CN115651893A - 一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法及其应用，属于细胞技术领域。该构建方法包括将单个卵泡转移至含胶原酶H的MEM完全培养基中消化和将卵巢颗粒原代细胞移至18℃下恒温培养的步骤。本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的卵巢颗粒细胞系，及该卵巢颗粒细胞系在鱼类颗粒细胞分离培养、颗粒细胞分子调控机制和建立激素代谢细胞模型中的应用。本发明的构建方法重复性强，操作步骤简单，经原代培养后，颗粒细胞生长状态良好，生理状态稳定。本发明所提供的颗粒细胞系能为后续虹鳟生殖和细胞层面的科学研究奠定理论基础和科技支撑，且所提供的细胞系能够用于研究虹鳟生殖调控过程中减数分裂分子机制。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，特别是涉及一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法及其应用。
背景技术
卵巢颗粒细胞(Granulosa cell，GSC)作为卵泡的重要组成部分，通过促性腺激素受体、类固醇激素、各类生长因子等调控卵泡的发育和闭锁，对卵母细胞及卵泡的正常发育都发挥着重要的作用。因此在哺乳动物中，卵巢颗粒细胞常被用做卵巢功能研究的体外研究模型。然而，目前在鱼类中关于颗粒细胞的相关研究较少，并且缺乏颗粒细胞体外培养模型。
本发明将以性成熟的雌性虹鳟(Oncorhynchus mykiss)卵巢组织为研究对象，建立虹鳟原代卵巢颗粒细胞培养体系并对分离的细胞进行鉴定，为今后虹鳟颗粒细胞分子调控机制及激素代谢细胞模型提供参考资料。
发明内容
本发明的目的是提供一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所提供的虹鳟卵巢颗粒细胞系为后续虹鳟生殖和细胞层面的科学研究奠定理论基础和科技支撑，且所提供的细胞系能够用于研究虹鳟生殖调控过程中减数分裂分子机制。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法，包括以下步骤：
(1)将单个卵泡转移至含胶原酶H的MEM完全培养基中消化；
(2)将消化后的卵泡放在含有HBSS的培养皿中刺破并过夜孵育，得到含有卵泡包膜的消化液，将所述消化液处理后放入MEM培养基中进行重悬沉淀，得到卵巢颗粒原代细胞；
(3)将卵巢颗粒原代细胞移至18℃下恒温培养，待细胞贴壁密度达到80％以上时进行传代，每4-5天传代一次；
(4)采用免疫荧光法鉴定和荧光定量PCR法鉴定。
进一步地，在步骤(1)中，所述单个卵泡分离自经过组织清洗液清洗的卵巢组织。
进一步地，在步骤(1)中，所述胶原酶H的浓度为0.4UI/ml。
进一步地，在步骤(1)中，所述消化的条件包括在18℃消化3-4h。
进一步地，在步骤(2)中，所述培养皿中的组分还包括NaHCO3和1％牛血清白蛋白。
进一步地，在步骤(2)中，所述处理包括：将所述消化液经40μm的细胞筛过滤后，1000rpm离心7min并弃上清；所述MEM培养基的组分还包括10％胎牛血清和1％双抗。
进一步地，在步骤(4)中，所述的免疫荧光法是采用颗粒细胞标记基因FSHR作为标记物在颗粒细胞中进行免疫荧光检测；所述的荧光定量PCR法是参考cyp19a1、foxl2a和shbgd在卵巢颗粒细胞中的表达量。
本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的卵巢颗粒细胞系。
本发明还提供上述的卵巢颗粒细胞系在鱼类颗粒细胞分离培养、颗粒细胞分子调控机制和建立激素代谢细胞模型中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明在无菌条件下获取虹鳟雌性卵巢组织，并将其立即置于组织清洗液中清洗；清洗后分离单个卵泡在含胶原酶H的MEM完全培养基中消化，随后在HBSS中刺破卵泡并过夜孵育，并进一步过滤离心提纯；使用含胎牛血清、双抗(青霉素-链霉素)的MEM完全培养基重悬沉淀，即获得虹鳟卵巢颗粒原代细胞。
本发明提供的虹鳟卵巢颗粒细胞的分离和原代培养方法，所获得的颗粒细胞生长状态稳定，可连续传代，且通过传代能够批量获得虹鳟卵巢颗粒细胞。
本发明的虹鳟卵巢颗粒细胞构建方法操作简便，可重复性强，可为其他鱼类颗粒细胞分离培养提供参考。
本发明获得的虹鳟卵巢颗粒细胞系可为今后虹鳟颗粒细胞分子调控机制及建立激素代谢细胞模型提供参考材料。
附图说明
为了更清楚说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为虹鳟卵巢颗粒细胞不同贴壁时长的生长状态，其中，A为10倍镜下虹鳟卵巢颗粒细胞形态图，B为20倍镜下虹鳟卵巢颗粒细胞形态图；
图2为虹鳟卵巢颗粒细胞FSHR免疫荧光鉴定结果，其中，A为荧光成像细胞图，B为DAPI染色后的细胞核；C为A和B的叠加图；
