CN108192858B - 一种制备禽类睾丸间质细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞分离纯化领域；更具体地，本发明涉及一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，所述方法包括以下步骤：用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。本发明的制备禽类睾丸间质细胞的方法可以获得细胞量大且纯度高的睾丸间质细胞，操作过程简单规范，对细胞损伤较小，且有效地减少了细胞污染。

Description

一种制备禽类睾丸间质细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞分离纯化领域。更具体地，本发明涉及一种制备禽类睾丸间质细胞的方法。

背景技术

睾丸间质细胞(Leydig cell,LC)分布于睾丸曲细精管间隙中，是合成和分泌雄激素的主要场所。睾丸间质细胞分泌的睾酮占动物体内睾酮总量的96％左右。由于睾酮与靶器官受体结合后可发挥诸多重要的生理功能，所以睾丸间质细胞作为分泌睾酮最主要的细胞，其分离培养技术越来越受到人们的重视。因此，建立一套稳定高效便捷的睾丸间质细胞的原代细胞分离、培养和纯化的方法，对深入研究睾丸间质细胞相关功能具有重要意义。

睾丸间质细胞的分离培养研究在哺乳动物诸如猪、羊等以及啮齿类动物大鼠、小鼠中较为常见，技术相对比较成熟，而在禽类的研究较少。目前禽类睾丸间质细胞分离方法基本与啮齿类动物相似，均采用Percoll连续密度梯度离心法分离收集睾丸间质细胞。本发明人前期也采用Percoll法在种公鸡中做了类似的预试验，结果表明，种公鸡的睾丸间质细胞主要集中在30～60％Percoll层中，但单只种公鸡的一对睾丸所获得的细胞在Percoll层中的量很少，且活率、纯度很低。

综上，本领域亟需一种简单快速的制备禽类睾丸间质细胞的方法，该方法所获得的禽类睾丸间质细胞，不仅数量大，而且纯度高。建立这样的方法，可解决构建保持雄激素分泌活性的细胞模型，为研究种用家禽生殖生理的分子机制及睾丸间质细胞相关功能提供良好的试验平台。

发明内容

如上所述，在本领域中，对于哺乳动物睾丸间质细胞，已经开发出了成熟的分离和纯化技术，然而对于禽类睾丸间质细胞的分离和纯化，当前的方法所分离出来的睾丸间质细胞纯度不够高，并且也相对比较繁琐，不够简便、快捷。

为解决上述问题，本发明人经过反复研究，开发出了一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，该方法不仅简便、快捷，而且所获得的睾丸间质细胞数量多、纯度高。

因此，本发明提供了一种制备睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：

a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；

b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；

c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。

本发明的方法与现有的家禽睾丸间质细胞分离培养方法相比，具有以下有益效果：目前，对睾丸生殖细胞的分离培养多以Percoll连续密度梯度离心法和胰蛋白酶消化法或二者结合为主，有文献报道采用Percoll梯度分离液分离家禽睾丸间质细胞，经离心后可得到较纯的睾丸间质细胞，但获得的细胞总量较少。本发明前期也做了类似的预试验，但结果表明，Pecoll梯度离心法费时费力，经长时间离心会导致大量细胞死亡。且家禽的睾丸间质细胞在Percoll层中数量极少，细胞纯度较低，单只公鸡获得的一对睾丸经分离培养获得的原代睾丸间质细胞无法满足试验需要，耗费试验材料。然而，通过采用本发明方法，可以使细胞活率达到96.08％，纯度达到97.73％。因此，本发明的方法为深入研究禽类睾丸间质细胞的相关功能提供良好的细胞工作平台。

附图说明

图1示出原代睾丸间质细胞的照片(100×)；

图2示出第三代睾丸间质细胞的照片(100×)；

图3示出3β-HSD染色后的第三代睾丸间质细胞的照片(100×)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的实施方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求来进行限定。

