CN109724979A - 一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法，涉及虾蟹类眼柄年龄鉴定技术领域，先从虾蟹眼区的眼窝中完整剪下眼柄，然后将眼柄依次经过固定、裁剪、脱钙、脱水和透明预处理，浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，该方法制片成功率高、切片可清晰的观察到生长纹，且能获得眼柄从基部到末端的连续切片，每个眼柄可以得到不同位置、不同角度的多个切片采用制备的虾蟹类眼柄切片在显微镜下进行生长纹计数进行年龄的鉴定，方法简单，可直接的鉴定虾蟹类年龄。

Description

一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法

技术领域

本发明涉及水产生物眼柄年龄鉴定技术领域，具体涉及虾蟹类眼柄年龄鉴定技术领域，特别是指一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法。

背景技术

虾蟹类属于节肢动物门、甲壳纲、十足目，种类众多，富含蛋白质和不饱和脂肪酸，具有极高的营养价值，是水产养殖和海洋渔业捕捞的重要对象，具有极高的经济价值。

年龄鉴定是研究水生生物生活史的必要组成部分，也是渔业资源评估和渔业种群动态模型研究中的重要内容。大多数水生生物的年龄鉴定可以通过计数储存在钙化结构中的生长纹来完成，例如鱼类的耳石、鳞片，头足类的角质额、内壳和耳石中的生长纹。而虾蟹类等甲壳动物通过蜕皮完成生长，其钙化结构随着蜕皮周期性的被替代，因而无法直接通过钙化组织对其年龄进行鉴定。

目前常见的虾蟹类年龄鉴定方法包括饲养法、标记重捕法、体长频度法、脂褐素分析法、硬组织生长纹分析法，其中硬组织生长纹分析法是一种近几年兴起的一种，通过将眼柄或者胃磨打磨、抛光的方式制成切片以观察生长纹的方法。发明人在研究虾蟹类年龄鉴定方法时发现，硬组织生长纹分析法，虽然提供了一种可以直接鉴定虾蟹类年龄的方法，但也存在着制片成功率低、生长纹计数误差大的问题，而且一个眼柄只能获得一个切片，无法对眼柄从基部到末端连续观察，也无法从一个眼柄获得不同位置、不同角度的切片。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种虾蟹类眼柄切片制备及其年龄鉴定方法以克服现有技术中全部或者部分不足。

基于上述目的本发明提供的一种虾蟹类眼柄切片制备方法，所述制备方法包括如下步骤：预处理、浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，其中，所述的切片处理包括切片、贴片和烤片，所述切片后处理包括脱蜡、复水、染色、脱水和透明。

在一些可选实施例中，所述制备方法包括如下步骤：

1)预处理：取虾蟹类眼柄，将眼柄置于固定液中，固定12-24h，剔净眼柄内部的结缔组织，并将基部剪平；将裁剪完成后的眼柄置于脱钙液中进行脱钙处理6-12h，清洗后依次进行脱水处理和透明处理，得眼柄A；

2)浸蜡包埋：将眼柄A依次置于熔化的石蜡混合物、石蜡内浸渍，将浸蜡的眼柄和液态石蜡一起倒入包埋盒，待表层液态石蜡开始凝固时，调整眼柄位置，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，冷却凝固，得眼柄蜡块；

3)切片处理：将眼柄蜡块切片，得切片蜡带，将切片蜡带移至烤片机在烤片台上贴片，得烤片；

4)切片后处理：将烤片进行浸泡脱蜡，将脱蜡后的切片经过浓度梯度乙醇处理后，浸入流动的水中进行复水，然后依次经过苏木精染色，冲洗，乙醇脱水，伊红染色，将染色后的切片在系列浓度梯度中的脱水剂中进行脱水处理，脱水完成后的切片浸入透明剂中进行透明处理；

5)封片：向步骤(4)处理后的切片上加入中性树脂，盖片，待片干即得到眼柄的石蜡切片。

在一些可选实施例中，所述步骤(1)中，

固定液为Bouin氏液；

脱钙液的成分为体积分数为10％甲醛80mL和10％硝酸水溶液20mL的混合液；

清洗的溶液为体积分数为70％的乙醇；

脱水处理：脱水剂为由低浓度至高浓度的乙醇溶液，浓度梯度和处理时间如下：70％乙醇30min→80％乙醇30min→95％乙醇Ⅰ30min→95％乙醇Ⅱ30min→无水乙醇Ⅰ30min→无水乙醇Ⅱ30min；

透明处理：依次浸入第一透明剂和第二透明剂中进行透明处理，所述透明剂一为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液，处理时间15-30min，所述透明剂二为二甲苯，处理时间15-30min。

