CN114689407B - 一种动物微小组织石蜡切片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物微小组织石蜡切片制作方法，包括以下步骤：正确识别动物微小组织并快速、完整取材，放入中性甲醛固定液固定，溢流冲洗；使用伊红染液进行标记，拭镜纸包裹得微小组织包裹；放入带孔容器中，进行乙醇梯度脱水处理；然后放入二甲苯中透明处理；在包埋模具中注入熔化的蜡液，将微小组织放入包埋模具中，继续注入熔化的蜡液；待蜡液完全凝固后，将蜡块修边切成四棱台形状；冷冻，使用钝化处理的刀片连续切片；纯水中展开，切片黏附于载玻片上，烤片、染色，得动物微小组织石蜡切片。本发明方法预先利用伊红标记并采用包裹保护，不易丢失，并利用钝化处理刀片，切片品质好，微小组织结构清晰完整。

Description

一种动物微小组织石蜡切片的制作方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种动物病理切片制作方法，更具体的是动物微小组织石蜡切片的制作方法。

背景技术

一般来说，小型哺乳动物组织大小只有米粒、小米粒或芝麻大小，甚至为碎小组织，只要肉眼可见且长径较小的组织，均称为“微小组织”。基础实验中常见的微小组织如：动物的垂体、卵巢、肾上腺、淋巴结等组织；临床中常见的微小组织如纤维支气管镜(纤支镜)、电子纤维胃镜、咽喉镜、肠镜等钳取的组织，以及乳腺、肺、肝、纵膈、前列腺、睾丸等穿刺吸取的组织。

由于这些微小组织体积小、质碎、易丢失，包埋时易被熔化的石蜡液冲散、易漂浮，进而导致微小组织不在同一个平面上，切片时多块微小组织不易切全、易将组织切得所剩无几，甚至切完等。同时，由于所获取的组织大多数很微小，给病理制片带来一定困难。因此，一些病理技术人员提出了微小组织的概念，并进行了有益的探索。但目前已有的技术关于制作微小组织病理切片的步骤仍然较为繁琐，且没有一个标准化的参数及流程作为参考，往往需要依靠技术人员的经验进行切片制作方式摸索，消耗大量的人力物力。

改进微小组织石蜡切片技术，并将病理切片步骤尽可能参数化，有助于基层及经验欠丰富的年轻病理技术人员快速熟悉并掌握该技术，有助于推进基础实验及临床医学病理技术发展。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的微小组织病理切片制作困难，缺乏标准化可靠技术指导的问题，提供一种动物微小组织病理切片制作方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种动物微小组织石蜡切片制作方法，包括以下步骤：

S1、取材：正确识别动物微小组织并快速、完整取材。

S2、固定：将动物微小组织放入中性甲醛固定液中，固定24h-48h；固定完成后，进行溢流冲洗。

所述溢流冲洗是指：取出动物微小组织置于广口瓶中，将瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出，实现对于微小组织的冲洗作用。

S3、标记及包裹：冲洗完成后，在微小组织表面使用伊红染液进行标记；标记后使用拭镜纸进行包裹，得到微小组织包裹。

S4、脱水透明：将微小组织包裹放入带孔容器中，关闭带孔容器盖子；连同带孔容器一起放入乙醇溶液中，进行乙醇梯度脱水处理。

脱水处理完成后，连同所述带孔容器一起放入二甲苯中进行透明处理；透明处理完成后，取出所述微小组织包裹。

S5、石蜡包埋：在包埋模具中注入熔化的蜡液；用镊子开启微小组织包裹，并取出其中的微小组织，将微小组织放入包埋模具中，然后将包埋模具加盖，并继续注入熔化的蜡液；待蜡液完全凝固后，去掉包埋模具，将蜡块修边切成四棱台形状。

S6、切片：将四棱台形状的蜡块冷冻，然后将蜡块放在切片机上固定牢固；连续切片，切片厚度控制在3-4μm，直至将组织完全切下；

切片过程中，使用钝化处理的刀片进行切片。

S7、展片：切片完成后，将切片展入温度为40℃的展片水槽中，待组织展平，将切片黏附于载玻片上，将切片连同载玻片在60-65℃条件下进行烤片。

S8、染色：烤片完成后，进行染色，即得动物微小组织石蜡切片。

本发明动物微小组织石蜡切片制作方法针对微小组织结构容易丢失的特点，采用伊红染液标记显示微小组织所在的位置，在后续步骤中不容易丢失。然后，采用拭镜纸包裹使得微小组织在脱水透明过程中不易丢失，确保石蜡切片制作采集的原材料能够按照设计预期全面回收进行切片制作病理切片。

