CN110274807B - 一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，步骤如下：甲醛固定后组织的脱水处理、组织包埋、冷冻切片、染色与封片。本发明提供的方法，针对经甲醛固定后的南美白对虾性腺组织的冷冻切片技术，区别于新鲜组织的冷冻切片技术。相对于传统的石蜡切片方法，具有更高的切片效率，节约了时间。相比于一般的冷冻切片方法，具有更好的切片效果，有利于染色观察。
Description
技术领域
本发明涉及一种冷冻切片的制作方法，更具体地说它涉及一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法。
背景技术
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称南美白对虾，隶属十足目（Deeapoda），对虾科（Penaeidae），滨对虾属（Litopenaeus），原产于中南美洲秘鲁到墨西哥的太平洋沿岸，是世界对虾养殖业的主导品种，1988年作为中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的替代种引入中国，由于凡纳滨对虾具有生长速度快、养殖周期短、养殖适应性强等优势，2000年以后养殖面积迅速扩大，目前已经是中国水产养殖的支柱产业之一。
传统的冷冻切片技术主要应用于切新鲜组织，而通过甲醛将样品固定后，采用石蜡切片技术进行切片，需要花费较多的时间，效率不高，采用的冷冻切片技术对甲醛固定后的样品进行切片染色虽然效率较高，但是往往切片效果又不好，因此本发明开发了针对甲醛固定后样品切片染色的方法，不但效率较好，而且染色效果也好。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明在于提供一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，具有更高的切片效率以及更好的切片效果。
为实现上述目的，本发明如下技术方案：一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，步骤如下：
(1) 甲醛固定后组织的脱水处理：取南美白对虾卵巢组织，固定于10%甲醛溶液中备用，再用手术刀片切取长度为0.5-1.0 cm的卵巢组织，浸泡在20%蔗糖溶液与OCT冷冻包埋剂体积为1:1的液体，浸泡时间至少16个小时；
(2) 组织包埋：将步骤（1）中浸泡好的卵巢组织取出，放入盛放OCT冷冻包埋剂的圆柱形软管模型中，用镊子夹取模型在液氮中速冻15-20 s，然后放进冷却好的冷冻切片机中，去除模型后得到样品，将样品用OCT冷冻包埋剂固定在预冷过的样品托上，放在速冻架上等待包埋剂完全冷冻；
(3) 冷冻切片：调节冷冻切片机冷冻箱温度为-18 ℃，样品头温度为-15 ℃，将样品托插入样品头，调整好样品与刀片的位置，先用修块模式进行修块使包埋的卵巢组织露出，后调至切片模式，将切片厚度调为5 μm，进行切片；
(4) 切片固定：将步骤(3)切好的薄片用镊子或样品针捻于载玻片上，用甲醇固定，将载玻片在甲醇中浸泡5-10s，晾干后放进染色架中。
(5) 染色：将步骤(4)中得到的组织切片先用苏木素染液染色1.5 min，然后用水冲洗5 min；再在分化液分化30 s；接着在水中浸泡15 min或50℃温水浸泡5 min；然后置于伊红染液1 min，染色后用水冲洗；水中浸泡5min，脱水后使之透明，进行封片。
本发明进一步设置为，脱水与封片的具体步骤如下：将载玻片先后分别置于95%乙醇Ⅰ溶液、95%乙醇Ⅱ溶液、100%乙醇Ⅰ溶液、100%乙醇Ⅱ溶液、二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液中浸泡1 min；最后用中性树胶封固。
本发明进一步设置为，所述冷冻切片机型号为Leica CM1950。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：针对经甲醛固定后的南美白对虾性腺组织的冷冻切片技术，区别于新鲜组织的冷冻切片技术。相对于传统的石蜡切片方法，具有更高的切片效率，节约了时间。相比于一般的冷冻切片方法，具有更好的切片效果，有利于染色观察。
附图说明
