CN103868779A - 甜菜胚珠切割透明制片方法 - Google Patents

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刘丽萍
王艳
孙元
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Abstract

甜菜胚珠切割透明制片方法，涉及一种胚珠切割透明制片方法。本发明是要解决现有观察甜菜胚囊的方法处理量大，费时、费力的问题。方法：一、取样及固定；二、整体染色；三、用解离液解离，再用蒸馏水冲洗；四、把解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割；五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴透明剂，再滴硼砂洋红染色液，静置；六、制片。该方法快速省时，极大的减少了工作量，实验效果良好，成本低，易于操作。本发明方法用于观察甜菜胚囊。

Description

甜菜胚珠切割透明制片方法
技术领域
本发明涉及一种胚珠切割透明制片方法。
背景技术
从胚胎学角度观察植物胚囊的变化以了解其发生机制，是植物学中常用的方法。被子植物的雌配子体也称胚囊，甜菜胚囊位于子房及胚珠多层细胞的包围之中，甜菜胚珠是厚珠心（6-7层），给研究大孢子母细胞发生发育的工作带来很大的难度。
石蜡切片法是研究植物胚囊最常用的方法之一，效果好，可是工作量极大且实验周期较长。该方法包埋材料完整，为了观察胚囊的发育情况，找到大孢子母细胞，需要连续切片、费时费力，往往选一张好的制片需要淘汰成千上万张制备好的切片，工作量极大，给实验带来了不小的难度。
发明内容
本发明是要解决现有观察甜菜胚囊的方法处理量大，费时、费力的问题，提供一种甜菜胚珠切割透明制片方法。
本发明甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行：
一、取样及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4℃冰箱中备用，其中每100mL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
二、整体染色：将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4～5d，染色后用溶液A浸泡5～8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
三、然后用解离液解离，解离时间为5～10min，再用蒸馏水冲洗2～3次；
四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2～3min；
六、制片：胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
本发明的有益效果：
（1）本发明方法是利用解剖镜直接剥离胚囊分离胚珠，并将分离出来的胚珠进行再次切割，只保留珠孔端一小部分进行制片，胚珠其余大部分被废弃掉，大大减少了视野下胚珠体细胞的数量，增加了观察大孢子母细胞的准确度，极大的减少了工作量，更易于找到大孢子母细胞。
（2）本发明的方法简便易行，不用太多仪器设备，解剖镜和普通光学显微镜即可进行分离和观察。
（3）本发明的方法所用的解离液比酶解法用的果胶酶、纤维素酶成本低得多，盐酸、酒精1:1即可达到解离目的，且解离效果好，有效降低了实验成本。
（4）本发明方法的效果好，易于操作和掌握，降低了制片难度，提高了工作效率，省时省力。
此方法也同样适用于万寿菊（Tagetes erecta L）、矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）等其它花卉植物。
附图说明
图1为实施例中观察到的甜菜大孢子母细胞照片；图2为实施例中观察到的甜菜的单核胚囊照片；图3为实施例中观察到的甜菜二核胚囊的早期照片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行：
一、取样及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4℃冰箱中备用，其中每100mL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
二、整体染色：将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4～5d，染色后用溶液A浸泡5～8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
三、然后用解离液解离，解离时间为5～10min，再用蒸馏水冲洗2～3次；
四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2～3min；
六、制片：胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二所述溶液A的配制方法为：每100mL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入9～11微升质量分数为37%的盐酸。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为：首先取2～3g洋红粉末加到100mL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤五所述透明剂为乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。其它与具体实施方式一至四之一相同。
实施例：
本实施例甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行：
一、取样及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4℃冰箱中备用，其中每100mL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
二、整体染色：将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为5d，染色后用溶液A浸泡5分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
三、然后用解离液解离，解离时间为8min，再用蒸馏水冲洗3次；
四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置3min；
六、制片：胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
步骤二所述溶液A的配制方法为：每100mL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入10微升质量分数为37%的盐酸。
步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为：首先取2g洋红粉末加到100mL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。
步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。
步骤五所述透明剂为乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。
按照本实施例的方法可以清晰观察到甜菜胚囊发育的各个阶段：单核期胚囊（大孢子母细胞）、二核期胚囊（此时胚囊中分化出一个大液泡）、成熟胚囊具有7胞8核：中部含有2个极核的中央细胞、株孔端有3个核组成的卵器、核点端的3个核形成反足细胞。成熟胚囊的两个极核靠近卵器，反足细胞分化成多细胞团。
在普通光学显微镜下观察到的甜菜大孢子母细胞如图1所示，甜菜的单核胚囊如图2所示，甜菜二核胚囊的早期照片如图3所示。
使用本实施例的方法观察大孢子母细胞，快速省时，极大的减少了工作量，实验效果良好，成本低，易于操作。

Claims (5)

1.甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、取样及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4℃冰箱中备用，其中每100mL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
二、整体染色：将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4～5d，染色后用溶液A浸泡5～8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
三、然后用解离液解离，解离时间为5～10min，再用蒸馏水冲洗2～3次；
四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2～3min；
六、制片：胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
2.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤二所述溶液A的配制方法为：每100mL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入9～11微升质量分数为37%的盐酸。
3.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为：首先取2～3g洋红粉末加到100mL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。
4.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。
5.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤五所述透明剂为乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。
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