CN115418386B - 一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法及模型和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法及模型和应用。本发明提供的损伤愈合评价方法包括1）培养皮肤类器官；2）皮肤类器官细胞解离及自我修复评价；3）促/抑损伤愈合药物效力评价。本发明的方法可以高效率地制备更接近真实伤口修复特征、符合临床研究需求的皮肤类器官损伤愈合模型。

Description

一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法及模型和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法及模型和应用。
背景技术
皮肤是直接与外界环境相接触的组织，由表皮和真皮紧密结合而成，具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能。作为人体的屏障，皮肤所面临的环境挑战包括有害紫外线的穿透、有害病原体的入侵和水分的蒸发。更为重要的是，皮肤还能保护潜在的器官，这是有机体生存的基础保障。为抵御外界环境的变化，皮肤不断暴露在潜在的损伤之中，因此伤口愈合是所有高等生物生存的重要过程。
目前的体外伤口愈合模型，大多数还停留在模式动物，比如兔子、小鼠、猪等。以兔耳缺血性溃疡模型为例，其由于缝合血管产生缺血区，进而导致伤口的形成，但该模型不具备人伤口愈合的各个过程，因此不能完全模拟人的缺血性伤口。再以糖尿病小鼠模型为例，其用基因或化学因素诱导小鼠形成糖尿病，但由于人和小鼠的巨大差别，该模型难以模拟人类糖尿病的复杂过程，因此造成的伤口损伤修复过程也有所不同。显然的，传统的体外伤口愈合模型存在测试周期长，成本高，不能看到细胞的超细微的动态结构，不能大规模的对细胞损伤相关药物进行测试等问题。
目前也有研究利用类器官进行发育生物学、毛囊再生、皮肤损伤后移植修复等过程的报道，但目前还未涉及利用细胞自组装能力及其在伤口愈合过程测试方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于皮肤类器官模型的伤口愈合评价方法及应用。具体技术方案如下。
一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法，包括：步骤一：培养皮肤类器官：取人或动物的皮肤组织或细胞进行原代培养，将原代细胞培养为皮肤类器官，形成的皮肤类器官体积约为50-300μl；步骤二：皮肤类器官细胞解离及自我修复评价：用消化酶对所述皮肤类器官的细胞进行解离，待细胞解离后去除消化酶，然后加入新的Matrigel基质胶和细胞培养基使皮肤类器官进行自我修复，在不同时间点记录皮肤类器官的形态学变化；步骤三：促进损伤愈合或抑制损伤愈合药物效力评价：1）对解离的皮肤类器官加入促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物，所述药物包括TGF-β通路抑制剂、COX-2通路抑制剂和Wnt/β-catenin通路激活剂中的一种或几种；2）在不同时间点记录用所述药物处理后的皮肤类器官的形态学变化，通过判断细胞之间的连接紧密程度和形态完整度来判断皮肤类器官的修复程度。
可以理解的是，所述促/抑损伤愈合药物并不限于所列举的TGF-β通路抑制剂、COX-2通路抑制剂和Wnt/β-catenin通路激活剂中的一种或几种。
进一步，记录皮肤类器官的形态学变化的方法包括连续拍照记录、视频记录或显微镜下直接观察。
皮肤类器官（以下简称为“类器官”）解离后可观察到分离的单个细胞，原本平滑的边缘变为凹凸不平的曲线。修复后的类器官细胞紧密聚集，不可见分离的单个细胞。