如上所述，在本领域中，对于哺乳动物睾丸间质细胞，已经开发出了成熟的分离和纯化技术。然而，对于禽类睾丸间质细胞的分离和纯化，当前的方法所分离出来的睾丸间质细胞纯度不足够高，并且当前的方法也相对比较繁琐，不够简单、便捷。

因此，本发明提供了一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：

a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；

b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；

c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。

在本发明方法中，所谓禽类包括任何繁殖用雄性禽类，例如种公鸡、种公鸭、种公鹅、种公鸽、种公鹑等，但不限于此。在一个具体实施方案中，所述禽类是指种公鸡。

任选地，在采用胶原酶对睾丸组织进行消化之前，即在进行步骤a)之前，需要对睾丸组织进行预处理，以使胶原酶消化更为顺利和彻底。具体地，在获得睾丸之后，需要首先去除睾丸白膜、血管以及可见的曲细精管；然后将睾丸切成细小碎块，例如1mm³的细小碎块。

随后，需要采用胶原酶对睾丸组织进行消化，即进行步骤a)。在一个实施方案中，在步骤a)中使用的胶原酶可以是任何类型的适合消化睾丸组织的胶原酶，例如I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶和IV型胶原酶。在本发明中，优选地，采用II型胶原酶来消化睾丸组织。

优选地，在对睾丸组织进行消化之前，将所述胶原酶温育一段时间，例如，在37℃温育30分钟，由此使得胶原酶能最好地发挥其消化功能。

在一个实施方案中，所述胶原酶的浓度为0.8-1.2mg/mL；优选地，所述胶原酶的浓度为1mg/mL。

在一个实施方案中，胶原酶消化液和睾丸组织之间的重量比为3:1至8:1。优选地，胶原酶液和睾丸组织之间的重量为5:1。

在一个实施方案中，所述消化持续20-40分钟；优选地，所述消化持续25-30分钟。

优选地，在消化结束之后、但在差速离心之前，可以对得到的细胞悬液进行过滤，例如通过使消化得到的细胞悬液过滤通过细胞筛，如200目(75μm)的细胞筛，由此将未去除的其他组织、或尚未被消化的睾丸组织、或消化后的细胞团块与经消化获得的单细胞悬液相分离，由此实现更好的睾丸间质细胞的分离。

在通过上述方式获得细胞悬液之后，采用差速离心法来对该细胞悬液进行离心，由此分离出睾丸间质细胞。换言之，随后进行本发明方法的步骤b)。

在一个实施方案中，所述差速离心法包括至少三次离心，其中第一次离心的离心速度为800-1200rpm，持续3-8分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟。

在一个优选的实施方案中，所述第一次离心的离心速度为1000rpm，持续5分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。

在一个进一步优选的实施方案中，所述差速离心法进一步包括第四次离心，并且第四次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟。更优选地，所述第四次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。

任选地，在步骤b)中，在每次离心并弃去上清之后，额外地包括除去(例如通过移液器枪头除去)明显的血细胞沉淀。

在通过上述的步骤b)获得睾丸间质细胞之后，继续通过差速贴壁法来对该细胞进行富集，即进行本发明方法的步骤c)。

所述差速贴壁法包括至少三次细胞培养，其中第一次细胞培养持续24-48小时；第二次细胞培养和第三次细胞培养分别持续24-36小时。

在一个优选的实施方案中，所述第一次细胞培养持续48小时，第二次细胞培养和第三次细胞培养分别持续24小时。

任选地，在所述第三次细胞培养之后还可以进行进一步的后续细胞培养，以进一步富集睾丸间质细胞。所述后续细胞培养的培养时间同第二次细胞培养或第三次细胞培养的培养时间。

在一个实施方案中，所述第一次细胞培养、第二次细胞培养和第三次细胞培养以及任选的后续细胞培养在37℃、5％CO₂条件下进行。

在一个实施方案中，所述第一次细胞培养、第二次细胞培养和第三次细胞培养以及所述任选的后续细胞培养采用DMEM/F12培养基，其中所述DMEM/F12培养基含有以体积计10％的胎牛血清。