图3为颗粒细胞标记基因cyp19a1、foxl2a和shbgb的基因表达量调查结果，*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)；**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；
图4为虹鳟颗粒细胞形态图，其中，A为细胞在含胶原蛋白酶H的MEM培养基中孵育消化培养的细胞形态图，B为细胞在不含胶原蛋白酶H的MEM培养基孵育消化培养的细胞形态图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本申请实施例中所用的试剂，若无特殊说明，均可通过普通市售获得。
实施例1
虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法如下：
1.虹鳟卵巢颗粒细胞的分离和原代培养
虹鳟性成熟雌鱼(3龄+)取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站(牡丹江)，带水气运回实验室，于100mg/L MS-222下进行麻醉处死。以酒精棉球擦拭鱼体表面后，用无菌剪刀取出卵巢组织放入无菌PBS(含1％青霉素和链霉素，pH为7.4)中，带入细胞间无菌操作台。
在无菌培养皿中用含1％双抗的PBS溶液漂洗清理组织上的附着物，冲洗3次。用无菌镊子剖开组织外膜后分离单个卵泡转移至含0.4UI/ml胶原酶H的MEM(Sigma)完全培养基中孵育消化3h，孵育后的卵泡移入含HBSS(Hank’s平衡盐溶液，4.17mM NaHCO3，1％牛血清白蛋白)的培养皿中用1mL注射器尖端刺破卵泡，而后将卵泡包膜浸泡在HBSS中过夜。
将含有卵泡包膜的液体经40um的细胞筛(Sigma)过滤后，1000rpm离心7min弃上清，加入5mL的含有10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的MEM培养基(Sigma)重悬细胞后转移至25cm2的培养瓶，将培养瓶放入18±0.2℃、含5％二氧化碳的加湿培养箱中培养，待细胞贴壁后观察细胞形态。如图1所示，虹鳟卵巢颗粒细胞在体外分离24h后呈单层贴壁性生长，形态为梭形或不规则多边形，中央有卵圆形核，胞质外伸出多个突起，生长时多呈放射状或旋涡状。
2.虹鳟卵巢颗粒细胞传代培养：当原代颗粒细胞贴壁且单层细胞面积达到80％时，将原培养瓶中的培养基吸出，加入PBS溶液轻轻漂洗后吸出溶液，加入2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液(Gibco)消化70s后吸出胰蛋白酶，即可加入2ml含血清和双抗的MEM完全培养基终止消化，并使用移液枪将细胞反复吹打8次制成单细胞悬液，吸出1ml至新的25cm2的培养瓶，每瓶定容至5ml继续培养，约4d传代一次。
3.细胞的冻存与复苏：本实施例中的颗粒细胞从第5代开始，每隔5代放入液氮中进行长期保存。每隔30天进行一次复苏，显微镜下观察细胞复苏后的生长情况，细胞表现出60％的成活率。结果显示细胞已传代30余次，生长状态无明显差异。
4.虹鳟卵巢颗粒细胞的鉴定：
1)免疫荧光法鉴定虹鳟卵巢颗粒细胞
根据卵泡刺激素受体(Follicle-Stimulating Hormone Recepor，FSHR)在颗粒细胞中特异性表达的特点，采用细胞免疫荧光法对体外培养的颗粒细胞进行鉴定。具体操作步骤如下：
a.吸除培养24h后的颗粒细胞的旧培养基，用PBS清洗3次，每次5min；
b.4％多聚甲醛固定1h，PBS洗3次，每次5min；
c.0.3％TritionX-100冰上孵育15min，PBS洗3次，每次5min；
d.室温封闭液(0.5％胎牛血清+0.3％TritionX-100)孵化2h，PBS洗3次，每次5min；
e.加入一抗(anti-FSHR，1：200)，4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5min；
f.加入二抗(FITC，1:100)，4℃孵育1h，注意避光；
g.PBS洗3次，每次5min，滴加DAPI进行核染色10min；
h.荧光显微镜下观察显色，拍照留存。
结果如图2所示，DAPI，染色后的细胞核呈蓝色，FSHR蛋白呈绿色，位于细胞质中，表明分离得到的细胞即为虹鳟原代卵巢颗粒细胞。
2)颗粒细胞标记基因表达量调查