进一步，所述步骤一包括以下步骤：1）取人或动物的皮肤组织并消化为细胞悬液，将所述细胞悬液过滤并以1000-1500rpm离心10-15分钟；2）离心后弃去上清液，将得到的皮肤细胞加入Matrigel基质胶（下文简称基质胶或Matrigel）后于冰上重悬细胞，然后种植于多孔板中；3）加入DMEM/F12培养基及细胞因子或化合物进行类器官培养，所述细胞因子或化合物包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632*、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a和N2中的一种或几种。
进一步，所述步骤二包括以下步骤：1）在皮肤类器官中加入消化酶进行解离，观察解离后的形态学变化，待基质胶开始溶解时停止解离，移除消化酶并加入新的Matrigel基质胶于37℃孵育至基质胶凝固；2）加入DMEM/F12培养基及细胞因子或化合物进行类器官的自我修复，所述细胞因子或化合物包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632*、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a和N2中的一种或几种。
进一步，所述消化酶包括TrypLE、Trypsin EDTA 试剂或Dispase II。
采用上述的一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法建立的皮肤损伤愈合模型，所述皮肤损伤愈合模型为正常皮肤类器官-皮肤类器官细胞损伤-细胞自组装-细胞修复的模拟伤口愈合模型。
上述的皮肤损伤愈合模型在测试皮肤损伤后细胞自组装过程（自组装能力）和修复过程（修复能力）中的应用。
进一步，所述细胞自组装过程和修复过程包括上皮细胞再生、上皮细胞迁移和/或上皮细胞增殖。
上述的皮肤损伤愈合模型在筛选皮肤损伤后促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物中的应用。
进一步，所述药物包括TGF-β通路抑制剂、COX-2通路抑制剂和Wnt/β-catenin通路激活剂中的一种或几种。
有益技术效果：
1）本发明利用皮肤类器官的自组装能力来模拟皮肤伤口愈合过程，测试多种化合物和细胞因子对皮肤损伤愈合过程的影响。本发明在皮肤类器官领域具有开创性。
2）本发明建立了体外快速模拟上皮细胞自我修复的模型，从细胞水平看到了伤口修复的过程，开创性地研究了细胞分散开之后重新建立连接的过程，建模成功率达到100%。同时与传统动物模型伤口愈合过程相比，时间周期极大缩短。本发明提供的皮肤类器官模型修复时间为3天，而传统动物模型以兔耳缺血性溃疡模型为例，创口周围水肿9天基本恢复，而缺血在9天时仍与术前有显著差异。此外，本发明建立的模型可以实现在96孔板中对潜在化合物或细胞因子进行大规模筛选，进而实现高通量检测。
3）本发明提供的基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法可以高效率地制备更接近伤口修复特征、符合临床研究需求的损伤愈合模型，克服了传统动物模型不能看到细胞的超细微动态结构，不能大规模的对细胞损伤相关药物进行测试等问题，传统动物模型总结见附图9a、9b和9c（其中，9a为猪感染创面模型、猪缺血性溃疡模型和鼠尾全层损伤模型特征汇总；9b为糖尿病小鼠模型和小鼠切除伤口夹板模型特征汇总；9c为兔耳缺血性溃疡模型和小鼠压疮模型特征汇总）。基于此，本发明提供的基于类器官的皮肤损伤愈合模型可以为探究伤口愈合发生发展机制、寻找和优化新的伤口愈合潜在的治疗方式等研究领域提供有利工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为小鼠皮肤类器官图；
图2为真实的皮肤类器官修复过程图；
图3为不同时间的皮肤类器官修复对比图；
图4为本发明其中一个实施例中加入SIS3的皮肤类器官修复对比图；
图5为用TrypLE消化前后的皮肤类器官对比图；
图6为本发明其中一个实施例中加入Nimesulide的皮肤类器官修复对比图；
图7为皮肤类器官用TryplE消化前，消化后，以及加入Nimesulide修复后的全过程示意图；
图8为本发明其中一个实施例中加入CP21R7 (CP21)的皮肤类器官修复对比图；
