CN104232575A - 水牛睾丸间质细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法，在体外成功分离出水牛睾丸间质细胞。3β-HSD染色表明，该法获得的水牛睾丸间质细胞纯度较高。本发明的方法精确、高效，是一套较适合水牛睾丸间质细胞体外分离培养的体系，可为水牛供体细胞核移植及相关研究提供材料来源和技术平台。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法。
背景技术
动物组织细胞体外培养，即将活体动物的某一组织结构从动物体内取出，然后把它放在与体内生长环境相类似的培养液中培养，使其继续生长和繁殖的一个过程，认为将其分为组织培养、器官培养、细胞培养等。其中，细胞培养强调的是，在体外培养的过程中只能是细胞形式而不能够形成组织，并且一般的细胞培养都是某种单一细胞的培养，这就要求操作人员首先要对目的细胞的形态、生长特点、特异性等有一定的了解。19世纪末，德国的动物学家Wilhelm Roux将鸡胚髓板组织在温热的生理盐水中放置数天，仍然可以存活下来。随后，分别在1887年、1897年、1903年又有学者在蛙、兔、蝾螈的组织上做了类似的实验，均使动物组织细胞在体外成功存活一段时间。组织细胞体外培养技术一经建立，便得到了飞速发展，如今，人们已经能够在体外成功培养出各种动物的多种细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种精确、高效的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，获得的水牛睾丸间质细胞纯度较高。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法在体外分离出水牛睾丸间质细胞。
上述水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)水牛睾丸除去白膜，取黄豆大小的组织并剪碎，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗后加入消化液在摇床中震荡消化；
(2)将步骤(1)所得的混合物转移至50ml离心管中，加入等量DMEM/F12无血清细胞培养液终止反应，静置数分钟；
(3)将步骤(2)所得上层溶液用70μm细胞筛过滤悬液，将此细胞悬液离心，弃上清，用DMEM/F12无血清细胞培养液重复清洗两次，最后一次用37℃预热完全培养基清洗并制成单细胞悬液；
(4)将步骤(3)所得的单细胞悬液进行Percoll不连续密度梯度离心，然后将睾丸间质细胞条带吸出；
(5)将步骤(4)所得水牛睾丸间质细胞悬液用DMEM/F12无血清细胞培养液稀释成1×106/mL，接种在6cm细胞培养皿里，接种4mL每皿，放入培养箱培养，条件为5％CO2，95％O2，37℃，最大饱和湿度，6h后，更换DMEM/F12无血清细胞培养液以取得纯度较高的间质细胞。
步骤(1)中震荡消化37℃恒温、30min-40min、100r/min，所用消化液是按照体积比1:2加入2mL0.1％胶原酶IV和4mL DMEM/F12细胞培养液(不含血清)的混合液。
步骤(3)中细胞悬液离心采用1300r/min，5min；所述完全培养基由DMEM培养基添加10％胎牛血清制成。
步骤(4)中Percoll不连续密度梯度离心的条件为：Percoll密度梯度1.090g/ml、1.080g/ml、1.065g/ml、1.045g/ml，每个梯度加入2ml，高速低温冷冻离心机水平转子4℃，4000r/min，60min；所述睾丸间质细胞条带在1.080g/ml密度梯度处。
由于水牛睾丸体积大、组织坚韧因而缺乏成熟有效的组织细胞分离培养方法，为此，发明人建立了一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法，在体外成功分离出水牛睾丸间质细胞。3β-HSD染色表明，该法获得的水牛睾丸间质细胞纯度较高。本发明的方法精确、高效，是一套较适合水牛睾丸间质细胞体外分离培养的体系，可为水牛供体细胞核移植及相关研究提供材料来源和技术平台。
附图说明
图1是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(刚分离出时)的显微镜观察图。
图2是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后6小时)的显微镜观察图。
图3是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后第3天)的显微镜观察图。
图4是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后第96天)的显微镜观察图。
图5是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞3β-HSD染色后的显微镜观察图。
具体实施方式
以下所用试剂及药品除特别说明外，均购自美国Sigma公司；其中DMEM粉剂、青霉素、链霉素购自美国GIBCO公司，胰蛋白酶IV和Percoll细胞分离液购自中国索莱宝公司。试验所用仪器，二氧化碳培养箱购自美国Thermo Forma公司，体视显微镜购自日本Nikon公司，低速自动平衡离心机购自北京医用离心机厂。
主要溶液配制
PBS缓冲液的配制：将NaCL 4g，KCL 0.1g，KH2PO4 0.135g，Na2HPO4 0.71g，青霉素0.033g，链霉素0.05g，溶解于300mL亚沸水中，并加亚沸水定容至500mL，0.22μm滤器过滤，分装，4℃保存。
DMEM(细胞培养液)的配制：DMEM粉剂13.5g，NaHCO3 3.7g，溶于800mL亚沸水中，溶解之后，继续加200mL亚沸水定容至1L，磁力搅拌器助溶。调整pH 7.0-7.2，0.22μm滤器过滤，分装，常用4℃保存，长期可保存于-20℃。
完全培养基的配置：DMEM培养基添加10％胎牛血清制成完全培养基。
