CN101650273B

CN101650273B - 一种海洋贝类卵细胞石蜡切片方法

Info

Publication number: CN101650273B
Application number: CN2009101013440A
Authority: CN
Inventors: 董迎辉; 林志华
Original assignee: Zhejiang Wanli College
Current assignee: Ninghai Marine Biological Seed Industry Research Institute of Zhejiang Wanli University
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: CN101650273A

Abstract

本发明涉及到一种海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等步骤，其特点是克服了贝类卵子体积小而难以浸蜡和包埋的问题，改进了苏木精-伊红染色方法，获得了良好的切片和染色效果。本方法简单易行，毋需增加仪器设备，可对直径≥40微米的大多数海洋贝类的卵细胞进行石蜡切片，其中脱水、透明、透蜡步骤间均有过渡步骤，多为两步处理，使试剂逐渐完全地进入组织，完好地保存组织的原有结构，为贝类受精及早期胚胎发育研究提供了有效的研究手段。

Description

一种海洋贝类卵细胞石蜡切片方法

技术领域

本发明涉及到一种石蜡切片的方法，具体讲是一种适用于卵径较小的海洋贝类卵细胞石蜡切片方法。

背景技术

石蜡切片技术是受精细胞学的重要研究手段之一，其技术成熟、方法稳定、造价低廉、观察方便，且有组织结构保存完好、获得图像对比清晰等优点，可在光镜下清晰地看到受精卵外部形态和内部结构的变化，尤其是纺锤体的消长和两性原核结合时的核膜变化，具有不同于压片、透射电镜和荧光显微术的独特优势。石蜡切片技术已被广泛用于鱼类受精细胞学研究中。然而，由于多数贝类的卵子个体微小，尤其是双壳贝类，卵径一般仅几十微米，如栉孔扇贝卵径70μm左右，文蛤80～90μm，菲律宾蛤仔71～85μm，而近江牡蛎、宽壳全海笋的卵径仅有40～50μm，如此小的卵子，肉眼不易看清，给脱水、透蜡、包埋等过程带来很大不便。

理论上讲，石蜡切片的厚度可达5～8μm，而一个几十微米的卵子也能被切成数片。只要卵量大、切片和染色效果好，就能找到方向合适的卵子的切面，从而观察到染色体和纺锤体的变化情况，系统研究不同发育阶段的核行为，为受精及早期胚胎发育机理的深入研究和细胞工程育种提供基础资料。但是，传统的石蜡切片技术尚未解决卵子小而带来的诸多困难，所以目前用石蜡切片技术来研究双壳贝类受精过程的报道很少，而能获得分裂相清晰、染色效果好的方法介绍还尚未见到。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种针对海洋贝类卵细胞相对微小的特点，提供一种分裂相清晰、染色效果好的海洋贝类卵细胞石蜡切片方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其特征在于包括下述步骤：

①样品固定：将不同发育阶段的卵细胞连同海水转移至离心管中，然后缓慢加入冷的Bouin氏液将样品固定20-40min，待样品自然沉降或低速离心后，除去上清液，加入新的Bouin氏液，如此更换Bouin氏液2-3次，然后转移入70％酒精中，置4℃冰箱中保存；

②卵细胞预处理：向盛有卵细胞的离心管中加入几滴1％的伊红染液，染色1～2分钟，使卵细胞表面被染成粉红色，便于肉眼识别；用细针在称量纸上刺些小孔，用称量纸将染色后的卵细胞包起来，以使卵子在处理时不会漏出；

③脱水与透明程序：将用称量纸包好的卵细胞置于脱水机或染色缸中，用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇脱水50分钟、85％乙醇脱水50分钟2次、95％乙醇脱水45分钟2次、100％乙醇脱水45分钟2次；然后用1∶1(体积比)的无水乙醇/二甲苯过渡处理25分钟，再用二甲苯处理20分钟2次，使之透明；

④透蜡和包埋：用1∶1(体积比)的二甲苯/石蜡过渡处理40分钟，52～56℃熔点的石蜡透蜡1小时2次；打开纸包，将卵子置于包埋盒中，使卵子均匀地分布于包埋盒中部，然后加注融蜡进行包埋；

