CN112226403A - 一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，主要包含以下步骤：1)注射PMSG促进3‑4周龄的幼年小鼠排卵；2)小鼠卵巢的分离及卵泡破碎：将促排卵48小时的小鼠腹部剖开，取出双侧卵巢，剥离卵巢周围脂肪组织与结缔组织。在显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡释放卵巢颗粒细胞。过200目塞网后放置于15mL离心管中待用；3)0.25％胰酶消化卵巢：将卵泡破碎后的卵巢组织放入0.25％胰酶，置于37℃的水浴锅中消化30分钟，过200目筛网后装入15mL离心管内，离心后便可获得大量纯度较高的卵巢颗粒细胞；4)卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型的构建：用浓度为5mg/mL环磷酰胺(CTX)处理卵巢颗粒细胞24小时，可得到卵巢颗粒细胞化疗损伤模型。

Description

一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的 方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的方法。

背景技术

卵巢对于女性而言是一个重要的生殖器官，同时也是一个十分重要的内分泌器官。卵巢除了具有排卵的功能外，还具有激素分泌的能力，对于女性维持体内激素水平的平衡至关重要。卵巢颗粒细胞是卵巢内十分重要的功能细胞，卵巢颗粒细胞的增殖与分化将会直接影响着卵泡的发育、生长、闭锁以及激素的分泌，从而影响卵巢的功能。

卵巢早衰是一种严重影响妇女身心健康的卵巢功能性疾病，主要是指由于遗传、免疫缺陷以及医源性(化疗与放疗)等引起的卵巢功能的不可逆损伤。卵巢早衰的特点包括卵巢功能的丧失、卵巢颗粒细胞的凋亡、月经初潮的混乱甚至消失，以及性激素分泌的紊乱。在肿瘤治疗过程中常会运用放疗与化疗手段去治疗肿瘤疾病，研究表明，放疗与化疗对女性卵巢会产生不可逆性的损伤。根据对癌症幸存儿童患者的调查发现，3390名女性儿童中，215人患有卵巢早衰疾病，发病率约为6.3％。在我国，卵巢早衰的发病率约为2.8％，西方国家卵巢早衰发病率约为3.6％。卵巢早衰已经严重影响了癌症治疗幸存女患者的生活质量，尤其对于儿童来说，严重地影响了她们的正常生活。

卵巢颗粒细胞的凋亡被认为是医源性引起卵巢早衰的机制之一，因此通过对于卵巢颗粒细胞的体外研究将可以为人们提供治疗或缓解卵巢早衰的新思路。

到目前为止，人们对于卵巢颗粒细胞的提取方法以及传代后性能的维持还不是很了解。同时化疗药物促使卵巢颗粒细胞凋亡的原因也没有很好的答案。如何获得高纯度、具有较好细胞状态的卵巢颗粒细胞以及选择何种化疗药物何种剂量进行体外损伤实验为体外研究卵巢颗粒细胞的重点。本方法将传统的机械提取法与酶消化法相结合并通过体外激素促排提高卵巢颗粒细胞的纯度以及状态，并选择CTX作为体外损伤模型构建的化疗试剂。

发明内容

针对现有技术的上述不足之处，本发明的目的是提供一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法、并利用免疫荧光成像技术鉴定卵巢颗粒细胞纯度。

本发明的目的之一是提供一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，包括以下步骤：

1)每只3-4周龄的幼年雌性小鼠腹腔注射10IU的PMSG，48小时后剖开小鼠腹腔取出双侧卵巢；将卵巢组织放入预冷的PBS中剥离卵巢周围结缔组织和脂肪组织；

2)将步骤1)的剥离好的卵巢组织放入装有预冷DMEM/F12溶液的10cm培养皿中，置于体式显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡，释放卵巢颗粒细胞释。将细胞悬液溶液过200目筛网后，转移至15mL离心管中；

3)将步骤2)中刺破卵泡后的卵巢组织放入装有0.25％胰酶的15mL离心管中，将离心管置于37℃水浴锅中消化30分钟。然后加入2倍体积的消化终止液终止消化后过200目筛网，将过筛网后的溶液转移入步骤2)中的15mL离心管中；

4)1000rpm，离心步骤3)中细胞5分钟。弃上清，加入卵巢颗粒细胞完全培养基进行重悬后，将细胞接种在12孔板或6孔板中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

5)48小时后弃去培养板中原有的培养基，加入新鲜的卵巢颗粒细胞完全培养基，每孔加入5mg/mL的CTX进行损伤细胞，24小时后即可得到卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型。