在一个实施方案中，在所述第一次细胞培养中，接种细胞密度为3×10⁶-8×10⁶个细胞/mL，优选为5×10⁶个细胞/mL；在所述第二次细胞培养、所述第三次细胞培养以及所述任选的后续细胞培养中，接种细胞密度为1×10⁵-2×10⁵个/mL，优选1×10⁵个/mL。

本发明的方法与现有的禽类睾丸间质细胞分离培养方法相比，其更为简单、便捷；并且可以获得数量更多、纯度更高的禽类睾丸间质细胞，从实施例中给出的结果可以看出，本发明方法可以使得细胞活率达到96.08％，纯度达到97.73％。可见，本发明方法可以为深入研究禽类睾丸间质细胞的相关功能提供良好的细胞工作平台。

下面结合实施例和附图对本发明进行更详细的阐释。

实施例

实施例1.睾丸间质细胞的分离培养

一.睾丸组织的获取

1.选择体况健康无病、精神状态良好的种公鸡作为试验对象。

2.将种公鸡颈静脉放血处死，浸入含有新洁尔灭的水中10～15min，解剖后立即取出双侧睾丸(保持睾丸组织的完整性)，将睾丸周围多余组织剪掉。

3.取出双侧睾丸后立即将其置于预冷的含有2％双抗(青霉素和链霉素)的PBS缓冲液(pH7.2-7.4)中，PBS清洗三遍。之后，将分离出的睾丸组织置于无菌小烧杯，并迅速转移至细胞间超净台。

附解剖过程：将种公鸡置于操作台，将胸骨末端与腹部连接的皮肤提起，剪刀剪断；将两侧膝关节与胸部连接的皮肤剪开，两手按压使髋关节脱臼将身体放平；提起胸骨末端，将腹壁与胸部末端剪断，从胸骨末端开始沿着胸骨边沿将两侧肋骨剪断；将胸部直立与操作台垂直，剪刀与胸部垂直，将乌喙骨和锁骨剪断，将胸骨向头部推压、放平，是整个身体呈180度，此时，心脏、肝脏、肌胃、肠道暴露出来，种公鸡的睾丸有两个，位于肺脏的下方，位于两个肾前叶的中间。

二.睾丸间质细胞的获取(以下步骤在超净台中无菌操作)

1.将新鲜获取的睾丸组织用预冷的含2％双抗(青霉素和链霉素)PBS缓冲液(pH7.2-7.4)继续清洗3遍。操作中应将系膜和多余的组织剪弃，同时保持睾丸组织的完整性。

2.将洗净的种公鸡睾丸置于玻璃皿，用眼科剪在睾丸腹剪开，容易剥离白膜，剥离小血管及可见的曲细精管，随后用手术刀片将睾丸切成1mm³左右大小的细小碎块，之后立即放入温育过的1mg/mLⅡ型胶原酶消化液中消化(消化液与睾丸之间的重量比为5:1)。在酒精灯附近手持摇晃振荡25～30min(也可置于37℃水浴震荡)，期间可用镊子夹起消化的组织团块观察消化情况。

3.消化完成后，弃掉消化后成团的曲精细管，向组织消化液中按消化液一半的体积加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，以终止消化。用移液枪轻轻吹打均匀，200目(75μm)细胞筛过滤消化液。

4.将所得滤液转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液，吸弃明显的血细胞沉淀。之后加入约6mL温育过的DPBS，吹打数次至重悬，800rpm离心5min，弃上清液，同时吸弃少量血细胞，该步骤重复2～3次。

5.在所得细胞沉淀中加入在培养箱中充分平衡过的细胞培养液(含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液)重悬细胞，所得细胞液即为种公鸡的睾丸间质细胞悬液(显微镜下观察结果如图1所示)。

6.计数：使用血细胞计数板计数。取4个计数区，求其平均值，根据公式计算细胞数。

附细胞计数板使用方法：

计数原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作如下：

(1)将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。

(2)将细胞悬液吸出少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置2min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

