CN117402826A - 培养类器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种培养类器官的方法，该方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基的生物反应器中。
Description
本申请是申请日为2017年7月11日、申请号为201780043146.6、发明创造名称为“培养类器官的方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种培养类器官的方法。
背景技术
在动物或人类体内测试新药候选物之前，通常使用原代细胞培养物或细胞系进行体外测试。然而，由于细胞培养物不能非常好地模拟体内系统，这种测试的结果可能是不可靠的。这可能导致一些好的药物在体外阶段被舍弃，并且一些不良药物可能会进展到体内试验。
类器官是异质性组织的三维结构，其功能类似于体内组织。换句话说，这些组织的三维结构模拟一种器官优于传统的细胞培养单层。因此，类器官提供了创建细胞疾病模型的机会，可以对其进行研究以更好地了解疾病的原因并确定可能的治疗方法。
类器官通常由干细胞产生，干细胞可分化为脑、肾、心血管和其他类型的类器官。类器官技术也被用于创建人类结肠癌进展的模型。这些类器官可以从正常的肠细胞进行突变以转化成癌细胞而产生，或者可以从肿瘤细胞本身获得。已经证实从肿瘤中产生的类器官是该原始肿瘤的良好映射，其为改进体外药物测试提供了机会。
然而，迄今为止，类器官仅被在实验室环境中进行培养，这严重依赖于相关技术人员的技术技能，并仅产生少量类器官。因此，无法大量提供可应用于药物测试中的类器官。此外，由于依赖于培养过程中的技术技能，培养物之间几乎没有标准化，这意味着对不同批次的类器官进行的测试可能无法直接比较。
因此，需要产生大量的类器官，并产生具有一致形式和功能的类器官。这将有助于在药物测试中更广泛地使用类器官，从而提高测试结果的可比性。
发明内容
因此，本发明提供了一种培养类器官的方法，该方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的经筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基中的生物反应器中。细胞悬浮液的筛选提供了特别的优势，即可以控制筛选细胞的尺寸范围。例如，从活跃生长的细胞中挑选窄尺寸范围的细胞接种至细胞培养基中能够得到具有一致的尺寸/表面积与体积比的均质性类器官的培养物，导致可变性降低并且质量得到改善。不受理论束缚，据信可优化细胞/类器官的尺寸以确保所有类器官与细胞外支持基质有良好接触，以及良好的营养物通入和良好的O2张力。这确保了类器官的所有细胞均有适当地发育并且具有高质量，意味着更大数量的类器官可用于各种应用，例如药物筛选。
术语类器官仅仅意味着与器官类似。类器官通常通过三个特征定义：自组织、多细胞性和功能性(Lancaster和Knoblich)。因此，细胞在体外排列成具有体内器官特征的三维(3D)组织，所得结构由在该特定器官中发现的多种细胞类型组成，并且这些细胞至少执行一些其通常在该器官中执行的功能。例如，一种原型类器官如小鼠肠类器官，作为单层上皮细胞生长，并被组织成多个区域，使其类似于体内肠道隐窝-绒毛结构，其包括肠的不同细胞类型(肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞，肠内分泌细胞和干细胞)，并包围一囊腔(Sato等)。
本发明中，未经加工的类器官是指从组织样品的原代培养物制备得到的类器官，其在培养期间未经过任何筛选或分选的步骤。未经加工的类器官可以分离自组织样品，包括消化道、乳房、前列腺、肺、肝、卵巢、胰腺、皮肤、肾、脑和睾丸的正常或癌症的活检组织。
本发明中，未经处理的类器官被解离以将它们分解成(大体上)单细胞。通过过筛后，过滤器上会留下较大的团块。滤液(即筛选的细胞悬浮液)可能主要包含单个细胞和/或两个或更多个细胞的小团块，其直径可以为约10μm至约1mm，优选直径为约10μm至约200μm，更优选直径为约10μm至约60μm。然后将它们接种在包含细胞外支持基质的细胞培养基中。在培养基中进一步生长后，活细胞分裂并成为多细胞类器官(在本发明中称为I阶段类器官)。这些可以从细胞外支持基质中整体“回收”并通过各种尺寸的筛子，以提取所需尺寸范围从约20μm至约200μm的类器官(II阶段类器官)，如下所述。
