CN103954484A - 一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，包括①样品固定、②脱水与透明程序、③透蜡和包埋、④切片和展片、⑤染色与封片，其特征在于：将步骤①中的样品包埋于经固定液预处理的豆制品中，与现有技术相比，本发明的优点在于：将豆制品可以作为中华鳖胚胎期性腺组织的预包埋材料，其来源广泛且成本很低，经过预包埋后，胚胎期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影响后续的组织包埋和切片，本发明避免了传统方法的不足，特别是避免了中华鳖早期性腺组织小不容易操作和观察的缺点；另外，由于预包埋性腺的位置固定并且可以一次处理多个性腺组织，这样有利于大规模进行切片制作和分析，也特别适合于针对不同个体进行的研究。

Description

一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法。

背景技术

爬行动物的原始生殖细胞，经过分化、迁移进入生殖嵴或原始性腺分化成生殖细胞，而原始生殖细胞的起源要追溯到胚胎早期发育阶段，不同动物原始生殖细胞进入生殖嵴的迁移方式不同，在生殖嵴(生殖腺原基)发生时，原始生殖细胞在生殖嵴中进行分化，原始生殖细胞在迁移过程中不断分裂增殖，随胎龄增长，性别发生分化，生殖嵴分化为雄性的睾丸或雌性的卵巢，原始生殖细胞形成精子或卵子。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳖，隶属脊椎动物亚门(Vertebtata)、爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)，广泛分布于我国除宁夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以长江流域和华南地区为多见，是我国养殖最广泛的水生爬行动物，具有重要的经济和药用价值；国外分布于日本、朝鲜和越南。中华鳖营养丰富，肉味鲜美，又是珍贵的药材，其成分含动物胶、角蛋白、维生素D及碘等，具有滋阴清热，平肝益肾、破结软坚及消淤功能。鳖头、甲、肉、胆、血等可入药。研究中华鳖原始生殖细胞的起源、迁移以及性腺分化发育的机制，可为中华鳖的生产活动尤其是雄性化苗种选育提供可靠的理论依据和技术指导。

但是，由于中华鳖自孵化开始，至最初的原始生殖细胞开始迁移、生殖嵴形成、性腺开始分化、精巢或卵巢形成，分别需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期以及出壳后3月之内，雌性和雄性性腺在外形上非常相似，难以用肉眼来判断。因此，用组织学方法就成为了一种简单而可靠的研究手段。另外，中华鳖胚胎早期性腺分化和性别决定的机理研究还少有报道。因此，通过常规石蜡组织切片的方法为详尽研究中华鳖胚胎早期性腺分化和性别决定提供了可靠的条件。但由于中华鳖早期性腺体积微小，采用传统的石蜡切片操作过程中，通常会出现如下问题：(1)性腺组织颜色浅，在组织透明后更加不易被观察到，很容易丢失；(2)操作过程中容易使性腺损伤，从而破坏了性腺的完整性；（3）性腺组织体积小，不容易操作。为了解决这些问题，就需要对传统的石蜡切片技术作进一步的改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种方法简单易行并能够最大程度地保持性腺的完整性的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，包括①样品固定、②脱水与透明程序、③透蜡和包埋、④切片和展片、⑤染色与封片，其特征在于：将步骤①中的样品包埋于经固定液预处理的豆制品中。

具体地，所述豆制品的预处理包括如下步骤：先将豆制品进行切块处理，切成厚度为3mm～2cm的方型平板状，然后再切成截面积为0.5cm²～6cm²的细条，用固定液固定6h～96h后在0.1%～10%的盐酸溶液中浸泡0.5h～96h，最后在流水中冲洗后浸泡于50%～80%的酒精溶液中。

进一步地，所述步骤①～⑤的具体处理如下：

①样品固定：收集中华鳖胚胎发育中后期胚胎的性腺-中肾-肾上腺的复合体，将取出的复合体立即投入到固定液中固定，固定0.5h～24h之后转移到50%～80%酒精溶液中保存；