然后，在石蜡包埋的时候预先将部分熔化的石蜡注入包埋模具中，然后用镊子夹取微小组织放在预先注入的石蜡上，使得后续注入石蜡进行全面包埋的时候，确保微小组织不会因为起浮出现未充分包埋的问题，确保全部微小组织都能够充分包埋于石蜡内部，为切片做充分准备。

最后，在切片过程中，发明人发现采用全新刀片进行切片容易出现断片、刀痕、褶皱、切碎等干扰，对于微小组织本身较小的切片而言，刀痕/褶皱/严重影响切片的外观。故本发明采用钝化后的刀片进行切片，所述钝化处理的刀片是指：全新的一次性切片刀切白蜡块200-400μm厚进行钝化；或者全新的一次性切片刀切白蜡块20次-40次，每次10μm/次，进行钝化；经过钝化处理得到钝化后的刀片。注意，所述白蜡块应为纯化后的石蜡，即：将石蜡溶解后，待杂质沉低，取上面清亮石蜡液，凝固得到纯化后的石蜡。钝化后的刀片用于切片，所得微小组织切片具有更好的连续性和一致性，不会出现切片断片/刀痕/褶皱等干扰微小组织的情况，切片染色以后组织结构更清晰，更利于观察分析。

本发明方法切片得到的微小组织石蜡切片切面完整度更好，连续性更好，可以便于采用计算机软件进行三维重建，进而实现立体建模研究。

进一步，还包括步骤S9，封片：用中性快干胶封片。所得封片即可作为用于科研或教学用途的薄片样本。

进一步，所述微小组织是指长径小于5mm的动物组织。只要肉眼可见，且长径小于5mm的动物组织，均称为“微小组织”或“动物微小组织”。优选地，所述微小组织是指长径小于4mm的动物组织。并且，通常微小组织长径大于0.8mm。

进一步，步骤S2中，所述中性甲醛固定液是用PH＝7.0的磷酸盐缓冲对溶液PBS为溶剂按照体积比PBS：甲醛溶液为9：1进行配制，以保证组织固定完全。

优选地，溢流冲洗时，水洗时水流的速度不要快，以免破坏组织完整性。溢流冲洗流量为0.1-2L/min。流水洗涤是为了去除组织中结合的固定液及沉淀物，避免组织中留有较多的固定液而妨碍脱水，甚至在组织中生成沉淀物或结晶而影响染色和结果。

进一步，步骤S3中，拭镜纸是液体能够渗透的包装材料，所述拭镜纸也称是擦镜纸。

优选地，所述拭镜纸预先剪裁成矩形，经过折叠包裹所述微小组织。优选地，按照四折叠法进行折叠包裹所述微小组织。优选地，折叠过程中，对角线留一定的边缘错开。

优选地，所述拭镜纸裁剪为4.5cm×3.5cm大小，按四折叠法进行折叠。

四折叠法：按接近对角线方向折叠，但不要对齐，留一定边缘；然后左右向中间折叠，上方向下折叠；折叠时用镊子轻轻压实特别是折痕处。对角线方向折叠但不对齐，并留一定边缘，是便于后续包埋折叠结构打开。

优选地，用拭镜纸进行包裹的时候，先将拭镜纸浸湿，然后将微小组织用镊子将放在拭镜纸上。

进一步，步骤S4中，乙醇梯度脱水处理是指：用65％-100％乙醇按照乙醇浓度逐渐升高的方式进行脱水处理。按照乙醇浓度由低到高的方式将病理组织中的水份逐步置换出来。更优选地，乙醇梯度脱水处理是：65％乙醇20min，75％乙醇20min，85％乙醇脱水20min，95％乙醇脱水I次30min、95％乙醇脱水Ⅱ次30min、无水乙醇脱水I次30min、无水乙醇脱水Ⅱ次30min。

优选地，透明处理分次2-3次。优选采用二甲苯处理，透明处理总时长30min-50min，每次15-25min。优选地，透明处理采用二甲苯。更优选地，透明处理方式如下，二甲苯第一次透明处理15min-20min、二甲苯第二次透明处理15min-20min。