解离未经加工的类器官可以指使用胰蛋白酶进行细胞解离的过程，胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，其剪切蛋白质，使贴壁细胞彼此之间和/或与培养它们的容器解离。当添加到细胞培养物中时，胰蛋白酶分解蛋白质，使细胞能够粘附到血管上。胰蛋白酶消化通常用于将细胞传递至新血管。作为替代/互补的解离技术，包括EDTA在内的螯合剂可用于破坏细胞-细胞的连接。
细胞培养基是本领域熟知的，并且是技术人员熟悉的。通常，细胞培养基包含氨基酸、盐、葡萄糖和维生素，并且还可包含铁和酚红。适合用于本发明的培养基可以通过改进现有的细胞培养基来产生。例如，细胞培养基可以是达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)，并且可以包含一种或多种其他组分，如营养混合物(例如Ham′s F12)、抗生素/抗真菌剂(例如青霉素/链霉素)、缓冲液(例如HEPES)、谷氨酰胺和n-乙酰半胱氨酸。细胞培养基可另外包含无血清补充剂，例如N2补充剂和/或B27补充剂。
细胞培养基可包含约1％至约99％v/v的细胞外支持基质，优选约5％至约85％v/v或约10％至约85％v/v的细胞外支持基质。在本发明的较佳实施例中，细胞培养基可包含约85％v/v的细胞外支持基质。与现有技术中通常使用100％细胞外基质相比，减少细胞培养基中的细胞外支持基质的含量可以提供优于现有技术的特定的成本优势。令人惊讶的是，本发明人发现在本发明的方法中，可以降低细胞外基质含量而不损害类器官的生长。
较佳地，细胞外支持基质是基于凝胶的细胞外基质，其可以是合成的或天然存在的。可选地或可替代地，细胞外支持基质可以是溶解的基底膜制剂。例如，可以从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取合适的基底膜制剂，该小鼠肉瘤是富含诸如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、恩他汀/巢蛋白和许多生长因子等细胞外基质蛋白的肿瘤。较佳地，细胞外支持基质包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白和一种层粘连蛋白。在本发明的实施例中，细胞外支持基质可以是MatrigelTM(其包含层粘连蛋白、恩他汀和IV型胶原)基质胶或CultrexTM基底膜提取物(其包含层粘连蛋白、恩他汀、IV型胶原和硫酸肝素蛋白聚糖)。较佳地，细胞外支持基质是MatrigelTM。可选地，细胞外支持基质可以是合成基质，其包含基于纤连蛋白、胶原蛋白和/或层粘连蛋白存在的序列的肽。
培养基可以置于细胞外支持基质的顶部，并且可以根据需要除去和补充。在本发明的实施例中，生物反应器提供连续的培养基流，从而连续地供给类器官。培养基的组成可以随时间调整，以最大化地使类器官的均匀生长。
将未经加工的类器官解离后获得的细胞悬浮液通过细胞过滤器过筛，以保留如上所述的筛选的细胞悬浮液。筛选的细胞悬浮液的细胞可以是单细胞，或者可以是两个或更多个细胞结合形成的类器官。筛选的细胞悬浮液的细胞或类器官的大小可以通过细胞过滤器的筛孔尺寸来控制。例如，细胞过滤器可具有约10μm至约1mm或约10μm至约500μm的筛孔尺寸。优选地，细胞过滤器的筛孔尺寸为约20μm至约100μm，更优选约30μm至约50μm。在本发明的实施例中，如果在筛选的细胞悬浮液中主要需要单细胞时，细胞过滤器可具有约40μm的筛孔尺寸。合适的细胞过滤器对于技术人员来说是熟悉的并且包括pluriStrainers。
在筛选未经加工的类器官后，优选将筛选的细胞悬浮液接种到生物反应器中。传统的(二维)细胞培养通常涉及将分离的细胞铺在平面(例如培养皿或组织培养物处理的烧瓶)上并用营养培养基供给细胞。细胞通常在37℃静态储存，暴露于5％CO2中。与此相反，生物反应器允许三维的细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，并且提供了生化和物理信号的空间和时间梯度，以及包括不同器官系统之间的对话的系统调节。因此，生物反应器允许细胞分化成三维组织结构，例如类器官。生物反应器的一个关键特征是它们提供动态的培养系统，而不是传统细胞培养的静态培养系统。在静态培养中，质量传递基于扩散，并且由于氧张力的下降和毒性代谢物浓度的增加，通常将组织生长限制为小于0.2mm的厚度。相比之下，生物反应器提供动态的质量传递，这允许组织在毫米至厘米范围内生长。