②脱水与透明程序：将步骤①的中华鳖性腺预包埋于经固定液预处理的豆制品中并用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇浸泡1min～60min、80%乙醇浸泡1min～60min、90%乙醇浸泡30s～30min、100％乙醇浸泡1min～60min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理20s～40min，再用二甲苯浸泡处理20s～40min，使之透明；

③透蜡和包埋：用体积比为1:1的二甲苯：石蜡过渡处理30s～10min，56℃～70℃熔点的石蜡透蜡20min～40min，2次；将脱水透蜡后的组织样品进行包埋；

④切片和烤片：用切片机切片，切片厚度控制在4μm～15μm，经35℃～45℃水浴中进行展片，载玻片捞片后放置于35℃～40℃烤片机上进行烤片固定；

⑤染色与封片：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色10s～5min伊红染色5s～5min；然后用中性树胶封片。

在进行所述步骤⑤染色之前还进行脱蜡复水，其中脱蜡步骤具体为：先用二甲苯浸泡1min～15min，再用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理1min～3min；复水步骤具体为：先后采用100%乙醇浸泡30s～30min、90%乙醇浸泡30s～30min、70%乙醇浸泡30s～30min、50%乙醇浸泡30s～30min、最后用流水冲洗。

进一步地，所述的苏木精染液配方为：1g苏木精溶于100mL无水乙醇中，20g明矾溶于200mL蒸馏水中，两液混合，加热沸腾3min，稍冷却加入0.51g氧化汞，溶解后即得到苏木精染液。

进一步地，所述的伊红染液为1％的伊红溶液，用70％乙醇溶解。

进一步地，所述步骤①固定液为4%的多聚甲醛、福尔马林或波恩氏液。

作为优选，所述豆制品为硬度较高的豆腐或素鸡。

与现有技术相比，本发明的优点在于：将豆制品作为中华鳖胚胎早期性腺组织的预包埋材料，其来源广泛且成本很低，经过预包埋后，胚胎早期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影响后续的组织包埋和切片。本发明避免了传统方法的不足，特别是避免了中华鳖早期性腺组织小不容易操作和观察的缺点；另外，由于预包埋性腺的位置固定并且可以一次处理多个性腺组织，这样有利于大规模进行切片制作和分析，也特别适合于针对不同个体进行的研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中包埋于豆腐中的中华鳖性腺的图片；

图2为本发明实施例1中性腺组织被完整地包埋进豆腐中的切片；

图3为本发明实施例1中豆腐中的一个孔穴和在该孔穴性腺组织的切片；

图4为图3中央部分的局部放大图；

图5为图4中央部分的放大图；

图6为本发明实施例1中豆腐基质的HE染色图。

具体实施方式

以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。

首先配制苏木精染液、伊红染液和福尔马林、波恩氏固定液。

苏木精染液：先称取钾明矾20g溶于200mL蒸馏水中，边加热边搅拌，再称取苏木精1.0g溶于10mL无水乙醇，边加热边搅拌，待钾明矾和苏木素溶解后，混和二溶液，加热至沸腾(89-91℃)，然后称取0.51g HgO缓缓加入沸腾的混合液中，边加入边搅拌使溶解，以防产生大量气泡，最后待溶解后使其稍降温置于冷水中，有少许HgO结晶，使用前滤纸过滤，避光保存。

伊红酒精染液：将1g伊红溶于99mL70％的乙醇中即得到伊红染液。

福尔马林溶液：量取甲醛100mL，加入磷酸二氢钠6.5g，溶解后加蒸馏水补足1000mL。

波恩氏液：苦味酸饱和水溶液液75mL，甲醛(37%～40％)25mL，冰醋酸5mL，混合。

4%多聚甲醛：按100mL配比为：多聚甲醛4g，0.1M PBS(pH=7.4)80mL，加热至60℃水浴溶解，边搅拌边滴加1M NaOH2mL溶液至澄清，之后添加1M HCl2mL左右，调节pH值后定容为100mL。(现用现配以防多聚甲醛聚合)