在优选地的实施方案中，步骤4)高纯度卵巢颗粒细胞的纯度大于95％；更优选地，高纯度卵巢颗粒细胞的纯度为100％。

在优选地的实施方案中，步骤3)终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞。

在优选地的实施方案中，卵巢颗粒细胞完全培养基具有如下组分：

30-35mL的H-DMEM基础培养基、5-7mL的胎牛血清和0.3-0.5mL的双抗溶液；

更优选地，卵巢颗粒细胞完全培养基具有如下组分：

33.6mL的H-DMEM基础培养基、6mL15％的澳大利亚胎牛血清(AUS-FBS)以及0.4mL的双抗溶液，双抗溶液含10,000U/mL苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。

在具体的实施方式中，该卵巢颗粒细胞完全培养基按以下方法制备：真卵巢颗粒细胞完全培养基的制备方法为：在50mL无菌离心管中加入33.6mL H-DMEM基础培养基、6mL澳大利亚胎牛血清(AUS-FBS)和0.4mL双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。

在优选地的实施方案中，培养的条件为，在六孔板中每孔添加2mL卵巢颗粒细胞完全培养基，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为48小时。

在优选地的实施方案中，分离培养包括如下步骤：

A.3-4周龄小鼠促排卵

通过腹腔注射的方式将10IU PMSG激素注入3-4周龄雌性小鼠体内，随后将小鼠置于湿度适宜、昼夜各12小时的房间内，等待48小时后分离小鼠卵巢组织；

B.分离小鼠卵巢组织

腹腔注射PMSG 48小时后，将小鼠放置于实验室无菌超净台中的解剖板上，通过颈椎脱臼法处死小鼠后浸泡入75％酒精中10秒。

用无菌手术剪刀剖开小鼠腹腔，暴露出两侧的卵巢组织。将两侧卵巢组织剪下放入事先准备好的装有预冷PBS的10cm培养皿中冲洗。

用无菌镊子将卵巢组织周围的脂肪组织及结缔组织剥离，随后转移至装有预冷DMEM/F12的10cm培养皿中；

C、卵巢颗粒细胞的提取：

将装有卵巢组织的10cm培养皿放置于体式显微镜下，用1mL注射器针头将卵巢表面的卵泡刺破，从而将卵巢颗粒细胞从卵泡中释放出来。过200目筛网后将溶液转移至15mL离心管中备用；

将刺破卵泡后的卵巢组织放入装有0.25％胰酶的15mL离心管中，放置于37℃水浴锅中消化30分钟。随后加入2倍体积的消化终止液终止消化，过200目筛网后并入上一步中的15mL离心管；

将离心管放入离心机中，1000rpm离心5分钟。弃去上清后，加入卵巢颗粒细胞完全培养基进行重悬，随后可接入12孔板或6孔板里，放置于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养；

D、卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型构建：

48h后，吸弃培养板中的原有培养基。加入新鲜的含CTX(5mg/mL)的卵巢颗粒细胞完全培养基，继续放入37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养24h即可得到卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型。

在优选地的实施方案中，卵巢颗粒细胞损伤模型的建立，包括以下步骤：

A.去除孔板内卵巢颗粒细胞的培养基；

B.用电子天平称取CTX粉末；

C.避光环境下，在无菌超净台中用相应体积的卵巢颗粒细胞完全培养基溶解；

D.将溶解后的CTX溶液通过0.22um的滤器；

E.以5mg/ml的浓度加入到孔板中进行损伤细胞；

F.将孔板放入到5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果包括：

1、采用3-4周龄未成年雌性小鼠注射PMSG促排卵，可以获得纯度更高、数目更多且处于同步状态的卵巢颗粒细胞，同时可以避免内源激素的影响；

2、利用1mL注射器刺破卵泡与将刺破后的卵巢组织进行消化，可以显著提高卵巢颗粒细胞的得率；

3、用含有15％澳大利亚胎牛血清(AUS-FBS)的卵巢颗粒细胞完全培养基培养卵巢颗粒细胞，可以在24小时内使更多的卵巢颗粒细胞贴壁，并且更快的进入对数生长期；

4、CTX是常用的化疗药物，具有极强的生殖毒性。以5mg/mL的CTX浓度去损伤细胞，对于细胞损伤的效果十分显著，细胞形态变化显著。

综上，本发明通过腹腔注射PMSG激素促进雌性小鼠排卵，48小时后剖开小鼠腹腔取出双侧卵巢。通过1mL注射器针头刺破卵泡，可以将卵巢颗粒细胞从卵泡中释放出来。余下卵巢组织通过0.25％胰酶的消化，将残余的卵巢颗粒细胞提取出来。随后将二者溶液并入15mL离心管中，1000rpm离心5分钟。本发明可以得到纯度极高的卵巢颗粒细，并利用CTX成功构建了卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是人小鼠卵巢颗粒细胞P0代细胞显微镜照片；