在本发明的实施例中，生物反应器可以是补料分批式生物反应器或灌注式生物反应器，两者都产生培养基流以改善营养物的扩散。补料分批式生物反应器通常提供离散量的培养基，其通常每隔几天更换一次。补料分批式生物反应器可包括搅拌烧瓶式生物反应器或旋转壁式生物反应器，两者都提供培养基的对流以增强营养物的分布。搅拌烧瓶式生物反应器通常使用磁力搅拌棒来产生对流，从而允许培养基的连续混合。旋转壁式生物反应器提供培养基的动态层流。在本发明的优选实施例中，生物反应器是灌注式生物反应器。灌注式生物反应器使用泵系统，其可以以连续或非连续的方式将培养基灌注至细胞或组织。在灌注式生物反应器系统中，通过扩散和对流将氧气和营养物供应到系统内部。可以针对限制性营养物来优化流速，所述限制性营养物主要是氧，因为其在培养基中的溶解度低。灌注式生物反应器可以向类器官提供连续的营养流，发明人已经发现这能够导致类器官生长的改善。
灌注式生物反应器可包括进料板生物反应器或流化床生物反应器。进料板生物反应器是本领域技术人员熟知的，一般包括通常由塑料形成的一次性培养皿和一个盖子，所述盖子的一侧具有连续培养基流动的入口端并且另一侧具有连续培养基流动的出口端。基于凝胶的细胞外基质通常覆盖培养皿的底部并包含类器官。进料板生物反应器可以为类器官提供恒定的营养流，本发明人发现这可以改善类器官的生长。不受理论的束缚，本发明人相信使用进料板生物反应器能够使用少于本领域常规使用的细胞外基质培养类器官。生物反应器还可以提高培养过程的效率并且还提供成本优势。
进料板生物反应器优选是浅层反应器，例如平板式生物反应器。生物反应器可以是1m×1m或更小的，例如150mm或100mm的平板式生物反应器。在本发明的实施例中，可以使用较小的容器，例如6孔多孔板。可选地，几个生物反应器可以并联或串联连接，并且可以堆叠以提供并联的进料板生物反应器阵列。例如，进料板生物反应器可以包括一组彼此堆叠的生物反应器阵列，使得它们通过输送相同培养基的相同泵并行地供给。
在本发明的实施例中，生物反应器可以为类器官提供连续的营养流。营养通常以液体物料的形式提供，例如如上所述的细胞培养基，并且培养基的组分浓度可以随着时间增加或减少，以使类器官的均匀生长最大化。例如，可以从恒定浓度的液体以各种稀释速率连续进料，或从可变浓度的物料恒定进料。在本发明的可选实施例中，营养物可以是脉冲进料的，这意味着液体物料或其他组分的剂量可以以离散的量但以规则的频率添加到生物反应器中。例如，脉冲进料可包括以1分钟或1小时或1天的间隔施加非连续的量的液体物料或培养基。
经筛选的细胞悬浮液的细胞可以以约20,000个细胞/ml至约10,000,000个细胞/ml，优选约200,000个细胞/ml至约800,000个细胞/ml，更优选约400,000个细胞/ml至约600,000个细胞/ml的浓度接种到生物反应器中。可以将细胞接种到包含如本发明所述的细胞外支持基质的细胞培养基中。细胞培养基可另外包含一种或多种激酶抑制剂，例如Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。这些抑制剂可以增强种子细胞的恢复和生长。激酶抑制剂可以以约0.1μM至约100μM，优选约1μM至约20μM的浓度存在。在本发明的实施例中，细胞培养基可包含浓度为约10μM的激酶抑制剂。
经筛选的细胞悬浮液接种后，优选在生物反应器中培养细胞以形成I阶段类器官。优选产生至少100,000或至少250,000个I阶段类器官。在本发明的实施例中，可以产生大约500,000个I阶段类器官。然而，产生的I阶段类器官的数量可以是约1,000,000个或约5,000,000个或约10,000,000个或更多。可以将类器官培养不少于24小时或不少于36小时。在本发明的实施例中，可以将类器官培养约24至约96小时，优选约36至约72小时。在本发明的优选实施例中，将类器官培养约48小时。
通过将细胞培养基/细胞外基质的混合物转移到离心管中并离心，以保留由细胞外基质形成的凝胶层，可以从生物反应器中回收I阶段类器官。然后可以将凝胶层与细胞回收溶液一起孵育，并离心以形成类器官沉淀。
细胞回收溶液是本领域熟知的，并且是技术人员熟悉的。细胞回收溶液用于分解细胞外支持基质以释放出类器官并且不造成损坏。合适的细胞回收溶液包括康宁的细胞回收溶液。