进一步，步骤S4中，在透明处理完成后，将微小组织放入软蜡中浸泡；所述软蜡是由石蜡和硬脂酸按照20：1重量比配制成软蜡溶液。

进一步，步骤S5中，将微小组织包裹进行2-4次浸蜡处理，每次浸蜡30min-1h。

优选地，浸蜡方法如下：第一次浸蜡30min、第二次浸蜡30min、第三次浸蜡30min。通过浸蜡使得微小组织间隙中充分渗透填充石蜡，便于切片成型。

进一步，步骤S5中，在包埋机操作台的热台上，取出微小组织，用温度60-65℃的热镊子将微小组织转移到预先注入的蜡液上。优选地，用热镊子将微小组织轻柔推入预先注入的蜡液中。

优选地，放入多个微小组织的时候，将多个微小组织整理整齐。

优选地，利用热镊子将微小组织放置在包埋盒内蜡液的同一平面上。一次切片的多个微小组织可以更好的处于相对接近的同一片面上，使得切片过程更容易控制，以及切片得到的样本更便于观察。优选地，利用热镊子将微小组织3/10～3/5推入蜡液中。

优选地，在微小组织表面刚有点蜡膜时，立即加注另一半熔化的蜡液。

优选地，蜡液完全凝固后，去掉包埋模具，用手术刀片修切成四棱台形状。

进一步，步骤S6中，所述钝化后的刀片是指切过白蜡块200-400μm厚后的刀片，每次切片10μm/次。由于微小组织体积较小，切片过程中反而非常容易出现断片、刀痕，导致切片形成断层，不利于切片品质提升。发明人意外的发现，当采用钝化后的刀片进行切片的时候，可以很好的控制微小组织切片的品质，避免断片刀痕或褶皱。

进一步，步骤S6中，所述钝化后的刀片是指切过白蜡块切片20-40次的刀片。优选地，所述钝化后的刀片是指切过白蜡块20-35次的刀片。例如，每次切片10μm。所述钝化后的刀片是指锋利度为切过白蜡块20-40次范围内的刀片。使用过的刀片或者锋利度在上述范围内的刀片，可以更好的满足微小组织切片剖面形貌要求。因为钝化后的刀片的锋口相较于全新刀片略微钝头，在轮转式切片机上，反而不容易出现刀片锋口振动引起的不连片，刀痕或褶皱的问题。

进一步，将蜡块冷冻方法如下：将四棱台形状的蜡块放入-20℃±3℃的冰箱冷冻1-3min，或者将蜡块放在-6℃±3℃的冷冻台上冷冻1-5min。优选地，将蜡块冷冻方法如下：将四棱台形状的蜡块放入冰箱冷冻1-3min，或者将蜡块放在冷冻台上冷冻1-5min。更优选地，将四棱台形状的蜡块放入-20℃至-25℃冰箱冷冻1-3min，或者将蜡块放在-6℃至-8℃冷冻台上冷冻1-5min。根据发明人的经验，适度冷冻处理可以提高蜡块的强度，使得切片过程中切出蜡带连续性更好，强度更高。但是冷冻时间又不能太长，冷冻过度，蜡块偏硬，反而不利于切片的连续性。

优选地，切片过程中，切面与切片刀相切。切片刀角为5-10度。本切片机优选5度切角。

优选地，展片过程中，选取10-18个切面黏附于载玻片上。更优选地，选取10-12个切面黏附于载玻片上，便于连续观察组织形态结构变化。

优选地，切面黏附于载玻片的约1/3处。优选，切面黏附于载玻片2/9-5/9的位置，最好是黏附于载玻片1/3处。

优选地，将切片连同载玻片在62-65℃条件下进行烤片。

进一步，步骤S8中，染色方法为HE染色、特殊染色或免疫组织化学染色等。可以是任意一种染色方法，根据实际制备的微小组织类型不同，染色方法可以针对性的进行选择，以获得更好的染色效果。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明微小组织石蜡切片制作方法，将微小组织预先利用伊红标记，并采用了专有的包裹保护处理，使得微小组织在脱水透明过程中不易丢失，并且防止起浮，可以很好保证微小组织后续充分脱水、透明。

2、本发明方法在微小组织浸蜡时，预先注入融化的石蜡形成底层，然后放入微小组织，并利用加热的镊子辅助微小组织在石蜡中埋入位置，更好的控制了石蜡和微小组织的浸润渗透，确保了微小组织可以充分浸蜡，进而不会出现浸蜡不足，切片失败。