在一些可选实施例中，所述步骤(2)中浸渍：温度为55-57℃，石蜡混合物为1:1的石蜡和二甲苯的混合物，浸渍时20-30min，石蜡中浸渍2-3小h。

在一些可选实施例中，所述步骤(3)中切片厚度为6-8μm，烤片机温度40℃，贴片时长24h。

在一些可选实施例中，所述步骤(4)中，浸泡脱蜡的溶液为二甲苯，一次浸泡10min，换液，二次浸泡10min；

浓度梯度乙醇处理：50％二甲苯+50％无水乙醇5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→85％乙醇5min；

苏木精染色：时长20min；

乙醇脱水：分别在体积分数为85％、90％的酒精中脱水5min；

伊红染色：时长30s；

脱水处理：95％乙醇5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min；

透明处理：透明剂为二甲苯，处理时间10min，更换，再次处理10min。

在一些可选实施例中，所述苏木精染色和伊红染色过程中使用返蓝液处理，所述的返蓝液为浓度1％的氨水或清水，处理时间为1-2min。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种虾蟹类眼柄切片制备方法，先从虾蟹眼区的眼窝中完整剪下眼柄，然后将眼柄依次经过固定、裁剪、脱钙、脱水和透明预处理，浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，该方法制片成功率高、切片可清晰的观察到生长纹，且能获得眼柄从基部到末端的连续切片，每个眼柄可以得到不同位置、不同角度的多个切片。

一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，采用所述的虾蟹类眼柄切片制备方法获得的切片，进行生长纹计数。

在一些可选实施例中，所述生长纹计数包括如下步骤：

1)显微镜观察，选择合适倍数，拍摄清楚的生长纹可视视野；

2)生长纹计数：对采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，采用制备虾蟹类眼柄切片在显微镜下进行生长纹计数，方法简单，可直接的鉴定虾蟹类年龄。

附图说明

图1为本发明实施例中剔净眼柄内部的结缔组织示意图；

图2为本发明实施例不同倾斜角度裁剪示意图；

图3为本发明实施例眼柄包埋好的蜡块示意图；

图4为本发明实施例眼柄切片生长纹显微结构示意图。

1-蜡块，2-眼柄，3-载玻片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，本发明实施例中所有使用“一次，第一”和“二次，第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“一次，第一”和“二次，第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。

本发明实施例为了克服现有技术中部分或全部不足，本发明实施例提供的一种虾蟹类眼柄切片制备方法，包括如下步骤：预处理、浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，其中，所述的切片处理包括切片、贴片和烤片，所述切片后处理包括脱蜡、复水、染色、脱水和透明。

具体的包括如下步骤：

1)预处理：取虾蟹类眼柄，将眼柄置于固定液中，固定12-24h，剔净眼柄内部的结缔组织，并将基部剪平；将裁剪完成后的眼柄置于脱钙液中进行脱钙处理6-12h，清洗后依次进行脱水处理和透明处理，得眼柄A；

2)浸蜡包埋：将眼柄A依次置于熔化的石蜡混合物、石蜡内浸渍，将浸蜡的眼柄和液态石蜡一起倒入包埋盒，待表层液态石蜡开始凝固时，调整眼柄位置，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，冷却凝固，得眼柄蜡块；

3)切片处理：将眼柄蜡块切片，得切片蜡带，将切片蜡带移至烤片机在烤片台上贴片，得烤片；

4)切片后处理：将烤片进行浸泡脱蜡，将脱蜡后的切片经过浓度梯度乙醇处理后，浸入流动的水中进行复水，然后依次经过苏木精染色，冲洗，乙醇脱水，伊红染色，将染色后的切片在系列浓度梯度中的脱水剂中进行脱水处理，脱水完成后的切片浸入透明剂中进行透明处理；

5)封片：向步骤(4)处理后的切片上加入中性树脂，盖片，待片干即得到眼柄的石蜡切片。

本发明实施例的其一目的是提供一种虾蟹类眼柄切片制备方法，包括如下步骤：

1、预处理

1)固定：用眼科剪刀将虾蟹类生物眼窝内的眼柄取出，注意轻取，避免损伤眼柄基部，保证眼柄从虾蟹眼区的眼窝中完整剪下，将所得眼柄在半小时内置于Bouin氏液中，固定24小时，眼柄置于固定液中，要求尽量在取下眼柄半小时内投入固定液中，防止组织的自溶作用，得到固定的眼柄，其中，Bouin氏液，配制方法为1.5g苦味酸固体溶解在100mL蒸馏水中得到苦味酸饱和液，取75mL苦味酸饱和液、25mL福尔马林、5mL冰醋酸混匀得到105MlBouin氏液；