图1是本实施例图1 性腺组织的冷冻切片过程图；
图2 卵巢组织冷冻切片后HE染色效果图。
具体实施方式
以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，步骤如下：
(1) 甲醛固定后组织的脱水处理：取南美白对虾卵巢组织，固定于10%甲醛溶液中备用，再用手术刀片切取长度为0.5-1.0 cm的卵巢组织，浸泡在20%蔗糖溶液与OCT冷冻包埋剂体积为1:1的液体，浸泡时间至少16个小时；
(2) 组织包埋：将步骤（1）中浸泡好的卵巢组织取出，放入盛放OCT冷冻包埋剂的圆柱形软管模型中，用镊子夹取模型在液氮中速冻15-20 s，然后放进冷却好的冷冻切片机中，去除模型后得到样品，将样品用OCT冷冻包埋剂固定在预冷过的样品托上，放在速冻架上等待包埋剂完全冷冻；
(3) 冷冻切片：调节冷冻切片机冷冻箱温度为-18 ℃，样品头温度为-15 ℃，将样品托插入样品头，调整好样品与刀片的位置，先用修块模式进行修块使包埋的卵巢组织露出，后调至切片模式，将切片厚度调为5 μm，进行切片；
(4) 切片固定：将步骤(3)切好的薄片用镊子或样品针捻于载玻片上，用甲醇固定，将载玻片在甲醇中浸泡5-10s，晾干后放进染色架中。
(5) 染色：将步骤(4)中得到的组织切片先用苏木素染液染色1.5 min，然后用水冲洗5 min；再在分化液分化30 s；接着在水中浸泡15 min或50℃温水浸泡5 min；然后置于伊红染液1 min，染色后用水冲洗；水中浸泡5min，脱水后使之透明，进行封片。
本实施例中，脱水与封片的具体步骤如下：将载玻片先后分别置于95%乙醇Ⅰ溶液、95%乙醇Ⅱ溶液、100%乙醇Ⅰ溶液、100%乙醇Ⅱ溶液、二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液中浸泡1min；最后用中性树胶封固。
本实施例中，所述冷冻切片机型号为Leica CM1950。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的设计构思之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，其特征在于，步骤如下：
（1）甲醛固定后组织的脱水处理：取南美白对虾卵巢组织，固定于10%甲醛溶液中备用，再用手术刀片切取长度为0.5-1.0cm的卵巢组织，浸泡在20%蔗糖溶液与OCT冷冻包埋剂体积为1:1的液体，浸泡时间至少16个小时；
（2）组织包埋：将步骤（1）中浸泡好的卵巢组织取出，放入盛放OCT冷冻包埋剂的圆柱形软管模型中，用镊子夹取模型在液氮中速冻15-20s，然后放进冷却好的冷冻切片机中，去除模型后得到样品，将样品用OCT冷冻包埋剂固定在预冷过的样品托上，放在速冻架上等待包埋剂完全冷冻；
（3）冷冻切片：调节冷冻切片机冷冻箱温度为-18℃，样品头温度为-15℃，将样品托插入样品头，调整好样品与刀片的位置，先用修块模式进行修块使包埋的卵巢组织露出，后调至切片模式，将切片厚度调为5μm，进行切片；
（4）切片固定：将步骤(3)切好的薄片用镊子或样品针捻于载玻片上，用甲醇固定，将载玻片在甲醇中浸泡5-10s，晾干后放进染色架中;
（5）染色：将步骤(4)中得到的组织切片先用苏木素染液染色1.5min，然后用水冲洗5min；再在分化液分化30s；接着在水中浸泡15min或50℃温水浸泡5min；然后置于伊红染液1min，染色后用水冲洗；水中浸泡5min，脱水后使之透明，进行封片。
2.根据权利要求1所述的一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，脱水与封片的具体步骤如下：将载玻片先后分别置于95%乙醇Ⅰ溶液、95%乙醇Ⅱ溶液、100%乙醇Ⅰ溶液、100%乙醇Ⅱ溶液、二甲苯Ⅰ溶液、二甲苯Ⅱ溶液中浸泡1min；最后用中性树胶封固。
3.根据权利要求1所述的一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法，其特征在于，所述冷冻切片机型号为Leica CM1950。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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