图2是小鼠卵巢颗粒细胞P1代细胞显微镜照片；

图3是小鼠卵巢颗粒细胞在共聚焦显微镜下鉴定照片；

图4是小鼠卵巢组织刺破卵泡前照片以及刺破卵泡后照片；

图5是小鼠卵巢颗粒细胞经5mg/mL的CTX损伤24小时后的典型形态图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

通过腹腔注射的方式将PMSG激素注射入3-4周龄小鼠体内，48小时后剖开小鼠腹腔暴露出双侧卵巢组织。用无菌手术剪刀将小鼠卵巢组织取下，PBS清洗卵巢组织并将卵巢组织周围的脂肪组织与结缔剔除。在体式显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡将卵巢颗粒细胞释放出来。刺破卵泡后的卵巢组织放入0.25％胰酶中消化30分钟后终止消化，将二者并入一根15mL离心管后1000rpm离心5分钟。去除上清后用卵巢颗粒细胞完全培养基重悬细胞，随后将其接种在12孔板或6孔板中，37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。48小时后吸弃原有的培养基，加入新鲜的含有CTX(5mg/mL)的卵巢颗粒细胞完全培养基进行损伤。

具体操作规程如下：

一、小鼠卵巢颗粒细胞的提取：

1.小鼠卵巢组织的分离

通过腹腔注射的方式将10IU PMSG注射入3-4周龄雌性小鼠体内促进小鼠排卵。将所有需要使用的手术器械提前一天放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15分钟，随后将器械放入56℃烘箱中过夜干燥。

PMSG注射48小时后，通过颈椎脱臼法处死小鼠后将其浸泡入75％酒精溶液中10秒进行表面消毒，随后将小鼠放置于无菌操作台中的解剖版上，固定小鼠四肢后用无菌手术剪刀将小鼠腹腔剖开暴露出双侧卵巢。取出小鼠双侧卵巢，将卵巢放置于装有预冷PBS溶液的10cm培养皿中冲洗并将卵巢周围脂肪组织与结缔组织剥离。

2.刺破卵泡释放卵巢颗粒细胞

将PBS清洗后的卵巢组织转移至装有预冷DMEM/F12的10cm培养皿中，放置于体式显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡将卵巢颗粒细胞释放入DMEM/F12中。随后过200目筛网后装入新的15mL离心管中待用。

3.消化卵巢组织释放残余卵巢颗粒细胞

将刺破卵泡后的卵巢组织转移入装有0.25％胰酶的15mL离心管中，将该离心管置于37℃水浴锅中消化30分钟，每10分钟拿出振荡30秒。加入2倍体积消化终止液终止胰酶消化，过200目筛网后并入待用的15mL离心管中。1000rpm离心5分钟后弃去上清，加入卵巢颗粒细胞完全培养基进行重悬。重悬后接入6孔细胞培养板或12细胞培养孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

二、卵巢颗粒细胞的培养及传代：

1)接板48小时后去除卵巢颗粒细胞完全培养基；

2)用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤；

上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下：

定容至1L于高压蒸汽灭菌(常规程序)后放入4℃冰箱保存待用。

3)每孔中加入1mL Tryple消化液，37℃孵育箱(5％CO₂、95％湿度)中消化1-2分钟；

4)倒置显微镜下观察细胞消化情况，待多边形的卵巢颗粒细胞变圆之后，每孔中加入2mL无钙镁的PBS终止消化；

5)轻柔吹打，使卵巢颗粒细胞脱落并形成单细胞状态；

6)将细胞悬液收集在15mL离心管中，1000rpm离心5min；

7)弃上清，加入卵巢颗粒细胞完全培养基重悬细胞，按1:2的比例对细胞进行传代：从2ml的细胞悬液中取1mL至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的卵巢颗粒细胞完全培养基，摇匀；