3、本发明方法特别选用钝化后的刀片进行切片，避免全新刀片对于微小组织的微小结构切片容易出现刀痕或褶皱的缺陷，使得微小组织最终切片完成后可以取得更好的观察状态。并且，本发明制作切片基本能够保证全部切片均满足切片目标要求，进而可以避免微小组织本身切片较少，部分切片失效，所致三维立体重建失败的问题。

4、本发明方法获得微小组织切片符合传统石蜡切片的特性，可以按照常规方法进行染色处理。染色后，石蜡切片的清晰度高，可以采用计算机软件进行三维重建，更好的服务于科研或教学工作。

附图说明：

图1是处死小鼠并固定摆位，准备取材。

图2是摘取小鼠的卵巢组织。

图3是摘取小鼠肾上腺组织。

图4是摘取小鼠淋巴结(左侧A为腋窝淋巴结，右侧B为锁骨上淋巴结)。

图5是测量卵巢组织大小。

图6是测量肾上腺组织大小。

图7是测量淋巴结组织大小。

图8是中性甲醛固定48小时(左侧A为固定48h的卵巢组织，右侧B为固定48h的肾上腺组织)。

图9是固定48h的卵巢组织。

图10是固定48h的肾上腺组织。

图11是淋巴结组织中性甲醛固定。

图12是淋巴结淋巴结组织中性甲醛固定完成。

图13是卵巢经过流水冲洗后，用伊红染色标记，并用拭镜纸包裹。

图14是肾上腺经过流水冲洗后，伊红染色标记，并用拭镜纸包裹。

图15是淋巴结组织经过流水冲洗后，伊红染色标记，并用拭镜纸包裹。

图16是乙醇脱水处理，从低浓度乙醇(65％乙醇)开始脱水至无水乙醇。

图17是卵巢经过二甲苯透明后，进行组织包埋。

图18是肾上腺经过二甲苯透明后，进行组织包埋。

图19是淋巴结经过二甲苯透明后，进行组织包埋。

图20是卵巢连续切片示意图(HE染色制片图)。

图21是卵巢切片经过HE染色制片图(连续切片，典型层面显微镜下放大50倍及100倍后的HE染色制片图)。

图22是肾上腺连续切片示意图(HE染色制片图)。

图23是肾上腺连续切片图(连续切片，典型层面显微镜下放大50倍及100倍后的HE染色制片图)。

图24是淋巴结组织切片全图(HE染色制片图)。

图25是淋巴结组织连续切片图(连续切片，典型层面显微镜下放大50倍及100倍后的HE染色制片图)。

图26是对照组切片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施案例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所述乙醇溶液百分比例是体积百分比。

以下动物实验均经过医学伦理学会批准，使用的乙醇浓度均为体积百分比浓度。

下面的实施例将以小鼠卵巢及肾上腺组织为例，阐述一种创新的动物微小组织石蜡切片的制作方法。

以下实施例应用的主要材料/标本来源：小鼠的卵巢、肾上腺组织，小鼠淋巴结组织

以下实施例应用的主要试剂与主要设备：10V/V％中性甲醛(用PBS缓冲液和甲醛按照9:1的比例配制而成，即10％中性甲醛固定液)，95％乙醇，无水乙醇，脱蜡液，石蜡(熔点56～58℃)，Leica.EG1150生物组织包埋机1台，Leica.RM2245切片机l台，LeicaH1210水浴槽，H1220摊片机，眼科弯镊子等。刀片Leica.818宽刀片型号的刀片。钝化后的刀片：白蜡块切20-40次以后的刀片；或者刀片切白蜡块200-400μm以后的刀片(每次切片10μm)，其中实施例1-5、8-13中使用的刀片均为使用前，预先经过切白蜡块25次钝化处理的一次性切片刀(Leica.818宽刀片)。

实施例1制作小鼠卵巢石蜡切片

如图1-2、5、8-9、13、16-17、20-21所示，处死小鼠并解剖小鼠，正确识别小鼠卵巢组织并快速、完整取材，获得2枚小鼠卵巢组织，放入10％中性甲醛固定液中，固定48h。固定完成后，从固定液中取出小鼠卵巢组织置于广口瓶中，将瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出，实现对于微小组织的溢流冲洗。