(3)计数板四大格细胞总数，压线细胞遵循数上不数下，数左不数右的原则。然后按公式计算：细胞数/mL＝四大格细胞总数/4×10⁴×稀释倍数

说明：公式中除以4，因为计数是4个大格的总细胞数，需求取平均值。公式中乘以10⁴因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)＝0.1mm³，1mL＝1000mm³(注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液)。

7.将计数后的种公鸡睾丸间质细胞悬液稀释成5×10⁶个/mL，接种在6cm细胞培养皿里，每皿接种4mL，水平放入培养箱(5％CO₂，37℃)培养。48小时后，观察细胞生长情况，视贴壁情况进行细胞消化传代(第一代)处理。

8.细胞生长接近充满整个培养皿时，吸弃培养液，用DPBS缓冲液清洗贴壁细胞，操作时需小心谨慎。加入1ml室温平衡过的0.25％胰蛋白酶消化液(含0.02％EDTA)，37℃消化约2min，显微镜下观察到细胞开始收缩变圆时，立即加入1mL在培养箱中预热的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液并混匀，由此终止胰酶消化作用。轻轻吹打变圆的细胞使其悬浮，收集悬液，1100rpm离心4min，弃上清液，DPBS清洗一遍，后加入基础培养液重悬细胞，计数后以1×10⁵个的细胞量接种于新的6cm细胞培养皿中，每皿接种4mL，水平放入培养箱(5％CO₂，37℃)培养(即为第二代)。按此方法再重复一次，由此得到第三代种公鸡睾丸间质细胞。此后，根据情况还可以继续进行传代培养。

实施例2.台盼蓝染色法鉴定细胞活率

0.4％台盼蓝染液的配制：准确称取0.4g台盼蓝粉末，溶解于100mL PBS中，充分震荡混匀，0.22μm滤膜过滤封装，放入4℃保存备用。

睾丸间质细胞悬液经0.4％台盼蓝溶液染色后在光镜下观察，共计数200个细胞，其中死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。重复记数3次。根据计算结果，若细胞活率大于90％则可用于后续试验。

计算公式如下：

细胞活率＝活细胞数目/(活细胞数目+死细胞数目)×100％

细胞活率结果列于下表1中。

实施例3.3β-HSD染色法鉴定睾丸间质细胞的纯度

3β-HSD染色液的配制：混合A液：0.6mg脱氢表雄酮(DHEA)与1mg硝基蓝四唑(NBT)共溶于0.6mL甲醇中；混合B液：10mg辅酶Ⅰ(NAD+)溶于9.5ml DPBS中，A液与B液按0.6:9.5的比例混合(现用现配)。

由于只有睾丸间质细胞内含有3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)，因此睾丸间质细胞可被特异性染成蓝色。在本发明中，选取第三代睾丸间质细胞贴壁细胞做染色试验进行观察。首先将细胞用DPBS小心清洗一遍，取1.5-2mL 3β-HSD染色液加入培养皿，放入培养箱继续孵育5小时，在显微镜下选取多个视野观察计数所有细胞及被染成蓝色的细胞，计算睾丸间质细胞的细胞纯度。

3β-HSD染色结果也列于下表1中。

对比例1.采用Percoll法分离种公鸡睾丸间质细胞

用PBS将Percoll配制成30％、60％、70％的梯度液，将配好的各级Percoll梯度液按密度从高到低逐层小心注入10ml离心管中，将得到的细胞悬液置于最上层，于4℃、800rpm离心30～40min，出现多条模糊的细胞带。取30％～60％层的细胞带，加入5ml含10％的DMEM/F12培养液，洗涤两次，最后用少量培养液重悬沉淀细胞制成细胞悬液，按所需细胞密度稀释后接种，置于培养箱(5％CO₂，37℃)培养。