⑤切片和烤片：用生物切片机切片，切片厚度5μm，蜡带用40℃恒温水浴展片，贴于事先涂有粘片剂的载玻片上，然后在烤片机上烘干；

⑥染色与封片：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色6～8分钟，伊红染色1.5～2分钟；然后用中性树胶封片。

上述方法中，所述的Bouin氏液配方可以为：苦味酸饱和液75mL，甲醛25mL，冰醋酸5mL。

所述的苏木精染液配方可以为：2g苏木精溶于250mL无水乙醇中，10g硫酸铝溶于750mL水中，两液混合，加热沸腾3分钟，稍冷却加入碘酸钠0.5g，柠檬酸1.0g，溶解后即得到苏木精染液。

所述的伊红染液配方可以为：1g伊红溶于99mL 70％乙醇中。

与现有技术相比较，本发明的优点在于：

1、通过简单的预染色和纸包处理，克服了海洋贝类卵子微小带来的操作不便；

2、操作简单，毋需增加专门的仪器，便于推广应用；

3、脱水、透明、透蜡程序间均有过渡步骤，程序内多为两步处理，使试剂逐渐完全地进入组织，完好地保存组织的原有结构；

4、采用改进的伊红-苏木精染色，获得的卵子切片清晰、对比度大，便于观察。

附图说明

图1为本发明实施例1中文蛤卵子及二细胞期胚胎切片，其中，

A.文蛤成熟未受精卵，示染色体(CHS)、纺锤体(SD)；

B.第二次成熟分裂中期，示第一极体(PB1)；

C.两性原核形成期，示第二极体(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN)；

D.二细胞期，示卵裂沟(CF)；

图2为本发明实施例2是宽壳全海笋受精卵及二细胞期胚胎切片，其中，

A.第二次成熟分裂中期，示第一极体(PB1)、纺锤体(SD)、精核(SN)；

B.两性原核形成期，示第二极体(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN)；

C.第一次卵裂后期，示染色体(CHS)；

D.二细胞期，示染色体(CHS)、卵裂沟(CF)。

具体实施方式

以下附图结合实施例对本发明作进一步详细描述。

首先配制Bouin氏固定液、苏木精染液和伊红染液。

Bouin氏固定液：取苦味酸饱和液75mL、甲醛25mL和冰醋酸5mL，混合均匀得到Bouin氏固定液；

苏木精染液：将2g苏木精溶于250mL无水乙醇中，10g硫酸铝溶于750mL水中，两液混合，加热沸腾3分钟，稍冷却加入碘酸钠0.5g和柠檬酸1.0g，溶解后即得到苏木精染液；

伊红染液：将1g伊红溶于99mL 70％的乙醇中即得到伊红染液。

实施例1

1、样品固定：取山东群体文蛤，在浙江温州的省海洋水产养殖研究所清江科研基地进行催产和胚胎发育研究。取不同发育阶段的文蛤卵细胞于5mL的离心管中，受精0-60min每隔5min取样一次，60-120min，每隔10min取样一次，缓慢加入冷的Bouin氏固定液2-3mL，固定30分钟，待样品沉降后，更换二次固定液；用Bouin氏液固定5小时后，移入70％酒精中，置4℃冰箱保存。

2、卵细胞预处理：向盛有卵细胞的离心管中加入2滴1％的伊红染液，染色1-2分钟，使卵细胞表面被染成粉红色；取正方形的称量纸，用细针在纸上刺些小孔，然后将纸折好，把染色后的卵细胞包起来，保证卵子不会漏出。

3、脱水与透明程序：将包好的卵细胞置于染色缸中，用梯度乙醇脱水，采用70％乙醇脱水50分钟、85％乙醇脱水50分钟2次、95％乙醇脱水45分钟2次、100％乙醇脱水45分钟2次；透明前，用无水乙醇∶二甲苯(体积比1∶1)过渡处理25分钟，然后用二甲苯20分钟2次透明。