在从生物反应器中除去I阶段类器官后，优选将类器官(其可以是类器官沉淀的形式)悬浮在细胞培养基中，所述细胞培养基可以包含营养混合物，例如Ham′s F12。然后可以通过具有不同筛孔尺寸的至少两个细胞过滤器筛选类器官，以获得直径为约20μm至约200μm的II阶段类器官的悬浮液。
如上所述，类器官的大小可以通过细胞过滤器的筛孔尺寸来控制。例如，细胞过滤器可具有约20μm和约200μm，优选约30μm和约100μm，更优选约40μm和约85μm的筛孔尺寸。具体而言，包含回收的I阶段类器官的悬浮液可以通过具有大筛孔尺寸(例如85μm)的第一细胞过滤器，并且可以丢弃大于该筛孔尺寸的所有类器官。然后，过滤后的内容物可以通过具有比第一细胞过滤器小的筛孔尺寸的第二细胞过滤器(例如40μm)，并且可以丢弃小于该筛孔尺寸的所有碎片。因此通过第一和第二细胞过滤器的筛孔尺寸，可以确定保留的II阶段类器官的尺寸。在上述实施例中，II阶段类器官的直径为约40μm至约85μm。
II阶段类器官可以冷冻用于储存或运输。具体而言，可以将II阶段类器官重悬于冷冻培养基中，浓度为每200μl冷冻培养基中约10,000至约500,000个类器官，优选每200μl冷冻培养基中约20,000至约300,000个类器官，更优选每200μl冷冻培养基中约50,000至约100,000个类器官。然后可将悬浮的类器官在-80℃下冷冻。
冷冻培养基对于本领域技术人员来说是熟悉的，通常包含细胞培养基和二甲基亚砜(DMSO)的混合物，可选地还包括胎牛血清(FCS)。合适的冷冻培养基可通过商购获得，包括Gibco Recovery Cell Culture Freezing Medium。
附图说明
现在将结合一个或多个具体的实施例描述本发明，其中：
图1显示了类器官的标准小规模培养和本发明的进料板生物反应器的比较。A显示了24孔板，其总共含有12ml的细胞培养基、1.2ml的Matrigel和480万个细胞。B显示了100mm的进料板生物反应器，其含有15ml细胞培养基、6ml的Matrigel或Matrigel与培养基的混合物和240万个细胞。
图2显示了级分过程的示意图，其中将I阶段类器官通过两个不同筛孔大小的细胞过滤器筛分，以获得II阶段类器官的悬浮液。右下图显示了使用筛孔尺寸为85μm和40μm的细胞过滤器获得的II阶段类器官的尺寸分布。
图3A和图3B显示了WEE1抑制剂对使用本发明的进料板生物反应器培养的类器官的影响。向培养的类器官供给25μl含有1至2.5μM MK1775(WEE1抑制剂)的生长培养基(8复孔)。图3A：5天后，将类器官固定并用Hoeschst(特异于DNA，即真核细胞的细胞核)和鬼笔环肽(特异于F-肌动蛋白)染色。未经处理的培养物或低浓度抑制剂中的类器官的总体形状从圆形和囊状到卷曲和分枝不等。随着抑制剂浓度的增加，细胞从类器官的外层脱落，导致复杂性降低以及总体的尺寸减小。图3B：对类器官参数的形态测定分析证实了毒性的观察结果。随着抑制剂浓度的增加，类器官的尺寸减小，而凋亡细胞核和细胞核圆度(由于细胞凋亡前的肿胀)均随药物的浓度增加而增加。
具体实施方式
实施例1-结肠直肠类器官的培养步骤
1.未加工类器官的维持
所有维持的方案均在II级层流柜内进行，以保持无菌状态。
3+培养基含有AdvancedDMEM/F12(含高葡萄糖和丙酮酸，其中DMEM为达尔伯克改良伊格尔培养基)，并补充有HEPES、1×GlutaMax和青霉素/链霉素(100U/mL)。
6+培养基含有AdvancedDMEM/F12(含高葡萄糖和丙酮酸)，并补充有HEPES、1×GlutaMax、青霉素/链霉素(100U/mL)、1×B27、1×N2和1.25mM n-乙酰半胱氨酸。
1.1手动研磨方案(ISO50，ISO78)
使用未补充的DMEM/F12培养基进行研磨，预平衡至4℃。将以冷冻的等分试样储存的新鲜Matrigel解冻，并在冰上保持液化形式。
用冷却的培养基替换24孔板中聚合的Matrigel中的类器官上的培养基。用1000μL移液管尖端的末端将Matrigel的圆顶破坏。将不超过3个孔的内容物合并在15ml管中，置于冰上。加入冷却的培养基以稀释用过的Matrigel。然后通过1000rpm离心3分钟使类器官沉淀，并通过抽吸除去旧培养基和Matrigel。将来自几个管子的沉淀的类器官合并在约400μl培养基的体积中，并使其通过1000μL移液管尖端上下至少100次进行解聚。加入冷却的培养基，通过离心使类器官沉淀，抽吸除去培养基，留下干燥的沉淀。加入所需体积的新鲜100％Matrigel，并将混合物以每孔50μL铺板于24孔板(或根据需要)。在室温下聚合Matrigel至少15分钟后，向每个孔中加入500μL“6+”隐窝培养基，并将板在37℃和5％CO2的加湿培养箱中培养。每2-3天更换培养基，直到Matrigel的类器官变得太大或太密，并且需要通过胰蛋白酶消化或研磨来重复解聚。