实施例1

1、豆制品的预处理和固定

豆制品采用硬度较高的豆腐，大块豆腐先进行切块处理，切成厚度为1cm的方型平板状，之后再切成截面积大约1cm²的细条，轻轻交叉堆叠放置于可密封塑料盒中。用4%的多聚甲醛固定液固定6h，之后在1%的盐酸溶液中浸泡0.5h，在流水中冲洗后浸泡于70%的酒精溶液中。

2、成型和打孔

把预处理好的条状豆制品切成合适的厚度，用硬质毛细管进行打孔处理，其中孔的大小可以用不同直径和形状的毛细管或管状物进行控制，管壁不要追求切割的圆滑，不规则的形状有利于后期对性腺的固定。

3、中华鳖胚胎期性腺的分离和预包埋

取中华鳖胚胎，用眼科剪刀打开腹腔后，用镊子取出“性腺-中肾-肾上腺”复合物，在组织固定5h后置于70%酒精溶液中短期存放，用装上洗耳球的毛细管穿过打孔后的豆制品，在挤压洗耳球后，吸取性腺组织，之后把毛细管向后回抽。性腺组织在通过孔穴时受到孔壁的挤压，此时释放性腺组织。这样性腺组织就被包埋进豆制品中。在组织的投放中，注意性腺摆放的方向和深浅，尽量保证性腺所处的位置一致(如图1)，图1为包埋于豆腐中的中华鳖性腺，从图1我们可以看到性腺组织可以被完整地包埋进豆制品中。

4、石蜡组织切片的制作和观察

①脱水与透明程序：将包埋于豆腐中的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇浸泡20min、80%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡10min、100％乙醇浸泡10min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理20min，再用二甲苯浸泡处理20min，使之透明；

②透蜡和包埋：用体积比为1:1的二甲苯：石蜡过渡处理30s，60℃熔点的石蜡透蜡20min，2次；将脱水透蜡后的组织样品进行包埋；

③切片和烤片：用切片机切片，切片厚度控制在10μm，经40℃水浴中进行展片，载玻片捞片后放置于35℃烤片机上进行烤片固定；

④脱蜡复水：先用二甲苯浸泡3min，再用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理2min；复水步骤具体为：先后采用100%乙醇浸泡10min、90%乙醇浸泡10min、70%乙醇浸泡10min、50%乙醇浸泡10min、最后用流水冲洗。

⑤染色、封片与观察：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色2min伊红染色3min；然后用中性树胶封片，封片时轻压盖玻片赶出树胶内气泡，注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片或使样品移位，影响观察，待样片风干后用刀片刮去多余的树胶。染色后的结果见图2～6所示，从图2～6我们可以看到性腺组织的切片组织保持完整，并且从图6可以看出豆腐的染色背景均一。

实施例2

1、豆制品的预处理和固定

豆制品采用硬度较高的素鸡，大块素鸡先进行切块处理，切成厚度为2cm的方型平板状，之后再切成截面积大约2cm²的细条，轻轻交叉堆叠放置于可密封塑料盒中。用福尔马林固定液固定24h，之后在7%的盐酸溶液中浸泡5h。在流水中冲洗后浸泡于80%的酒精溶液中。

2、成型和打孔

把预处理好的条状豆制品切成合适的厚度，用硬质毛细管进行打孔处理，其中孔的大小可以用不同直径和形状的毛细管或管状物进行控制，管壁不要追求切割的圆滑，不规则的形状有利于后期对性腺的固定。

3、中华鳖胚胎期性腺的分离和预包埋

取中华鳖胚胎，用眼科剪刀打开腹腔后，用镊子取出“性腺-中肾-肾上腺”复合物，在组织固定10h后置于80%酒精溶液中短期存放，用装上洗耳球的毛细管穿过打孔后的豆制品，在挤压洗耳球后，吸取性腺组织，之后把毛细管向后回抽。性腺组织在通过孔穴时受到孔壁的挤压，此时释放性腺组织。这样性腺组织就被包埋进豆制品中。在组织的投放中，注意性腺摆放的方向和深浅，尽量保证性腺所处的位置一致。