4、透蜡程序和包埋：用二甲苯∶石蜡(体积比1∶1)过渡处理40分钟，56℃熔点的石蜡透蜡1小时2次；将纸包打开，用尖头镊子将卵子置于包埋盒中，并使卵子均匀地分布于包埋盒中部，然后加注融蜡进行包埋。

5、切片和烤片：采用金华益迪YD-1508A型切片机连续切片，切片厚度5μm，蜡带用40℃恒温水浴展片，贴于事先涂有粘片剂的载玻片上，烤片机烘干即可染色；

6、染色与封片：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中苏木精染色8分钟，伊红染色1.5分钟；然后用中性树胶封片。

7、观察拍照与受精细胞学研究：在Nikon E-600显微镜的油镜下(×1000)观察，CCD拍照。观察结果表明，文蛤成熟未受精卵呈卵圆形，卵径90μm左右，核相处于第一次成熟分裂中期，受精后5-10min，精子进入卵内并明显膨胀，激活卵子启动两次成熟分裂；在受精后20min、30min，先后排出第一、第二极体；受精后40-45min，受精卵分裂成2个大小不等的卵裂球；受精后55-60min，分裂为4细胞；受精后80-90min，分裂为8细胞。发育过程中出现了多精入卵和多极分离现象。该文蛤卵细胞石蜡切片清晰、对比度大、观察方便。

实施例2

取温州洞头县海区的宽壳全海笋亲贝。受精后固定不同发育时期的受精卵，由于宽壳全海笋卵子直径仅40-50μm，更换固定液容易损失，所以固定卵量应该大些，用离心机低速离心来加速沉降。

相比较实施例1，称量纸上用针刺的孔应小些，以减少脱水、透明、透蜡等过程中卵子的损失。

其余未涉及部分与实施例1相同。

观察制得的宽壳全海笋卵细胞的石蜡切片，结果表明，宽壳全海笋成熟未受精卵核相处于第一次成熟分裂前期，有明显的生发泡和核仁；受精后6-9min，生发泡逐渐萎缩、破裂；受精后20min、30min，受精卵先后排出第一、第二极体；受精后50min，受精卵分裂成2个大小不等的卵裂球；受精后65-70min，分裂为4细胞。实验中也发现了少量的多精入卵和多极分离现象。

Claims

1.一种海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其特征在于包括下述步骤：

①样品固定：先用冷的Bouin氏液将样品固定20-40min，待样品自然沉降或低速离心后，用吸管除去上清液，至少更换二次Bouin氏液，然后再用Bouin氏液固定5小时后，移入70％酒精中，置4℃冰箱中保存；

②卵细胞预处理：向盛有卵细胞的离心管中加入几滴1％的伊红染液，染色1-2分钟；用细针在称量纸上刺些小孔，然后用称量纸将染色后的卵细胞包起来，以使卵细胞在处理时不会漏出；

③脱水与透明程序：将用称量纸包好的卵细胞置于脱水机或染色缸中，用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇脱水50分钟、85％乙醇脱水50分钟2次、95％乙醇脱水45分钟2次、100％乙醇脱水45分钟2次；然后用体积比为1∶1的无水乙醇：二甲苯过渡处理25分钟，再用二甲苯处理20分钟2次，使之透明；

④透蜡和包埋：用体积比为1∶1的二甲苯：石蜡过渡处理40分钟，52～56℃熔点的石蜡透蜡1小时2次；将纸包打开，将卵细胞置于包埋盒中，加注融蜡进行包埋；

2.根据权利要求1所述的海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其特征在于所述的Bouin氏液配方为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合溶液，三者的体积比冰醋酸∶甲醛∶苦味酸饱和液为1∶5∶15。

3.根据权利要求1所述的海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其特征在于所述的苏木精染液配方为：2g苏木精溶于250mL无水乙醇中，10g硫酸铝溶于750mL水中，两液混合，加热沸腾3分钟，稍冷却加入碘酸钠0.5g，柠檬酸1.0g，溶解后即得到苏木精染液。

4.根据权利要求1所述的海洋贝类卵细胞的石蜡切片方法，其特征在于所述的伊红染液为1％的伊红溶液，用70％乙醇溶解。