图9a为传统动物模型-猪感染创面模型、猪缺血性溃疡模型、鼠尾全层损伤模型特点总结图；图9b为传统动物模型-糖尿病小鼠模型、小鼠切除伤口夹板模型特点总结图；
图9c为传统动物模型-猪感染创面模兔耳缺血性溃疡模型、小鼠压疮模型特点总结图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的“损伤愈合”是指细胞之间从断裂解离到重新恢复连接的过程。
本发明所述的“建模成功”是指皮肤类器官的细胞断裂解离之后重新建立连接，该过程与正常皮肤组织在损伤之后再次形成细胞连接进行伤口修复的过程是一致的。
实施例1
培养皮肤类器官（建立皮肤类器官模型）。
1）安乐死小鼠，用75%乙醇反复喷淋小鼠尸体。
2）将小鼠放置吸水纸上，用剪刀取下颈段皮肤。
3）在预冷的PBS中反复漂洗皮肤组织，并用镊子去除皮肤组织上明显的血污。
4）用剪刀剪碎皮肤组织。
5）用15ml Trypsin在50ml BD管中重悬皮肤组织，加入10μl DNaseI，于37℃水浴锅中消化1小时，期间每10分钟取出上下颠倒。
6）用等体积的DMEM+10%FBS中和Trypsin。
7）将第6）步中的组织悬液通过70μm的滤网。
8）1500rpm 离心10分钟。
9）去掉上清液，收集沉淀后用5ml ACK于冰上重悬细胞，静置3分钟。
10）1500rpm离心5分钟。
11）去掉上清液，收集沉淀后加120μl Matrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，每孔30μl。
12）于37℃孵箱中凝固15分钟。
13）48孔板中，每孔加入DMEM/F12基础培养基（即DMEM和F12按照1：1混合）及细胞因子或化合物进行类器官培养，所述细胞因子或化合物包括B27（B27补充剂）、EGF（表皮生长因子）、R-spondin 1（人细胞生长编码蛋白）、FGF10（成纤维细胞生长因子）、Y-27632*（ROCK特异性通路阻断剂）、Glutamax（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）、Gastrin（胃泌素）、N-acetylcysteine（N-乙酰半胱氨酸）、Noggin（分泌型同二聚体糖蛋白）、A83-01（3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺）、Nicotinamide（烟酰胺）、WNT3a（WNT激动剂）和N2（N2补充剂）中的一种或多种。并在培养基周围加上PBS，防止蒸干。
14）每天观察和记录，培养基变黄再更换新的培养基或者传代。
可以理解的是，皮肤类器官的培养也可以用人的皮肤组织。
本实施例建立的小鼠皮肤类器官见附图1。其中附图1左侧为4倍镜拍摄，右侧为20倍镜拍摄；均可清楚看见小鼠皮肤类器官表面光滑，结构完整。
实施例2
皮肤类器官细胞损伤及自我修复过程模拟。
1）待原代细胞培养成为类器官后（一般为培养一周后），将其铺在96孔板中。首先吸去96孔板中的培养基，加入100μl消化酶，在37°C的培养箱中孵育，每过10分钟镜检一次。
2）在基质胶溶解之前，类器官会逐渐解离，解离后的类器官可观察到分离的单个细胞，原本平滑的边缘变为凹凸不平的曲线的形态学特征。
3）轻轻摇晃孔板，看到基质胶晃动时（即基质胶开始溶解），停止消化，吸出消化酶，加入新的基质胶，37°C孵育至基质胶凝固。
4）基质胶凝固之后，每孔加入60μl培养基及下述列举的细胞因子或化合物，让类器官开始自我修复。修复后的类器官应呈现出细胞紧密聚集、不可见分离的单个细胞的形态学特征。
细胞因子-浓度：B27-50X稀释；EGF-50ng/ml；R-spondin 1-250ng/ml（或30%条件培养基）；FGF10-100ng/ml；Y-27632*-10uM；Glutamax-100X稀释；Gastrin-1nM；N-acetylcysteine-1mM；Noggin-100ng/ml；A83-01-200nM；Nicotinamide-10mM；WNT3a-25ng/ml(或10%条件培养基)；N2-100X稀释。
