CN103674662B - 鱼类初期胚胎发育的dapi染色方法 - Google Patents

鱼类初期胚胎发育的dapi染色方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法，其特征在于：所述的方法按如下步骤进行：受精10min后开始取卵，每10 min取10‑20个受精卵，取样到四细胞期,用多聚甲醛固定液固定24 h；将固定后的受精卵换入到PBS中浸泡，并在36h后更换一次PBS，于4℃冷藏；取冷藏卵放入事先加入PBS的培养皿中，去除卵膜和植物极，并将动物极放入装有PBS的离心管中，避光；吸出离心管中的PBS，向离心管中加入Tween20和5μg/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的体积比为1：100，将离心管放入摇床中进行染色10‑30min。

Description

鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法
技术领域
本发明涉及一种胚胎染色方法，特别是一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法。
背景技术
在水产养殖领域中，很多不同性别的重要经济鱼类往往会表现出不同的生产性能，如体型和体色的差异，生长速度的快慢，性成熟时间的不同等。所以，通过雌、雄核发育控制鱼类的性别，选择具有最佳生长性能的雌、雄性进行单性养殖，具有极为重要的应用价值。
在水产动物中人工诱导雌、雄核发育已有不少成功的报道，尤其是近几年国内外一些学者在贝类雌、雄发育发生机理、细胞学机制等方面取得了一系列的进展。但关于鱼类雌、雄核发育的细胞学机制的报道都是通过受精细胞学切片和胚胎发育观察，该方法操作繁琐、染色体行为不够清晰。因此现在需要一种能够帮助研究人员观察胚胎发育过程以达到人工诱导雌、雄核发育目的的方法。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种操作简单、快捷，能够帮助研究人员在荧光显微镜下清晰观察的鱼类早期胚胎发育的DAPI染色方法。
本发明的技术解决方案是：一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法，其特征在于：所述的方法按如下步骤进行：
a. 受精10min后开始取卵，每10 min取10-20个受精卵，取样到四细胞期,用多聚甲醛固定液固定24 h;
b. 将固定后的受精卵换入到PBS中浸泡，并在36h后更换一次PBS，于4℃冷藏;
c. 取冷藏卵放入事先加入PBS的培养皿中，去除卵膜和植物极，并将动物极放入装有PBS的离心管中，避光，
d. 吸出离心管中的PBS，向离心管中加入Tween20和5μg/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的体积比为1：100，将离心管放入摇床中进行染色10-30min。
所述的PBS为：100ml蒸馏水中含有NaCl 8g , Na2HPO412H2O 3g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g。
所述的多聚甲醛固定液是将利用PBS稀释至2%的戊二醛和多聚甲醛按照1:1的体积比混合后获得的。
所述的DAPI染色剂为DAPI母液和缓冲液按照体积比为1:5的比例混合获得，所述DAPI母液是将10mgDAPI溶在1000ml的蒸馏水中得到的，所述缓冲液为：100ml蒸馏水中含有0.12414gTris-HCl、0.37225g EDTA-2Na及0.5844g NaCl，且缓冲液的pH=7.4。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本发明公开了一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法，该染色方法操作简单、快捷，能够帮助研究人员在荧光显微镜下能清晰的观察到正常卵子与雄核发育卵子在减数分裂、受精过程和卵裂早期中的核相变化。该方法相比与传统的受精细胞学切片和胚胎发育观察等方法，更加简便、快捷，且成本低廉，是研究鱼类雌雄核发育细胞学机制的一种快速而行之有效的方法，因此可以说它具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景和科研前景均十分广阔。
附图说明
图1是本发明实施例DAPI染色的（2n♀× 4n♂）泥鳅雄核发育早期胚胎发育 (第二极体释放、雄性原核及卵裂) 观察的图片。
图2是对照组（2n♀× 4n♂）泥鳅早期胚胎发育(第二极体释放、雌、雄性原核结合及卵裂)观察的图片。
具体实施方式
下面将结合附图说明本发明实施例的具体实施方式，如图1、图2所示：一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法，按如下步骤进行：
在受精10min后开始取卵，每10 min取10-20个受精卵，取样到四细胞期为止，用多聚甲醛固定液将受精卵固定24 h，这里所使用的多聚甲醛固定液是将经过PBS稀释至2%的戊二醛和多聚甲醛，按照1:1的体积比混合后获得的；
将固定后的受精卵从多聚甲醛固定液中取出，放入到PBS中浸泡，并在36h后更换一次PBS，于4℃冷藏，这里所使用的PBS为：100ml蒸馏水中含有NaCl 8g , Na2HPO412H2O 3g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g。
将冷藏卵放入事先加入PBS的培养皿中，去除卵膜和植物极，并将动物极放入装有PBS的离心管中，并对离心管做避光处理；
将离心管中的PBS吸出，向离心管中加入Tween20和5μg/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的体积比为1：100，将离心管放入摇床中进行染色10-30min，即完成动物极的染色，这里所使用的DAPI为DAPI母液和缓冲液按照体积比为1:5的比例混合而成，所述DAPI母液是将10mgDAPI溶在1000ml的蒸馏水中所获得的，所述缓冲液的组成为：100ml蒸馏水中含有0.12414gTris-HCl、0.37225g EDTA-2Na及0.5844g NaCl，配置完成后将缓冲液的酸碱度调节至pH=7.4。

Claims (1)

1.一种鱼类初期胚胎发育的DAPI染色方法，其特征在于：所述的方法按如下步骤进行：
a.受精10min后开始取卵，每10min取10-20个受精卵，取样到四细胞期,用多聚甲醛固定液固定24h；所述的多聚甲醛固定液是将利用PBS稀释至2%的戊二醛和多聚甲醛按照1:1的体积比混合后获得的，
b.将固定后的受精卵换入到PBS中浸泡，并在36h后更换一次PBS，于4℃冷藏；所述的PBS为：100ml蒸馏水中含有NaCl8g,Na2HPO4 ·12H2O 3g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g;
c.取冷藏卵放入事先加入PBS的培养皿中，去除卵膜和植物极，并将动物极放入装有PBS的离心管中，避光;
d.吸出离心管中的PBS，向离心管中加入Tween 20和5μg/ml的DAPI染色液，且Tween 20和DAPI染色液的体积比为1：100，将离心管放入摇床中进行染色10-30min；所述的DAPI染色剂为DAPI母液和缓冲液按照体积比为1:5的比例混合获得，所述DAPI母液是将10mg DAPI溶在1000ml的蒸馏水中得到的，所述缓冲液为：100ml蒸馏水中含有0.12414g Tris-HCl、0.37225g EDTA-2Na及0.5844g NaCl，且缓冲液的pH=7.4。
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用DAPI染色法观察红鲫胚胎发育;张纯等;《激光生物学报》;20110831;第20卷(第4期);第554页 *

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