溢流冲洗2h后，取出小鼠卵巢组织，在小鼠卵巢表面使用伊红染液进行标记，然后用拭镜纸进行包裹，得到微小组织包裹。包裹方法如下：擦镜纸用AF液或清水浸湿，用镊子将微小组织放在擦镜纸上。擦镜纸裁剪为4.5cm×3.5cm大小，按四折叠法进行折叠：按接近对角线方向折叠，但不要对齐，留一定的边缘便于包埋时打开，然后左右向中间折叠，上方向下折叠；折叠时用镊子轻轻压实特别是折痕处。

折叠包好后，放入微孔塑料包埋盒中盖好，然后在脱水缸中依次进行梯度脱水：65％乙醇20min，75％乙醇20min，85％乙醇脱水20min，95％乙醇脱水I次30min、95％乙醇脱水Ⅱ次30min、无水乙醇脱水I次30min、无水乙醇脱水Ⅱ次30min，两次透明处理(二甲苯第一次透明处理15min、二甲苯第二次透明处理20min)，放入软蜡中浸蜡(第一次浸蜡30min、第二次浸蜡30min、第三次浸蜡30min)。其中，软蜡是由石蜡和硬脂酸按照20：1重量比配制成软蜡溶液。

打开塑料包埋盒取出拭镜纸包裹的微小组织，置包埋机操作台热台上，左手持眼科弯镊子压住拭镜纸边缘，右手持眼科弯镊子按上述折叠的相反顺序打开拭镜纸(弯镊子应略微加热)，先在包埋模具中注入一半量熔化的蜡液。然后，将包埋模具置于冷台上，用一略加热的弯镊子将微小组织转移至包埋模具中。多块微小组织要相对集中放置，不能重叠，用加热的弯镊子轻轻按压微小组织使其在同一平面上，加盖塑料包埋盒，表面刚有点蜡膜时立即加注另一半熔化的蜡液。待蜡液完全凝固后去掉包埋模具。

采用轮转式切片机手动切片，具体操作方法如下：

①切片前应做好准备工作，如切片机上各部位螺旋是否拧紧，切片刀的角度是否合适等。创新点：使用钝化后的刀片进行切片，可将组织更加完整的切下且不易丢失。

②将包埋好的微小组织蜡块放入-20℃冰箱冷冻2min左右或放在-6℃冷冻台上冷冻3min。

③将微小组织蜡块放在切片机的样品夹头内旋紧固定好，调整好蜡块平面，使蜡块切面与切片刀平行，切片刀角度以5度为宜。

④修切：修切时要手、眼、耳并用，手在转动快进手轮时动作要轻柔，快进速度要缓慢，用力要均匀；眼要始终紧盯蜡块表面，看组织是否露出，是否到达理想切片面；耳要注意听声音，未修切到组织时声音沉闷，当修切到组织时声音清脆，呈“擦、擦、擦”清脆的悦耳声，当微小组织出现理想切面时开始切片。

⑤切片：连续切片，转动切片手轮时动作要轻柔，要匀速转动，切片厚度一般为3-4μm。直至将组织完全切下，制作连续切片。

展片与黏附：将蜡带轻轻摊于温水中(温度40℃左右)，选取5-10个切面黏附于载玻片的1/3处，60℃烤片机烤片。

⑥其余同常规，HE染色，根据诊断需要可进行特殊染色、免疫组织化学染色等。

实施例2制作小鼠肾上腺石蜡切片

如图3、6、8、10、14、16、18、22-23所示，按照本发明切片方法制作小鼠肾上腺石蜡切片。

S1、取材：正确识别小鼠肾上腺并快速、完整取材，一只小鼠有两个完整肾上腺组织。

S2、固定：将小鼠卵巢组织放入10％中性甲醛固定液中，固定48h；固定完成后，取出小鼠卵巢组织置于广口瓶中，将瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出冲洗小鼠卵巢组织。

S3、标记及包裹：冲洗完成后，在小鼠卵巢组织表面使用伊红染液进行标记；标记后使用拭镜纸进行包裹，得到微小组织包裹。

S4、脱水透明：将小鼠卵巢组织进行乙醇脱水：65％乙醇20min，75％乙醇20min，85％乙醇脱水20min，95％乙醇脱水I次30min、95％乙醇脱水Ⅱ次30min、无水乙醇脱水I次30min、无水乙醇脱水Ⅱ次30min。脱水处理完成后，连同所述带孔容器一起放入二甲苯中进行透明处理，使用二甲苯透明处理2次，每次20min，透明处理完成后，取出所述微小组织包裹。