其中，所述Glutamax为GIBCO产品；所述N2为GIBCO产品：N-2Supplement；所述B27为GIBCO产品：B27Supplement serum free。
可以使用的消化酶包括TrypLE、0.25% Trypsin EDTA试剂或Dispase II。其中，相比0.25% Trypsin EDTA试剂，TrypLE为非动物源性的消化酶，纯度更高，对细胞损伤更小，可以提高种板的成功率。TrypLE是在有血清或无血清环境中培养的多种不同细胞系的理想选择，应用范围更广，此外，TrypLE还具有超高稳定性，工作储存温度可以为室温保存6个月或37℃储存一周后酶活性仍不丢失。Dispase II则是一种非特异性金属蛋白酶，细胞生物学中常用于从不同的组织或器官分离单细胞，并用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。此外，Dispase II还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。与其他细胞生物学常用蛋白酶（如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等）相比，Dispase II具有快速有效、温和（能维持细胞膜完整性）、稳定性强（不受温度、pH及血清组分的影响）、应用广泛（可用于多种类型组织和细胞的分离等）的特点。
本实施例用TrypLE消化类器官，见附图5。消化前的类器官形态为光滑的圆形，消化后解离为一个一个的单细胞。
本实施例中皮肤类器官的细胞损伤及自我修复过程如下，见附图2：首先是类器官的解离阶段（Scattered epithelial cells），在TrypLE的作用下，组成类器官的各个细胞之间开始解离，失去类器官的结构，上皮细胞分离。然后是上皮细胞重排列阶段（Epithelium organization），在消除消化酶，重新加培养基之后，上皮细胞开始自己重新组装，细胞之间的距离变小，开始恢复原来的细胞排列，但是在这时，细胞之间的连接并没有恢复。然后再是修复阶段（Repairment），上皮细胞之间距离进一步变小，而且重新建立了细胞之间的连接，此时类器官的表面开始变得光滑，不再是一颗一颗的细胞形态。最后是修复完成（Organoid），组装修复完毕，重现类器官的形态，各个细胞开始重新执行之前的功能，维持一个类器官的稳态。
实施例3
将用实施例1方法制备的小鼠皮肤类器官按照实施例2的方法进行损伤，不加入任何促/抑损伤修复因子或药物的前提下，模拟损伤时间不同对修复过程的影响，连续拍照并选取不同时间节点记录类器官的形态学特征，见附图3。
分别设置了损伤0.5小时组和损伤6小时组。损伤6小时后，类器官修复能力明显变弱，不能再重新组装成为类器官。事实上，对于真实的皮肤组织，若损伤时间过长，其修复能力也会减弱，将导致永久纤维化或瘢痕的形成，不再能修复到完好如初。因此本实验证实了本发明提供的皮肤类器官模型损伤自我修复的过程与真实皮肤修复过程相符。
实施例4
本发明实施中添加TGF-β通路抑制剂SIS3。
1）将小鼠处死后用75%乙醇反复喷淋小鼠尸体进行消毒。取下小鼠颈段皮肤组织，于预冷的PBS中漂洗多次，同时用镊子除去组织上的血污。清洗彻底后，用剪刀将皮肤组织于50mlBD管盖上剪碎至肉糜状，向BD管内加入15ml Trypsin，盖上管盖颠晃BD管使剪碎后的皮肤组织均匀重悬，加入10μl DNaseI后置于37℃水浴锅中消化，每10分钟取出BD管上下颠倒20次，共消化1小时。水浴完成后，向BD管中加入等体积的DMEM+10%FBS中和Trypsin，并将该组织悬液用70μm的滤网过滤，所得滤液1500rpm离心10分钟。离心完成后，去掉上清液，收集离心管沉淀并用5ml ACK于冰上重悬细胞，静置3分钟。此后再1500rpm 离心5分钟，去掉上清液，收集离心管沉淀后加入120μl Matrigel 于冰上重悬细胞，将细胞悬液以30μl/孔种入48孔板中，于37℃孵箱中凝固15分钟。凝固完全后，每孔加150μl培养基，并在48孔板的外缘孔内加上PBS，保持类器官培养湿度。每天观察培养状态，待培养基变黄再更换新的培养基或者传代。镜检培养的细胞形态，待原代细胞培养成为类器官后（一般为培养一周后），将其铺在96孔板中，继续培养一周，待其状况稳定后，准备进行解离及自组装实验。