4、石蜡组织切片的制作和观察

①脱水与透明程序：将包埋于素鸡中的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇浸泡30min、80%乙醇浸泡30min、90%乙醇浸泡20min、100％乙醇浸泡20min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理30min，再用二甲苯浸泡处理30min，使之透明；

②透蜡和包埋：用体积比为1:1的二甲苯：石蜡过渡处理10min，70℃熔点的石蜡透蜡40min，2次；将脱水透蜡后的组织样品进行包埋；

③切片和烤片：用切片机切片，切片厚度控制在6μm，经37℃水浴中进行展片，展平后用载玻片捞片，然后放置于40℃烤片机上进行烤片固定；

④脱蜡复水：先用二甲苯浸泡3min，再用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理3min；复水步骤具体为：先后采用100%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、70%乙醇浸泡20min、50%乙醇浸泡20min、最后用流水冲洗。

⑤染色、封片与观察：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色3min伊红染色2min；然后用中性树胶封片，封片时轻压盖玻片赶出树胶内气泡，注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片或使样品移位，影响观察，待样片风干后用刀片刮去多余的树胶。

实施例3

在豆制品的预处理和固定的步骤中用波恩氏液固定，其余步骤与实施例1相同。

Claims (8)

1.一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，包括①样品固定、②脱水与透明程序、③透蜡和包埋、④切片和展片、⑤染色与封片，其特征在于：将步骤①中的样品包埋于经固定液预处理的豆制品中。

2.根据权利要求1所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述豆制品的预处理包括如下步骤：先将豆制品进行切块处理，切成厚度为3mm～2cm的方型平板状，然后再切成截面积为0.5cm²～6cm²的细条，用固定液固定6h～96h后在0.1%～10%的盐酸溶液中浸泡0.5h～96h，最后在流水中冲洗后浸泡于50%～80%的酒精溶液中。

3.根据权利要求1所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述步骤①～⑤的具体处理如下：

①样品固定：收集中华鳖胚胎发育中后期胚胎的性腺-中肾-肾上腺的复合体，将取出的复合体立即投入到固定液中固定，固定0.5h～24h之后转移到50～80%酒精溶液中保存；

②脱水与透明程序：将步骤①的中华鳖性腺预包埋于经固定液预处理的豆制品中并用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇浸泡1min～60min、80%乙醇浸泡1min～60min、90%乙醇浸泡30s～30min、100％乙醇浸泡1min～60min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理20s～40min，再用二甲苯浸泡处理20s～40min，使之透明；

③透蜡和包埋：用体积比为1:1的二甲苯：石蜡过渡处理30s～10min，56℃～70℃熔点的石蜡透蜡20min～40min，2次；将脱水透蜡后的组织样品进行包埋；

④切片和烤片：用切片机切片，切片厚度控制在4μm～15μm，经35℃～45℃水浴中进行展片，载玻片捞片后放置于35℃～40℃烤片机上进行烤片固定；

⑤染色与封片：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色10s～5min伊红染色5s～5min；然后用中性树胶封片。

4.根据权利要求3所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：在进行所述步骤⑤染色之前还进行脱蜡复水，其中脱蜡步骤具体为：先用二甲苯浸泡1min～15min，再用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理1min～3min；复水步骤具体为：先后采用100%乙醇浸泡30s～30min、90%乙醇浸泡30s～30min、70%乙醇浸泡30s～30min、50%乙醇浸泡30s～30min、最后用流水冲洗。

5.根据权利要求3所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述的苏木精染液配方为：1g苏木精溶于100mL无水乙醇中，20g明矾溶于200mL蒸馏水中，两液混合，加热沸腾3min，稍冷却加入0.51g氧化汞，溶解后即得到苏木精染液。

6.根据权利要求3所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述的伊红染液为1％的伊红溶液，用70％乙醇溶解。

7.根据权利要求1所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述步骤①固定液为4%的多聚甲醛、福尔马林或波恩氏液。

8.根据权利要求1所述的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述豆制品为硬度较高的豆腐或素鸡。