1.2胰蛋白酶消化(ISO72)
使用无添加的DMEM/F12培养基和预平衡至室温的TrypLE进行胰蛋白酶消化的步骤。将保存在冷冻的等分试样中的新鲜Matrigel解冻并在冰上保持液体状态。
将Matrigel中的类器官在PBS中洗涤，然后在TrypLE(250μL/50μL Matrigel圆顶)中于37℃孵育3分钟。通过用等体积的DMEM/F12+10％FBS或特定的胰蛋白酶抑制剂(Invitrogen)来抑制酶从而终止反应。将Matrigel和培养基的混合物通过1000μL移液管吸头上下吸抽10-20次，以促进解聚。将多达3个孔的内容物合并在15ml锥形底试管中。加入DMEM/F12培养基以稀释所用的Matrigel，其在1000rpm离心3分钟后被吸出。将所需体积的100％Matrigel加入干燥的类器官沉淀中，并将混合物以每孔50μL铺板于24孔板(或视需要而定)。在室温下聚合Matrigel至少15分钟后，向每个孔中加入500μL“6+”隐窝培养基，并将该板在37℃和5％CO2的加湿培养箱中培养。每2-3天更换培养基，直到Matrigel的类器官变得太大或太密，并且需要通过胰蛋白酶消化或研磨重复解聚。
2.生物处理器方案
图1B显示了100mm平板式生物反应器及其与24孔板的比较(图1A)。
2.1生物处理器
生物处理是将类器官在100mm培养皿中和在“平板式”生物反应器中进行培养、然后使用85μm和40μm的Pluristrainer进行级分(参见第4节)从而将其分离成不同的大小以获得所需尺寸的类器官的过程。
100mm的盘式平板式生物反应器，有一个盖子，特别适用于入口和出口的阀门，以便于从培养皿中包含的类器官/Matrigel的混合物表面添加和吸出培养基。新鲜的生长培养基包含在“饲料储存器”瓶中，该瓶具有附接的HEPA过滤器和汲取管。另一个相同的瓶子是废物储存器。这些瓶子的管道连接到泵总管并通过管夹连接到蠕动泵，适当时允许将新鲜的培养基从培养瓶泵送到Matrigel表面上，或者将废弃培养基移除到废物容器中。因此，该系统被称为“进料板”生物反应器，因为培养基的交换不需要人工干预。
2.2接种“进料板”生物反应器(ISO50)
生物反应器的所有部分都是无菌的。根据需要，对部件进行高压灭菌或浸泡在70％酒精中灭菌。将预热至37℃的6+生长培养基置于“饲料”槽中。
根据上述步骤(1.2胰蛋白酶消化)，通过与TrypLE一起孵育来对类器官进行胰蛋白酶消化。从合并的胰蛋白酶化的类器官中吸出旧的Matrigel后，将沉淀重悬于10mL冷却的DMEM/F12中，并通过40μm的细胞过滤器。所得滤液主要由单细胞组成。(如果需要，可以收集并使用过滤器中捕获的较大聚集体。)在100mm培养皿中接种400,000-600,000细胞/ml的、总体积为6mL的100％Matrigel或Matrigel：6+培养基的混合物(包含2％至99.9％的Matrigel)。在室温或37℃下聚合Matrigel后，加入含有ROCK抑制剂的15mL 6+生长培养基。将该板在静态条件下孵育24小时。
2.3使用生物处理器
将含有接种在Matrigel中的细胞的100mm培养皿的盖子(参见2.1接种“进料板”生物反应器)替换为无菌的“进料板”生物反应器盖。将生物反应器、培养基瓶和相关的管子保持在37℃和5％CO2的加湿培养箱中，泵以0.9rpm保持0.59ml/hr的流速。在回收、级分和冷冻(参见下面的步骤)之前，通常将类器官培养48小时。
3.从Mattigel(或Matrigel培养基的混合物)中回收整个类器官
在整个过程中应保持无菌。
用PBS洗涤Matrigel/类器官层。加入10ml冷却的“细胞回收”溶液(Invitrogen)，并用1000mL枪头的末端破坏Matrigel层。将板在冰上温育25分钟，同时轻轻搅拌。然后将培养皿的内容物置于50mL管中，用DMEM/F12补足至50mL。通过1000rpm离心3分钟使类器官沉淀。或者直到看到类器官沉淀。吸出用过的Matrigel/培养基的混合物，并在级分前将类器官重悬于5-10mL的DMEM/F12中。
4.级分(筛分尺寸的方案)