2）吸去96孔板中的培养基，每孔加入100μl TrypLE，放入37°C的培养箱中孵育，每过10分钟镜检一次，观察基质胶及细胞状态。在基质胶溶解之前，细胞会逐渐解离，轻轻摇晃96孔板，当观察到基质胶晃动时，停止消化。吸去TrypLE，加入新的基质胶，37°C孵育至基质胶凝固。待基质胶凝固后，每孔加入60μl培养基，实验组加入1μNA的SIS3，对照组加入1%的DMSO让类器官进行自我修复。
3）镜下连续拍照观察类器官的形态学特征，比较实验组和对照组形态恢复过程的差异。上述实验所用培养基为DMEM/F12和实施例2中列举的细胞因子及化合物的混合物。所述Glutamax为GIBCO产品；所述N2为GIBCO产品：N-2Supplement；所述B27为GIBCO产品：B27Supplement serum free。结果见附图4，实验组和对照组中，分别选取同一个培养孔里的3个不同类器官。
SIS3是Smad3的细胞渗透性抑制剂，可选择性抑制TGF-β1依赖的Smad3磷酸化和Smad3介导的细胞信号传导。在正常真皮成纤维细胞和硬皮病成纤维细胞中，SIS3减少TGF-β1诱导的I型前胶原表达和肌成纤维细胞分化。附图4结果显示，在实验组中，损伤修复后的类器官表面及边缘产生了增生，最终形态呈现异形的状态，而非规则的圆形；而对照组的类器官边缘平滑，形态圆润。提示实验组修复时需要形成更多的增生结构，可能与皮肤损伤修复时形成的瘢痕组织类似。
实施例5
本发明实施中添加COX-2通路抑制剂Nimesulide。
1）前期操作与实施例4一致。修复时，实验组加入1 μNA的Nimesulide，对照组加入1%的DMSO让类器官进行自我修复。
2）镜下连续拍照观察类器官的形态恢复，比较实验组和对照组恢复过程的差异，结果见附图6和附图7。
Nimesulide是一种选择性COX-2抑制剂，化学成分是N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰胺。Nimesulide可抑制创面组织中COX-2、VEGF的表达。有研究表明病理性瘢痕组织中COX-2蛋白表达显著高于正常皮肤、扁平瘢痕，提示病理性瘢痕形成可能与COX-2的表达有关。后续研究表明，Nimesulide通过对COX-2信号通路进行调控对于皮肤伤口愈合有明显的影响，适当浓度的Nimesulide能够抑制伤口炎症反应，使成纤维细胞迁移控制在合适的程度，可以减少病理性瘢痕的形成。对应到类器官水平，附图6和附图7的结果显示，与对照组相比，实验组的类器官修复后边缘平滑，形状圆润完整，而对照组反而呈现出异形、边缘连接皱褶的状态。这印证了Nimesulide通过调节伤口愈合速度从而减少瘢痕产生的观点。
实施例6
本发明实施中添加Wnt/β-catenin通路激活剂CP21R7 (CP21)。
1）前期操作与实施例4一致。修复时，实验组加入1 μNA的CP21R7 (CP21)，对照组加入1%的DMSO让类器官进行自我修复。
2）镜下连续拍照观察类器官的形态恢复，比较实验组和对照组恢复过程的差异，结果见附图8。
CP21R7 (CP21)是一种有效的、选择性的GSK-3β抑制剂，可以显著激活Wnt/β-catenin信号通路。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分，在控制胚胎发育和组织器官形态发生上起到关键作用。β-catenin蛋白在创面愈合增殖期间质细胞中表达增高。皮肤损伤后，β-catenin在真皮成纤维细胞核内持续增高，有利于成纤维细胞的增殖与迁移，同时反馈激活TGF-β信号通路。对应到类器官水平，附图8结果显示，与Nimesulide处理组相似：实验组类器官修复后几乎与损伤前的类器官形态一致，类器官个体较大，边缘平滑，立体性强，而对照组反而表现出平整度差、质地不均的状态。这与CP21R7 (CP21) 可以显著激活Wnt/β-catenin信号通路是相符的。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：培养皮肤类器官：