8)放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；

9)每天观察细胞状态、汇合度。每2天更换卵巢颗粒细胞完全培养基，待细胞汇合度大于80％时便可再次进行传代。

三、卵巢颗粒细胞纯度的鉴定：

由于在卵巢中只有卵巢颗粒细胞会表达FSHR蛋白，因此通过免疫荧光技术便可以鉴定卵巢颗粒细胞的纯度。

1)将卵巢颗粒细胞接于12孔板的爬片上；

2)用4％的细胞组织固定液在4℃下固定卵巢颗粒细胞20分钟；

3)在有细胞爬片的孔中加入0.25％TtitonX-100-PBS，5分钟后吸弃；

4)室温下用1％BSA-PBS封闭细胞1小时或置于4℃过夜封闭；

5)在细胞爬片上滴加50uL FSHR一抗，室温下在潮湿容器中孵育1小时，随后用PBS清洗细胞爬片3次，每次5分钟；

6)在细胞爬片上滴加50μL荧光标记的二抗，室温下在黑暗潮湿容器中孵育1小时，随后吸弃并用PBS清洗细胞爬片4次，每次5分钟；

7)在细胞爬片上滴加50μL的DAPI复染2分钟，随后用PBS清洗3次，每次5分钟；

8)将细胞爬片从空板中取出，准备相应数量的载玻片并滴加抗淬灭封片液，将细胞爬片倒置覆盖在上方，最后用指甲油封片；

9)在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察细胞纯度，当细胞纯度达到95％时便可满足实验需求。

上述0.25％TtitonX-100-PBS的配置方法如下：

取5μL TtitonX-100溶液于50mL离心管中，加入20mL PBS稀释至浓度0.25％。

上述1％BSA-PBS封闭液的配置方法如下：

称取0.2g BSA粉末至50mL离心管中，随后加入20mL PBS使其溶解。

四、卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型的构建：

本方案中构建小鼠卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型选择用CTX作为药剂，以5mg/mL的浓度进行损伤。

1)将培养板从37℃、5％CO₂浓度的培养箱中取出；

2)吸弃培养板中原有的培养基，每孔加入2mL新鲜的卵巢颗粒细胞完全培养基；

3)以5mg/mL的浓度向每孔中加入CTX工作液，加入后将培养板放置于37℃、5％CO₂浓度的培养箱中继续培养24小时。

4)24小时后从培养箱中取出培养板在显微镜下观察，可得到小鼠卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型。

上述5mg/ml CTX工作液的配置方法如下：

称取50mg CTX粉末于15mL离心管子中，在无菌超净台中往离心管内加入10mL的卵巢颗粒细胞完全培养基。随后用0.22μm的滤器进行过滤，即可得到5mg/ml CTX工作液；将15mL离心管中的CTX工作液分装入灭菌的2mL EP管中，至于-20℃冰箱中避光保存。

本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取3-4周龄的幼年雌性小鼠，腹腔注射PMSG，置于24℃-26℃、湿度适宜的环境下饲养48小时，48小时候后，麻醉所述小鼠，将其放置于解剖版上，剖开小鼠腹部，取出双侧卵巢，剥离卵巢周围脂肪组织及结缔组织，

2)在体式显微镜下用1mL注射器刺破卵泡，释放卵巢颗粒细胞，细胞悬液过200目筛网后置于15mL离心管中待用；

3)用预热的0.25％的胰酶消化步骤2)所述卵泡破碎后的卵巢组织30分钟，然后终止消化，将消化后的组织过200目筛网，细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，用卵巢颗粒细胞完全培养基重悬细胞，可得到高纯度卵巢颗粒细胞；

4)将步骤3)中得到的细胞接种在12孔细胞培养板中，然后置入培养箱中培养，吸弃原有卵巢颗粒细胞完全培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜的卵巢颗粒细胞完全培养基，并每孔加入5mg/ml的无菌损伤药物试剂CTX，进行损伤模型的构建。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述卵巢颗粒细胞完全培养基具有如下组分：

33.6mL的DMEM/F12基础培养基、6mL的澳大利亚-胎牛血清(AUS-FBS)和0.4mL的双抗溶液；所述双抗溶液含10000U/mL苄青霉素钠和10000μg/mL链霉素。

3.根据权利要求2所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述培养的条件为，在12孔细胞培养板中添加1mL卵巢颗粒细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为48h；或在6孔细胞培养板中每孔添加2mL卵巢颗粒细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为48h。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤3)所述高纯度卵巢颗粒细胞的纯度大于95％。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤3)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。

6.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述PMSG的注射剂量为5-10IU，优选地，每只小鼠腹腔注射10IUPMSG。

7.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述的损伤药物试剂CTX浓度为5mg/ml，所述损伤模型构建方法包括以下步骤：

A.用电子天平称取CTX粉末；

B.避光环境下，在无菌超净台中用卵巢颗粒细胞完全培养基溶解CTX粉末；

C.将溶解后的溶液通过0.22um滤器，达到除菌目的；

D.以5mg/ml的剂量加入到细胞培养板中进行损伤细胞；

E.放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养24小时；

F.24小时后在倒置显微镜下观察细胞损伤情况，可发现大部分卵巢颗粒细胞出现凋亡的现象。

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