一定的浓度梯度(1，5，25μM)；配制反应终止液：5％SDS，5mg/mL蛋白水解酶K。配制好后放入37℃预热；20μL的反应体系中分别加入以下试剂：1μL pBR322DNA溶液(浓度0.2μg/μL)，1μL Top1溶液(浓度20U/μL)，1μL化合物溶液，加Top1缓冲液补足体积；其中，第一个样品为pBR322DNA，不需加Top1和化合物，第二个样品为pBR322DNA和Top1，不需加化合物。0.3，0.6，1.2mg/L的溴化乙锭(EB)为阳性对照；配制好样品后，放入37℃水浴中孵育30min；孵育完毕后每个样品中加入5mL反应终止液；每个样品加入5μL 6×loading buffer混合，加入琼脂糖凝胶的样品孔中，100V电压下电泳1.5小时；电泳完毕后，在1×gel red溶液中染色半个小时，照相。
结果表明，所有化合物均对五株癌细胞的生长具有明显的抑制作用(表2)，发现所有化合物均对所有细胞株具有较好的抑制生长活性，如化合物2，3和6对A549细胞株的IC50值分别达到了5.2，5.3和4.9μM，化合物2和6对HCT116细胞株的IC50值为9.6μM，化合物6对DU145细胞株的IC50值为8.9μΜ,以上活性均强于阳性对照VP-16。进一步的活性测试实验表明，化合物1，2，3和5具有类似于喜树碱的抑制拓扑酶活性，化合物1和4具有较强的促进癌细胞凋亡的活性。
通过与Top1相互作用特征与作用模式的研究发现，活性化合物为新作用机制的一类Top1催化型抑制剂(图3)。
表2、化合物1–6抑制癌细胞生长(μM)和Top1酶抑制率(％)
a相对于50μM浓度下的喜树碱，化合物的Top1酶抑制活性表达如下：++++,大于90％；+++,在60％和89％之间；++,在30％和59％之间。
试验例2：
细胞凋亡实验：收集对数期细胞，调整细胞密度为1.5×105个/mL，种于6孔板中，每孔2mL，于37℃，5％CO2条件下培养24小时；弃去旧培养基，并加入不同浓度的含化合物培养基(10μM、20μM、40μM)，于37℃，5％CO2条件下分别培养24小时；收集旧培养基，胰酶消化，将消化下的细胞与旧培养基混合，并用冷的PBS溶液洗涤细胞；加入500μL 1×BindingBuffer到细胞中并混匀。在避光环境下，加入10μL PI以及5μL Annexin-V-FITC，室温避光反应15分钟，在1小时内迅速将样品置于流式细胞仪测试。
细胞凋亡实验以HCT116作为受测细胞，实验结果如图4。当加不同浓度(10μM、20μM、40μM)的化合物1和4作用24小时后，相对于空白组的0.82％，化合物1的早凋亡比率分别增加到4.16％、5.41％和42.26％，化合物4的早凋亡比率分别增加到3.42％、6.02％和21.06％。凋亡比率随着浓度的递增而增加，呈现一定的浓度依赖性。结果表明化合物1和4具有诱导细胞凋亡的能力且成浓度依赖性。
试验例3：
免疫荧光实验：收集对数期细胞，调整细胞密度为3×104个/mL，种于24孔板中，每孔1mL，于37℃，5％CO2条件下培养24小时；弃去旧培养基，并加0.5μM CPT于37℃，5％CO2条件下培养3小时和14μM的化合物于37℃，5％CO2条件下培养15小时；弃去旧培养基，用4％多聚甲醛室温固定细胞15分钟；除去固定液，用PBS洗涤细胞2次，每次5分钟，加入含0.5％Triton-X 100的透化液500μL，于37℃透化30分钟；用5％山羊血清封闭液洗去透化液3次，每次10分钟，再加入1mL封闭液于37℃封闭30分钟；加入一抗，100μL每孔，于4℃孵育过夜；用封闭液洗涤细胞6次，每次5分钟，加入DAPI、荧光二抗，100μL每孔，于37℃避光孵育2小时；用封闭液洗涤细胞6次，每次10分钟，并将样品置于激光共聚焦显微镜成像。以HCT116作为受测细胞进行免疫荧光实验，检测DNA损伤的标志γH2AX的形成。结果如图5所示，阳性对照CPT在0.5μM的浓度下作用3小时，在大部分细胞的细胞核内已经出现γH2AX信号，表明此时细胞内已经发生不同程度的DNA损伤。而化合物1和4在14μM的浓度下作用长达15小时细胞核内的γH2AX信号很弱。表明化合物1和4在该浓度下不能产生Top1介导的DNA损伤，这与本发明Top1酶实验的结论一致。
Claims (10)
1.如下结构式所示的甲酰间苯三酚杂萜类化合物蓝桉果实杂萜A，
2.含有治疗有效量的如下结构式所示的化合物蓝桉果实杂萜A(1),eucalrobusone C(2),eucarobustol C(3),macrocarpal A(4),macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)的任一种或两种的混合物和药学上可接受的载体的药物组合物，
3.化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpalA(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备抗癌症的药物及由其引起的并发症的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的癌症为结肠癌、急性淋巴白血病、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌。
5.化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpalA(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备抑制肿瘤细胞生长剂中的应用。
6.化合物蓝桉果实杂萜A(1)和macrocarpal A(4)在制备促进癌细胞凋亡剂中的应用。
7.化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)和macrocarpal B(5)在制备抑制拓扑酶活性剂中的应用。
8.化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpalA(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)在制备功能食品中的应用。
9.化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpalA(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)的制备方法，其特征在于该方法包括采用石油醚提取、硅胶分离、凝胶除杂、反相硅胶Rp-18分离及半制备HPLC纯化后得所述化合物。
10.如权利要求9所述的化合物蓝桉果实杂萜A(1)，eucalrobusone C(2)，eucarobustol C(3)，macrocarpal A(4)，macrocarpal B(5)和eucalyptin A(6)的制备方法，其特征在于该方法包括：取蓝桉果实，粉碎后，用乙酸乙酯冷浸提取3次，每次48小时，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏，浸膏分用硅胶80～100目拌样，经硅胶200～300目柱层析，洗脱剂用30:1→1:1，v/v的石油醚:丙酮梯度洗脱，TLC检测合并得到九个流份Fr.1–9；Fr.4，Fr.5和Fr.9经过结晶和重结晶，Rp-18反相柱层析，Saphadex LH-20凝胶柱层析和半制备HPLC法得到六个间苯三酚杂萜：蓝桉果实杂萜A，eucalrobusone C，eucarobustol C，macrocarpal A，macrocarpal B和eucalyptin A。
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