采用实施例2所述的台盼蓝染色法对由Percoll法获得的睾丸间质细胞鉴定细胞活率，并采用实施例3所述的3β-HSD染色法鉴定所获得睾丸间质细胞的纯度。

同样地，也将采用Percoll法获得的睾丸间质细胞的细胞活率和纯度结果列于表1，并与采用本发明方法获得的睾丸间质细胞的细胞活率和纯度进行比较分析。具体地，试验数据采用SPSS 19.0软件分析，统计结果以平均值±标准差表示。组间差异采用t检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

表1.采用本发明方法和Percoll法获得的睾丸间质细胞的活率和纯度比较

项目	本发明方法	Percoll法
			细胞活率(％)	96.08％±0.85％**	84.93％±1.28％
细胞纯度(％)	97.73％±0.43％**	86.53％±1.01％
			细胞分离度	优	良
总体比较	优	良

注：试验数据肩标**表示差异极显著(P＜0.01)。

由表1可见，本发明的制备禽类如种公鸡睾丸间质细胞的方法可以获得细胞量大且纯度高的睾丸间质细胞。由上文可知，本发明方法操作过程简单规范，对细胞损伤较小，且有效地减少了细胞污染。

综上，本发明人成功地建立了禽类如种公鸡的睾丸间质细胞的制备方法，为研究种禽的生殖生理机制及睾丸间质细胞的相关功能提供了良好的体外细胞培养平台。

以上所示仅为本发明的一种优选实例，因为种公鸡年龄、营养、生长状况及体况状态的好坏或试验材料的差异，均可能会造成试验误差。

Claims (17)

1.一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：

a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；

b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞，其中所述差速离心法包括至少三次离心，其中第一次离心的离心速度为800-1200rpm，持续3-8分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟；

c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞，其中所述差速贴壁法包括至少三次细胞培养，其中第一次细胞培养持续24-48小时，第二次细胞培养和第三次细胞培养各自持续24-36小时，并且其中，在所述第一次细胞培养中，接种细胞密度为3×10⁶-8×10⁶个细胞/mL；在所述第二次细胞培养、所述第三次细胞培养中，接种细胞密度为1×10⁵-2×10⁵个/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述禽类包括任何繁殖用雄性禽类。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述任何繁殖用雄性禽类包括种公鸡、种公鸭、种公鹅、种公鸽、种公鹑。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤a)中，所述胶原酶为II型胶原酶，其浓度为0.8-1.2mg/mL；并且消化时间为20-40分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述胶原酶的浓度为1mg/mL；并且消化时间为25-30分钟。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤a)和步骤b)之间，还包括使用200目的细胞筛来过滤步骤a)中获得的细胞悬液。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤b)中，所述第一次离心的离心速度为1000rpm，持续5分钟；并且所述第二次离心和所述第三次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤b)中，所述差速离心法还包括第四次离心，并且所述第四次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第四次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。

10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤c)中，所述第一次细胞培养持续48小时；所述第二次细胞培养和所述第三次细胞培养各自持续24小时。

11.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述第一次细胞培养、第二次细胞培养、第三次细胞培养采用DMEM/F12培养基，其中所述DMEM/F12培养基含有以体积计10％的胎牛血清。

12.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，在步骤c)中，所述差速贴壁法还包括在所述第三次细胞培养之后的后续细胞培养，在所述后续细胞培养中采用DMEM/F12培养基，其中所述DMEM/F12培养基含有以体积计10％的胎牛血清。

13.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述第一次细胞培养、所述第二次细胞培养和所述第三次细胞培养在37℃、5％CO₂条件下进行。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述差速贴壁法还包括在所述第三次细胞培养之后的后续细胞培养，所述后续细胞培养在37℃、5％CO₂条件下进行。

15.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在所述第一次细胞培养中，所述接种细胞密度为5×10⁶个细胞/mL；在所述第二次细胞培养和所述第三次细胞培养中，所述接种细胞密度为1×10⁵个/mL。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述差速贴壁法还包括在所述第三次细胞培养之后的后续细胞培养，在所述后续细胞培养中，接种细胞密度为1×10⁵-2×10⁵个/mL。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在所述后续细胞培养中，接种细胞密度为1×10⁵个/mL。

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