S5、石蜡包埋：在包埋模具中注入熔化的蜡液；用热镊子开启微小组织包裹，并取出其中的小鼠卵巢组织放入包埋模具中，并用热镊子将微小组织一半压入蜡液中，整理多个微小组织排列整齐。然后，将包埋模具加盖，并继续注入熔化的蜡液；待蜡液完全凝固后，去掉包埋模具，将蜡块修边切成四棱台形状。

S6、切片：将四棱台形状的蜡块放在-6℃的冷冻台上冷冻3min，然后将蜡块放在切片机上固定牢固；使用钝化后的刀片进行连续切片，切片厚度控制在4μm，直至将组织完全切下。

S7、展片：切片完成后，将蜡带在40℃展片槽中展开；将切片黏附于载玻片上，将切片连同载玻片在60℃条件下进行烤片。

S8、染色：烤片完成后，进行染色，即得小鼠卵巢组织石蜡切片。

对比例1制作小鼠卵巢石蜡切片

采用和实施例2相同方法制作小鼠卵巢组织石蜡切片，区别仅在于：在脱水透明的过程中，采用80目筛网盖住微小组织。筛网盖住微小组织进行脱水透明，微小组织受压变形的情况未出现，但是在取出80目筛网的时候，微小组织在溶液中浮动，收集取出不便，需要花费大量时间寻找漂浮的微小组织。

实施例3制作小鼠卵巢石蜡切片

处死小鼠并解剖小鼠，正确识别小鼠卵巢组织并快速、完整取材，获得2枚小鼠卵巢组织，放入10％中性甲醛固定液中，固定48h。固定完成后，从固定液中取出小鼠卵巢组织置于广口瓶中，将瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出，实现对于微小组织的溢流冲洗作用。溢流冲洗10min后，取出小鼠卵巢组织，在小鼠卵巢表面使用伊红染液进行标记，然后使用拭镜纸进行包裹，得到微小组织包裹。

将微小组织包裹放入包埋盒中，盖上包埋盒盖子，进行乙醇梯度脱水处理：65％乙醇20min，75％乙醇20min，85％乙醇脱水20min，95％乙醇脱水I次30min、95％乙醇脱水Ⅱ次30min、无水乙醇脱水I次30min、无水乙醇脱水Ⅱ次30min。

脱水处理完成后，连同所述带孔容器一起放入二甲苯中进行透明处理，使用二甲苯透明处理2次，分别为20min。透明处理完成后，将微小组织从拭镜纸包裹中取出，放入软蜡中浸泡20min；所述软蜡是由硬脂酸和石蜡按照1:20重量比配制成软蜡溶液。

在包埋模具中注入熔化的蜡液。用镊子开启微小组织包裹，取出小鼠卵巢组织，放在包埋模具中蜡液上。并用略微加热的镊子略微将小鼠卵巢组织压入蜡液中，将多个微小组织整理整齐。在微小组织表面刚有点蜡膜时，立即加注另一半熔化的蜡液。然后，将包埋模具关闭，并继续注入熔化的蜡液；待蜡液完全凝固后，去掉包埋模具，将蜡块修边切成四棱台形状。

将四棱台形状的蜡块放在冷冻台上冷冻3min，然后将蜡块放在切片机上固定牢固；使用钝化后的刀片连续切片，切片厚度控制在4μm，直至将组织完全切下。切片完成后，将蜡带轻轻摊于温水中(温度40℃左右)；将切片黏附于载玻片上，将切片连同载玻片在60℃条件下进行烤片。然后，进行染色，即得动物微小组织石蜡切片。

实施例4制作小鼠卵巢石蜡切片

采用和实施例3相同方法制作小鼠卵巢组织石蜡切片，区别仅在于：石蜡包埋的时候，直接将小鼠卵巢组织放入包埋盒中，然后注入融化的石蜡。结果由于小鼠卵巢组织太小，在融化石蜡注入包埋盒的时候，直接被冲出了包埋盒，而没有被冲出包埋盒的微小组织也卡在包埋盒的缝隙中，仅仅部分完成浸蜡。

发明人尝试预先注入部分融化的石蜡，然后将微小组织放在预先注入的石蜡表面，然后再次注入融化的石蜡，情况得到一定改善，但还是有部分小鼠卵巢组织缺乏固定辅助，被融化的石蜡液冲散。因此，需要将微小组织预先固定起来，如果采用线材进行固定，微小组织太小，不容易操作固定。因此，最好是使用加热的镊子进行微小组织的布置，使得微小组织能够部分浸入预先注入的石蜡中，保持良好的稳定性，在后续继续注入融化的石蜡时不容易被冲散。