取人或动物的皮肤组织或细胞进行原代培养，将原代细胞培养为皮肤类器官，形成的皮肤类器官体积为50-300μl；
步骤二：皮肤类器官细胞解离及自我修复评价：
用消化酶对所述皮肤类器官的细胞进行解离，待细胞解离后去除消化酶，然后加入新的Matrigel基质胶和细胞培养基使皮肤类器官进行自我修复，在不同时间点记录皮肤类器官的形态学变化；
步骤三：促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物效力评价：
1）对细胞解离的皮肤类器官加入新的Matrigel基质胶和细胞培养基，然后加入促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物，所述药物包括TGF-β通路抑制剂或COX-2通路抑制剂和Wnt/β-catenin通路激活剂中的一种或几种；
2）在不同时间点记录用所述药物处理后的皮肤类器官的形态学变化，通过判断皮肤类器官细胞之间的连接紧密程度和形态完整度来判断皮肤类器官的修复程度。
2.如权利要求1所述的损伤愈合评价方法，其特征在于，记录皮肤类器官的形态学变化的方法包括连续拍照记录、视频记录或显微镜下直接观察。
3.如权利要求1所述的损伤愈合评价方法，其特征在于，所述步骤一包括以下步骤：
1）取人或动物的皮肤组织并消化为细胞悬液，将所述细胞悬液过滤并以1000-1500rpm离心10-15分钟；
2）离心后弃去上清液，将得到的皮肤细胞加入Matrigel基质胶后于冰上重悬细胞，然后种植于多孔板中；
3）加入DMEM/F12培养基及细胞因子或化合物进行类器官培养，所述细胞因子或化合物包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a和N2中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的损伤愈合评价方法，其特征在于，所述步骤二包括以下步骤：
1）在皮肤类器官中加入消化酶进行解离，观察解离后的形态学变化，待基质胶开始溶解时停止解离，移除消化酶并加入新的Matrigel基质胶于37℃孵育至基质胶凝固；
2）加入DMEM/F12培养基及细胞因子或化合物进行类器官的自我修复，所述细胞因子或化合物包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a和N2中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的损伤愈合评价方法，其特征在于，所述消化酶包括TrypLE、Trypsin EDTA 试剂或Dispase II。
6.采用权利要求1-5任一项所述的一种基于皮肤类器官的损伤愈合评价方法建立的皮肤损伤愈合模型，其特征在于，所述皮肤损伤愈合模型为正常皮肤类器官-皮肤类器官细胞解离及自我修复评价-皮肤类器官促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物效力评价模型。
7.权利要求6所述的皮肤损伤愈合模型在测试皮肤损伤后细胞自组装过程和修复过程中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞自组装过程和修复过程包括上皮细胞再生、上皮细胞迁移和/或上皮细胞增殖。
9.权利要求6所述的皮肤损伤愈合模型在筛选皮肤损伤后促进损伤愈合或抑制损伤愈合的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括TGF-β通路抑制剂、COX-2通路抑制剂和Wnt/β-catenin通路激活剂中的一种或几种。
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