2)清洗：将完成固定的眼柄在体积分数为50％的乙醇中洗两次，洗尽残留在眼柄表面的Bouin氏液后，将眼柄置于体积分数为70％的乙醇中12h；

3)裁剪：用眼科镊子和剪刀剔净眼柄内部的结缔组织，防止影响观察，如图1，修剪眼柄基部，修剪时选择不同倾斜角度，得到不同倾角的眼柄。眼柄基部剪平可使眼柄保持稳定，利于后续包埋到石蜡中，眼柄基部剪平，角度有多种，可以尝试不同倾斜角度，如图2；

4)脱钙：将裁剪完成后的眼柄置于脱钙液(体积分数为10％甲醛80mL和10％硝酸水溶液20mL混匀得到的混合液)中6-12h，不同种类、不同大小的眼柄脱钙时间不同，判断脱钙是否完成的标准为：眼柄柔软性较好，用镊子弯曲120°后可回弹；

5)脱水：脱水前应将脱钙后的眼柄用体积分数为70％的乙醇清洗，洗去脱钙液；而后用系列浓度梯度的脱水剂为由低浓度至高浓度乙醇，浓度梯度和处理时间如下：70％乙醇(30min)→80％乙醇(30min)→95％乙醇Ⅰ(30min)→95％乙醇Ⅱ(30min)→无水乙醇Ⅰ(30min)→无水乙醇Ⅱ(30min)，脱水过程尽可能在摇床中进行，有利于均匀充分地脱水；

6)透明：脱水完成后的眼柄浸入第一透明剂，由无水乙醇和二甲苯按1:1比例混匀所得混合液中20min，而后置于第二透明剂，二甲苯中2min至眼柄均匀透明，透明过程最终达到的效果为眼柄均匀透明，眼柄A。

2、浸蜡包埋

1)浸蜡：将眼柄A置于熔化石蜡和二甲苯比例为1:1的混合液中，浸泡时间为20min，而后在石蜡中浸渍，浸渍时间为2.5h，且浸蜡过程在控温烘箱中完成，烘箱温度控制在55-57℃；

2)包埋：将浸蜡的眼柄和液态石蜡一起倒入包埋盒，调整眼柄位置的时间取决于石蜡的凝固速度，待表层液态石蜡开始凝固时，即要迅速调整眼柄位置，约2-4s后调整眼柄位置，调整眼柄位置，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，也可通过根据需要修剪眼柄基部平面角度，获得所需平面，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，冷却凝固后即可得到包埋好眼柄的蜡块，如图3。

3、切片处理

1)切片：将凝固的蜡块修整，得到形状整齐的蜡块，尽量使蜡块上下边保持平行，进行切片，切片厚度为6μm，得到眼柄切片蜡带；

2)贴片和烤片：将载玻片放于40℃的烤片机上，滴加适量蒸馏水加热，待水温热后将蜡带转移至载玻片有水区域，借助水的张力和一定的温度展平，吸干玻片上的水，在烤片台上贴片24h，得烤片。

4、切片后处理

1)脱蜡：将完成的烤片，载有蜡带的载玻片用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯再次浸泡10min，完成脱蜡；

2)复水：将脱蜡后的切片在系列浓度梯度中的乙醇溶液中处理后，浓度梯度乙醇处理如下：50％二甲苯+50％无水乙醇(5min)→无水乙醇Ⅰ(5min)→无水乙醇Ⅱ(5min)→95％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→85％乙醇(5min)，浸入流动的蒸馏水中浸泡1min，保持水流速度缓慢，防止蜡带冲下载玻片；

3)染色：将复水的切片在苏木精染液中染色20min，流水中缓缓冲洗10min，返蓝液中浸泡80s左右，分别在体积分数为85％、90％的酒精中脱水5min，在伊红染液中染色30s，返蓝液为浓度1％的氨水或清水；

4)脱水：将染色后的切片在系列浓度梯度中的脱水剂中进行脱水处理：95％乙醇(5min)→无水乙醇I(5min)→无水乙醇II(5min)；

5)透明：脱水完成后的切片浸入二甲苯中10min，更换透二甲苯，再次处理10min。

5、封片

向切片上加入适量的中性树脂，盖片，待片干即得到眼柄的石蜡切片，封片过程中盖片时，尽量减少气泡产生，向载玻片上加入适量的中性树脂前，应确保载玻片上仍残留少许透明剂二甲苯，封片后，除了可以自然干片外，也可以在37-40℃烤片机上烘烤30min。