另外，使用加热的镊子将微小组织压入预先注入石蜡的时候，力量应当轻柔，避免微小组织变形。并且，压入的深度只能是局部，如果完全压入石蜡中，则容易出现石蜡和微小组织之间的气泡，影响最终的切片成型。

需要指出的是，加热的镊子将微小组织压入预先注入的石蜡以后，当微小组织表面出现蜡膜的时候进行后续融化的石蜡注入，更好的保证石蜡和微小组织表面完成结合紧密，不存在任何空气间隙或气泡。

实施例5-7制作小鼠肾上腺石蜡切片

参考实施例3相同方法制作小鼠肾上腺微小组织石蜡切片，摘取小鼠肾上腺，石蜡切片制作方法区别仅在于：使用轮转式切片机进行切片的时候，尝试使用不同的刀片：全新刀片、切过白石蜡块25次的刀片、切过白石蜡块40次的刀片，每次刀片切过白蜡块10μm，连续切20-40次，比较不同的使用强度得到刀片的性能。经过比较发现，使用的刀片对于切片的质量有显著影响。

实施例	刀片	刀痕数	切片品质
				5	全新刀片	5	切片完整但有刀痕
6	切过白石蜡25次的刀片	0	切片完整且清晰
				7	切过白石蜡40次的刀片	1	切片完整，偶有刀痕

主要表现为全新刀片进行切片的时候，平均大约每2－3个切片中会有一个切片存在刀痕的问题。使用全新刀片切片得到具有刀痕的切片样本如图26所示，出现刀痕的切片表现为显微镜下观察的时候，可以看到明显的褶皱变形，导致切片不连续，不利于观察。

当使用钝化后，切过白石蜡25次左右的刀片的时候，切片的连续性和稳定性表现较好，可以保证所有的切片均不出现刀痕或褶皱。对于微小组织切片进行三维立体结构重现具有重要意义。所以，建议刀片优选使用钝化后的刀片，如使切过白蜡块20-35次的刀片。

实施例8-13制作小鼠肾上腺石蜡切片

参考实施例3相同方法制作小鼠肾上腺微小组织石蜡切片，摘取小鼠肾上腺，石蜡切片制作方法区别仅在于：包埋微小组织的石蜡块没有经过冷冻处理，直接将四棱台形状的蜡块放在轮转式切片机上，固定牢固，然后进行切片。切片过程中发现，石蜡块的强度不足，容易出现变形，导致内部的微小组织在切片刀切过的时候，无法保持连续的结构形貌。

这是因为微小组织本身体积较小，在切片的时候需要依赖于包埋微小组织的石蜡提供充分的支撑。所以，将包埋好的石蜡块使用冰箱或冷冻台进行适当的冷冻处理，可以保证石蜡块的结构强度适宜，进而让刀片切过微小组织的时候，获得完整连续的切片。

然后，进一步的尝试冷冻时间不同的情况下，石蜡块可切性。具体的，将石蜡块放入冰箱冷冻30秒、1min、3min、5min、10min。

实施例	冷冻处理	切片效果
			8	未冷冻	切片组织不完整
9	30秒	切片组织欠完整
			10	1min	切片连续、组织完整
11	3min	切片连续、组织完整
			12	5min	组织欠完整，阻力大
13	10min	阻力大切片不连续

结果显示，冷冻时长在1-3min范围内的时候，石蜡块可切割性能最优，而冷冻时间超过10min以后，反而不利于切片的加工，切片阻力过大，不利于切片的完整性和连续性。

实施例14制作小鼠卵巢石蜡切片

参考实施例3相同方法制作小鼠卵巢微小组织石蜡切片，摘取小鼠卵巢，石蜡切片制作方法区别仅在于：溢流冲洗10min后，取出小鼠卵巢组织，在小鼠卵巢表面使用伊红染液进行标记，然后，未进行包裹，直接进行投入乙醇溶液进行乙醇梯度脱水处理。结果，在更换乙醇溶液的过程中，丢失多个小鼠卵巢微小组织。最后，制作得到的微小组织石蜡病理切片的时候，仅部分较大的小鼠卵巢微小组织得到保留，切片效果不佳。