将“回收的”类器官悬浮液(参见前一部分)依次通过细胞过滤器，以回收所需尺寸的类器官。示意图(图2)显示了85μm和40μm过滤器的过程。使用具有40％甘油和400μm孔径的Isoton II缓冲液，通过Beckman Coulter MS3在每个级分中获得对类器官的数量和尺寸的估计。使用TrypLE将一小部分滤液用胰蛋白酶消化成单细胞，并计数以估计类器官内的细胞总数，从而估计每个类器官的平均细胞数。
5.将类器官接种到384孔板中的冷冻方案
通过离心沉淀类器官，并重新悬浮在商业的冷冻混合物中，使得每毫升含500,000个类器官，每个冻存管装200μL(100,000个类器官)。将冻存管转移至“MrFrosty(梯度降温盒)”容器中并置于-80℃冰箱中至少24小时。然后将冻存管转移到其他容器中并在-80℃下长期储存。
实施例2-结肠直肠类器官的验证
药物滴定测定结果
将ISO50(分离数50)结肠直肠癌类器官在进料板生物反应器中培养3天，从Matrigel中回收并在-80℃下冷冻保存。随后将它们复活，并以每孔12μl Matrigel中含有350个类器官的密度接种于384孔板。用含有0-2.5μM的MK1775(WEE1抑制剂)(8个复孔)的25μl生长培养基培养类器官。5天后，固定类器官并用Hoechst(对DNA即真核细胞的细胞核特异的蓝色荧光染色)和鬼笔环肽(特异于F-肌动蛋白的粉红色染色)进行染色。
共聚焦成像显示细胞的蓝色细胞核具有粉红色染色的肌动蛋白丝(参见图3A)。肌动蛋白丝遍布整个结构，但更集中在管腔中，位于类器官的中心。从每个浓度的选定孔拍摄具有代表性的类器官。在未处理的培养物中或在低浓度的抑制剂下，类器官的总体形状可以从圆形和囊状变化为卷曲和分枝。随着抑制剂浓度的增加，细胞从类器官的外层脱落，导致复杂性降低以及总体的尺寸减小。
超过1000个类器官参数的形态测定分析证实了毒性的观察结果。示例图如图3B所示。随着抑制剂浓度的增加，类器官的尺寸减小。凋亡的细胞核和细胞核的圆度(由于凋亡前的肿胀)，均随药物的浓度的增加而增加。
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Claims (11)
1.一种培养类器官的方法，所述方法包括：
a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；
b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的筛选后的细胞悬浮液；和
c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基的生物反应器中，
其中，所述生物反应器为进料板生物反应器。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进料板生物反应器为平板式生物反应器。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为灌注式生物反应器。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述进料板生物反应器包括平行或连续进料的生物反应器的布置。
5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基包含约1％至约99％v/v的所述细胞外支持基质。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基包含约5％至约85％v/v的所述细胞外支持基质。
7.如权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外支持基质是可溶性的基底膜制剂。
8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外支持基质是Matrigel基质胶或Cultrex基底膜提取物。
9.如权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞过滤器的筛孔尺寸为约30μm至约50μm。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法，其还包括在所述生物反应器中培养所述细胞以形成I阶段类器官。
11.通过如权利要求1～10任一项所述的方法生产的类器官。
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