0.1％胶原酶IV的配制：取PBS 100m L，将胶原酶IV 100mg，溶于其中，磁力搅拌器助溶。0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存，4℃一周保存。
Percoll各密度梯度的配制：加9份(v/v)的Percoll到1份(v/v)的1.5MNaCl中制备成Stock Isotonic Percoll(SIP)溶液，然后再用1.5M NaCl稀释，分别将SIP溶液稀释不同浓度(如表1)。
表1不同浓度Percoll液的稀释
取一只10mL离心管，每个Percoll浓度取2mL，按浓度由高到低的顺序极其缓慢的加入离心管中，加盖，小心移到4℃冰箱过夜静置，以稳定Percoll界面。
实施例1
从屠宰场取回成年水牛睾丸，为避免污染，应用75％酒精浸泡消毒5min，然后置于无菌平皿中，加4℃预冷的含双抗PBS全面冲洗睾丸2-3次。
(1)取出眼科剪、镊子等将睾丸表面的一层致密结缔组织即白膜去除，暴露出睾丸实质部分，PBS重新清洗睾丸实质2-3次，用眼科剪剪取一小部分组织(尽量去除毛细血管，尽量减少曲细精管的断裂)，并剪成黄豆大小(约1mm3)，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗直到组织发白，将适量沉淀移入无菌青霉素瓶中，加入消化液在摇床中震荡消化(37℃恒温、30min-40min、100r/min)；所用消化液是按照体积比1:2加入2mL0.1％胶原酶IV和4mL DMEM/F12细胞培养液(不含血清)的混合液。
(2)肉眼观察组织形态变化，当曲细精管松散但无明显断裂时即刻终止反应，收集步骤(1)所得的消化混合物转移至50ml离心管中，加入等量DMEM/F12无血清细胞培养液终止反应，静置数分钟。
(3)将步骤(2)所得上层溶液用70μm细胞筛过滤悬液，将此细胞悬液离心(1300r/min，5min)，弃上清，用DMEM/F12无血清细胞培养液重复清洗两次，最后一次用37℃预热完全培养基清洗并制成单细胞悬液。
(4)从4℃冰箱取出已配制好的不连续密度梯度Percoll液(从下至上Percoll离心液的密度分别为1.090g/ml、1.080g/ml、1.065g/ml、1.045g/ml)，取制备好的细胞悬液2mL沿管壁缓慢添加到Percoll液面上，每个梯度加2mL，高速低温冷冻离心机水平转子4℃，4000r/min，60min。离心后Percoll液面上会出现不同的细胞条带，用枪头小心将间质细胞条带(密度1.080g/ml处)取出。
(5)将步骤(4)所得水牛睾丸间质细胞悬液用DMEM/F12无血清细胞培养液稀释成1×106/mL，接种在6cm细胞培养皿里，接种4mL每皿，放入培养箱培养，条件为5％CO2，95％O2，37℃，最大饱和湿度培养箱培养，6h后，更换DMEM/F12无血清细胞培养液，隔夜换液。
结果：倒置显微镜下观察发现，刚分离的水牛睾丸间质细胞呈圆形、透亮、折光性较强(图1)；6h后观察，细胞形态并无明显变化，轻微移动培养皿不晃动(图2)；第3天时发现细胞大部分铺展开，形成多角形或者菱形，折光性减弱(图3)；将细胞继续培养，细胞出现大面积的拉网状现象(图4)。
(6)将步骤(5)所得水牛睾丸间质细胞用3β-HSD染色，用细胞计数板对水牛睾丸间质细胞计数。活细胞比率＝[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×100％。
结果：因为在睾丸的整个组织中，只有间质细胞含有3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)，所以只有间质细胞才能被3β-HSD染色，呈现蓝色或深蓝色。经统计，间质细胞的阳性率高达90％以上(图5)。
Claims (5)
1.一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法在体外分离出水牛睾丸间质细胞。
2.根据权利要求1所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)水牛睾丸除去白膜，取黄豆大小的组织并剪碎，用磷酸缓冲液PBS冲洗后加入消化液在摇床中震荡消化；
(2)将步骤(1)所得的混合物转移至50ml离心管中，加入等量DMEM/F12无血清细胞培养液终止反应，静置数分钟；
(3)将步骤(2)所得上层溶液用70μm细胞筛过滤悬液，将此细胞悬液离心，弃上清，用DMEM/F12无血清细胞培养液重复清洗两次，最后一次用37℃预热完全培养基清洗并制成单细胞悬液；
(4)将步骤(3)所得的单细胞悬液进行Percoll不连续密度梯度离心，然后将睾丸间质细胞条带吸出；
(5)将步骤(4)所得水牛睾丸间质细胞悬液用DMEM/F12无血清细胞培养液稀释成1×106/mL，接种在6cm细胞培养皿里，接种4mL每皿，放入培养箱培养，条件为5％CO2，95％O2，37℃，最大饱和湿度，6h后，更换DMEM/F12无血清细胞培养液以取得纯度较高的间质细胞。
3.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(1)中震荡消化37℃恒温、30min-40min、100r/min，所用消化液是按照体积比1:2加入2mL0.1％胶原酶IV和4mL DMEM/F12细胞培养液的混合液。
4.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(3)中细胞悬液离心采用1300r/min，5min；所述完全培养基由DMEM培养基添加10％胎牛血清制成。
5.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(4)中Percoll不连续密度梯度离心的条件为：Percoll密度梯度1.090g/ml、1.080g/ml、1.065g/ml、1.045g/ml，每个梯度加入2ml，高速低温冷冻离心机水平转子4℃，4000r/min，60min；所述睾丸间质细胞条带在1.080g/ml密度梯度处。
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