研究表明cyp19a1、foxl2a和shbgb均在卵巢颗粒细胞中特异性表达，可作为颗粒细胞的标记物。为了进一步确定本实施例中分离出的细胞为卵巢颗粒细胞，调查了cyp19a1、foxl2a和shbgd三个基因在细胞系中的相对表达。提取细胞总RNA，具体方法参照Simply P总RNA提取试剂盒(Bio Flux)说明书。反转录获得cDNA，以此为模板，并以虹鳟性腺细胞系RTG2作为对照进行荧光定量(Real Time PCR)，检测细胞中颗粒细胞标记基因的相对表达量。反应体系采用Roche公司的SYBR Green Master Mix 10μm体系，SYBR Green 5μL，上下游引物共0.4μL，cDNA模板0.5μL，加ddH2O至10μL。利用BIO-RAD CFX96 TOUCH荧光定量仪的2-ΔΔCt法检测颗粒细胞标记基因的相对表达量。PCR反应条件如下：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；共计40个循环，熔解曲线从65℃上升到95℃，每秒增加0.5℃，β-actin作为内参基因，引物如表1所示。
表1
结果如图3所示，相较于RTG2细胞，本研究分离的细胞中cyp19a1基因显著上调为对照组的2.77倍。foxl2a(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉状转录因子超家族(Forkhead transcriptionfactor，FOX)成员之一，前期研究发现，该基因主要在垂体和卵巢颗粒细胞中表达，参与颗粒细胞的增殖和分化，本发明中分离的颗粒细胞中foxl2a基因为对照组的26.49倍。同样地，颗粒细胞标记基因shbgb(sex hormone-bindingglobulinb)较对照组高5.66倍。以上结果进一步证实了分离得到的细胞即为虹鳟原代卵巢颗粒细胞。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在虹鳟卵巢颗粒细胞的分离和原代培养部分，用无菌镊子剖开组织外膜后分离单个卵泡转移至不含胶原蛋白酶H的MEM完全培养基中孵育消化3h。剩余步骤与实施例1相同。分离结果显示，实施例1分离得到的虹鳟卵巢颗粒原代细胞胞体饱满且细胞边缘润滑，详见图4中的A，而本对比例使用不含胶原蛋白酶H的MEM完全培养基孵育消化所得到的原代细胞胞体皱缩细胞边界模糊，详见图4中的B。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在虹鳟卵巢颗粒细胞的分离和原代培养时，重悬细胞后转移至25cm2的培养瓶，将培养瓶分别放入20℃和16℃含5％二氧化碳的两个加湿培养箱中培养。剩余步骤与实施例1相同。观察生长速度，结果显示，实施例1在18℃下培养与本对比例分别在20℃和16℃生长的速度存在差异，18℃下培养的细胞状态饱满且生长速度较快，3-4d单层细胞面积即可达到80％以上，而在20℃和16℃下，细胞生长较为缓慢，一般需要7-8d细胞单层面积才能达到70％-80％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种虹鳟卵巢颗粒细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将单个卵泡转移至含胶原酶H的MEM完全培养基中消化；
(2)将消化后的卵泡放在含有HBSS的培养皿中刺破并过夜孵育，得到含有卵泡包膜的消化液，将所述消化液处理后放入MEM完全培养基中进行重悬沉淀，得到卵巢颗粒原代细胞；
(3)将卵巢颗粒原代细胞移至18℃下恒温培养，待细胞贴壁密度达到80％以上时进行传代，每4-5天传代一次；
(4)采用免疫荧光法鉴定和荧光定量PCR法鉴定。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述单个卵泡分离自经过组织清洗液清洗的卵巢组织。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述胶原酶H的浓度为0.4UI/ml。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述消化的条件包括在18℃消化3-4h。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述培养皿中的组分还包括NaHCO3和1％牛血清白蛋白。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述处理包括：将所述消化液经40μm的细胞筛过滤后，1000rpm离心7min并弃上清；所述MEM培养基的组分还包括10％胎牛血清和1％双抗。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的免疫荧光法是采用颗粒细胞标记基因FSHR作为标记物在颗粒细胞中进行免疫荧光检测；所述的荧光定量PCR法是参考cyp19a1、foxl2a和shbgd在卵巢颗粒细胞中的表达量。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的卵巢颗粒细胞系。
9.一种如权利要求8所述的卵巢颗粒细胞系在鱼类颗粒细胞分离培养、颗粒细胞分子调控机制和建立激素代谢细胞模型中的应用。
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