本发明实施例提供的一种虾蟹类眼柄切片制备方法，先从虾蟹眼区的眼窝中完整剪下眼柄，然后将眼柄依次经过固定、裁剪、脱钙、脱水和透明预处理，浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，该方法制片成功率高、切片可清晰的观察到生长纹，且能获得眼柄从基部到末端的连续切片，每个眼柄可以得到不同位置、不同角度的多个切片。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明实施例的其二目的是提供一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，采用所述的虾蟹类眼柄切片制备方法获得的切片，进行生长纹计数。

在一些可选实施例中，生长纹计数包括如下步骤：

1)显微镜观察，选择合适倍数，拍摄清楚的生长纹可视视野；

2)生长纹计数：对采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目，如图4。

从上面所述可以看出，本发明实施例中提供的一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，采用制备虾蟹类眼柄切片在显微镜下进行生长纹计数，方法简单，可直接的鉴定虾蟹类年龄。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：预处理、浸蜡包埋、切片处理、切片后处理和封片，其中，所述的切片处理包括切片、贴片和烤片，所述切片后处理包括脱蜡、复水、染色、脱水和透明。

2.根据权利要求1所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1)预处理：取虾蟹类眼柄，将眼柄置于固定液中，固定12-24h，剔净眼柄内部的结缔组织，并将基部剪平；将裁剪完成后的眼柄置于脱钙液中进行脱钙处理6-12h，清洗后依次进行脱水处理和透明处理，得眼柄A；

2)浸蜡包埋：将眼柄A依次置于熔化的石蜡混合物、石蜡内浸渍，将浸蜡的眼柄和液态石蜡一起倒入包埋盒，待表层液态石蜡开始凝固时，调整眼柄位置，使得眼柄基部与包埋盒底部平行，冷却凝固，得眼柄蜡块；

3)切片处理：将眼柄蜡块切片，得切片蜡带，将切片蜡带移至烤片机在烤片台上贴片，得烤片；

4)切片后处理：将烤片进行浸泡脱蜡，将脱蜡后的切片经过浓度梯度乙醇处理后，浸入流动的水中进行复水，然后依次经过苏木精染色，冲洗，乙醇脱水，伊红染色，将染色后的切片在系列浓度梯度中的脱水剂中进行脱水处理，脱水完成后的切片浸入透明剂中进行透明处理；

5)封片：向步骤(4)处理后的切片上加入中性树脂，盖片，待片干即得到眼柄的石蜡切片。

3.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，

固定液为Bouin氏液；

脱钙液的成分为体积分数为10％甲醛80mL和10％硝酸水溶液20mL的混合液；

清洗的溶液为体积分数为70％的乙醇；

脱水处理：脱水剂为由低浓度至高浓度的乙醇溶液，浓度梯度和处理时间如下：70％乙醇30min→80％乙醇30min→95％乙醇Ⅰ30min→95％乙醇Ⅱ30min→无水乙醇Ⅰ30min→无水乙醇Ⅱ30min；

透明处理：依次浸入第一透明剂和第二透明剂中进行透明处理，所述透明剂一为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液，处理时间15-30min，所述透明剂二为二甲苯，处理时间15-30min。

4.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中浸渍：温度为55-57℃，石蜡混合物为1:1的石蜡和二甲苯的混合物，浸渍时20-30min，石蜡中浸渍2-3小h。

5.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中切片厚度为6-8μm，烤片机温度40℃，贴片时长24h。

6.根据权利要求2所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，浸泡脱蜡的溶液为二甲苯，一次浸泡10min，换液，二次浸泡10min；

浓度梯度乙醇处理：50％二甲苯+50％无水乙醇5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→85％乙醇5min；

苏木精染色：时长20min；

乙醇脱水：分别在体积分数为85％、90％的酒精中脱水5min；

伊红染色：时长30s；

脱水处理：95％乙醇5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min；

透明处理：透明剂为二甲苯，处理时间10min，更换，再次处理10min。

7.根据权利要求6所述的虾蟹类眼柄切片制备方法，其特征在于，所述苏木精染色和伊红染色过程中使用返蓝液处理，所述的返蓝液为浓度1％的氨水或清水，处理时间为1-2min。

8.一种虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述的虾蟹类眼柄切片制备方法获得的切片，进行生长纹计数。

9.根据权利要求8所述的虾蟹类眼柄年龄鉴定方法，其特征在于，所述生长纹计数包括如下步骤：

1)显微镜观察，选择合适倍数，拍摄清楚的生长纹可视视野；

2)生长纹计数：对采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。