实施例15制作小鼠卵巢石蜡切片

采用和实施例3相同方法制作小鼠卵巢微小组织石蜡切片。取得5个小鼠10个卵巢组织，平均长径2-4mm，区别仅在于：中性甲醛固定完成后，直接用清水冲洗2min，未采用溢流冲洗处理。结果发现，常规冲洗，小鼠卵巢微小组织丢失多个，需要特别小心操作。

然后，在微小组织表面使用伊红染液进行标记，标记完成后，不采用拭镜纸进行包裹。脱水透明的时候，由于不采用擦镜纸进行包裹，结果发现微小组织容易起浮，后使用不锈钢网将微小组织压入乙醇溶液中，确保微小组织充分浸没于溶液中。使用二甲苯透明处理的时候，同样使用不锈钢网将微小组织压入溶液中。最终，在完成脱水透明以后，实际仅回收6个小鼠卵巢组织，并且在回收过程中反复检查寻找，耗费大量时间。

另外，由于不锈钢网对于微小组织形成特殊压力，导致部分微小组织变形，不满足后续制作切片要求。变形的微小组织不能获得清晰的石蜡切片结构。

实施例16制作小鼠淋巴结石蜡切片

如图4、7、11-12、15、16、19、24-25所示，采用和实施例1相同方法制作小鼠淋巴结微小组织石蜡切片，制作过程参数相同实施例1相同，得到的淋巴结组织连续切片，选取典型层面显微镜下放大拍照如图24-25所示，组织结构清晰完整，符合切片研究观察要求。

本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。引用的任何参考文献不应认为是允许这些参考文献可以用来作为本申请的“现有技术”。

Claims (8)

1.一种动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取材：正确识别动物微小组织并快速、完整取材；

S2、固定：将动物微小组织放入中性甲醛固定液中，固定24h-48h；固定完成后，进行溢流冲洗；

所述溢流冲洗是指：取出动物微小组织置于广口瓶中，将瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出，实现对于微小组织的冲洗作用；

S3、标记及包裹：冲洗完成后，在微小组织表面使用伊红染液进行标记；标记后使用拭镜纸进行包裹，得到微小组织包裹；

S4、脱水透明：将微小组织包裹放入带孔容器中，关闭带孔容器盖子；连同带孔容器一起放入乙醇溶液中，进行乙醇梯度脱水处理；

脱水处理完成后，连同所述带孔容器一起放入二甲苯中进行透明处理；透明处理完成后，取出所述微小组织包裹；

S5、石蜡包埋：在包埋模具中注入熔化的蜡液；用镊子开启微小组织包裹，并取出其中的微小组织，将微小组织放入包埋模具中，然后将包埋模具加盖，并继续注入熔化的蜡液；待蜡液完全凝固后，去掉包埋模具，将蜡块修边切成四棱台形状；

S6、切片：将四棱台形状的蜡块冷冻，然后将蜡块放在切片机上固定牢固；连续切片，切片厚度控制在3-4μm，直至将组织完全切下；

切片过程中，使用钝化处理的刀片进行切片；

所述钝化处理的刀片是指：切过白蜡块200-400µm厚后的刀片，每次切片10µm；或者切白蜡块20次-40次的刀片；

S7、展片：切片完成后，将切片展入温度为40℃的展片水槽中，待组织展平，将切片黏附于载玻片上，将切片连同载玻片在60-65℃条件下进行烤片；

S8、染色：烤片完成后，进行染色，即得动物微小组织石蜡切片。

2.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，所述微小组织是指长径小于5mm的动物组织。

3.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，溢流冲洗流量为0.1-2L/min。

4.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，所述拭镜纸预先剪裁成矩形，经过折叠包裹所述微小组织。

5.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤S4中，乙醇梯度脱水处理是指：用65%-100%乙醇按照乙醇浓度逐渐升高的方式进行脱水处理。

6.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤S5中，在包埋机操作台的热台上，取出微小组织，用温度60-65℃的热镊子将微小组织转移到预先注入的蜡液上。

7.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，将蜡块冷冻方法如下：将四棱台形状的蜡块放入-20℃±3℃的冰箱冷冻1-3min，或者将蜡块放在-6℃±3℃的冷冻台上冷冻1-5min。

8.根据权利要求1所述动物微小组织石蜡切片制作方法，其特征在于，切片过程中，切面与切片刀相切；切片刀角为5-10度。

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