JP6695964B2 - 微小毛包を調製するための毛母細胞の使用 - Google Patents

微小毛包を調製するための毛母細胞の使用 Download PDF

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Description

本発明は、毛母細胞（ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌｓ）の培養および増幅により微小毛包（ｍｉｃｒｏ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）を産生する方法に関する。
同様に、本発明は、上記方法により産生される微小毛包に、ならびに脱毛症を治療するため、およびさらには化粧品、医薬および皮膚用製品の効果を評価するためのその使用に関する。
脱毛症は、種々の因子：遺伝子、ホルモンおよび環境因子により、食事を、ならびに身体活動を条件として発症する。毛髪は、不可欠な美容およびアイデンティティの役割を有する。したがって、女性または男性における脱毛症は、かなりの心理的苦痛の原因となり得る。
したがって、ほとんどの女性および男性において、生涯にわたる健康で強靭な毛髪および稠密な頭髪が熱望される。
脱毛症を治療するための多くの技術、例えば、細胞療法、レーザ療法または手術を伴わないインプラントが公知である。後者は即効的結果を与え、手術よりもはるかに侵襲性が低い。
インプラントを得るため、ヒト毛包は、毛球に存在する種々の細胞タイプを培養することにより得られる。
毛球は洋ナシ形状であり、それは、
− 皮膚由来の出芽物であり、毛包の基部に位置する毛乳頭（ｐａｐｉｌｌａ）。これは成長因子および細胞外毛母体タンパク質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のその貯蔵を介する毛髪の栄養摂取およびその成長の調節に関与する血管の多い部位である。この情報は毛母体中で産生された毛母細胞に伝達され、その分化を可能とする（非特許文献１）；
− 毛乳頭を包み込む区域であり、それほど分化していない毛母細胞の集塊から構成される毛母体。これは、強力な有糸分裂活性のシートである。毛球に位置し、毛乳頭周囲の小細胞集塊を形成する毛母細胞は、主として、毛芽層を構成し、急激に増殖して分化して毛幹を形成するケラチノサイトの前駆体から構成され、したがって、毛周期における不可欠な役割を担う。成長期の開始から前記期の終了まで、それらの毛母細胞は退行期まで増殖し、次いで休止期において消失する。（非特許文献２）、（非特許文献３）。細胞分化は、外上皮鞘（ＯＲＳ）の、内上皮鞘（ＩＲＳ）の、および次いで毛幹の種々の細胞タイプの形成を可能とする。毛髪の形状を調整するのも、この毛母体である。毛母体は、直毛についてほぼ対称軸で均一に分布する一方、それは縮毛について片側で大きく分布する（非特許文献１）；（非特許文献４）。毛母体は、毛髪の色素沈着を担う毛包メラノサイトも含む。これらの毛母細胞の増殖および分化は、毛乳頭により制御される（非特許文献５）；
− 角化区域としても公知の毛球の上方毛母体により産生される外および内上皮鞘。外上皮鞘は毛包の外殻を構成し：これは表皮の陥入である。これは、毛包が周期的に再生される特定の幹細胞を包む。内上皮鞘は、外上皮鞘を毛幹から離隔する。この鞘は、毛髪の成長を伴う同心円状の角化層において組織化される３つの細胞タイプから構成される。ヘンレ層、ハックスレー層および扁平細胞から形成され、毛母体に方向付けされる毛小皮が区別される；
− 部分的に可視的である毛幹、すなわち毛髪。毛幹の構造は、外側から内側まで３つの区別される層から構成される。毛小皮、毛皮質および毛髄が存在し、全て、ケラチノサイト全てを構成する
から構成される。
ヒト毛包に多少近い毛包は、数年間開発されている。例えば、以下の文献：（特許文献１）、（特許文献２）に記載の毛球の種々の細胞を培養することにより得られる毛包を挙げることができる。
これにもかかわらず、これらのモデルは、毛幹の形成に不可欠な細胞である毛母細胞を、ヒト微小毛包の特徴のほとんどを表すために十分な量で含有しない。
欧州特許第２２７４４１９号明細書 欧州特許第２４４７３５７号明細書
Ｒｅｅｓ ＪＬ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈａｉｒ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃｏｌｏｒ；Ｖｏｙａｇｅ ３Ｄ ａｕ Ｃｏｅｕｒ ｄｕ ｃｈｅｖｅｕ［３Ｄ ｖｏｙａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｉｒ］ウェブサイト−ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｈａｉｒ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ Ｅｂｌｉｎｇ ＦＪ．Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈａｉｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ．１９８７ Ｊｕｌ；５（３）：４６７−８１ Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓａｉｔｏｈ Ｍ，Ｕｚｕｋａ Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｃｙｃｌｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７０，Ｊａｎ ５４，ｐａｇｅｓ ６５−３２ Ｍｅｌｉｓｓｏｐｏｕｌｏｓ Ａ ａｎｄ Ｌｅｖａｃｈｅｒ Ｃ．Ｌｅｓ ａｎｎｅｘｅｓ ｃｕｔａｎｅｅｓ［Ｔｈｅ ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅｓ］．Ｉｎ：Ｌａ ｐｅａｕ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ［Ｔｈｅ ｓｋｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ］，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ；１９９８．Ｐ．５７−９９ Ｂｏｔｅｈｋａｒｅｖ ＶＡ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｙｃｌｉｎｇ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｙｍｐ Ｐｒｏｃ．２００３ Ｊｕｎ；８（１）：４６−５５．Ｒｅｖｉｅｗ
驚くべきことに、本出願人は、毛母体の細胞をＹ２７６３２の存在下で培養することが、その細胞のかなりの増殖およびコンフルエンスに達する一方、規則的なクラスタを形成するＫ８５Ｋ３５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへのその分化を可能とすることを実証した。
３Ｄ培養で配置されるその細胞は、意外にも、特にケラチノサイトおよびメラノサイトを含むインビボの微小毛包の特徴のほとんどを示す微小毛包を得ることを可能とする。この毛包を形成する細胞は、ｋ８５ｋ３５マーカーを発現する特徴を示す。
したがって、本発明による方法は、微小毛包の形成に要求される全ての細胞タイプを提供する単一細胞タイプ、毛母細胞のものを使用することにより微小毛包を得ることを可能とする事実に起因して有利であることが証明される。
したがって、本発明の第１の主題によれば、本発明は、微小毛包を調製するための毛母細胞の使用に関する。
図面により本発明のより良好な説明を付与することが可能となるが、本発明の範囲を限定するものではない。
毛母細胞の位置を示す図である。 毛乳頭上方の分割部を示す図である。 毛母細胞を含有する毛球を示す図である。 ３Ｔ３フィーダー層上に堆積した毛母細胞集塊を示す図である。 培養３日後の毛母細胞を示す図である。 培養１０日後のコンフルエンスにおける毛母細胞を示す図である。 クラスタ形成を伴う毛母細胞の一次培養を示す図である。 ３Ｄ培養３日後の毛母細胞のスフィアを示す図である。 ３Ｄ培養における芽状物形成を示す図である。 芽状物は、Ｋ８５およびＫ３５について強力に陽性であることを示す図である。 微小毛包を示すスフィアを示す図である。 ＯＲＳケラチノサイトからの３Ｄ培養において芽状物形成は見られないことを示す図である。
微小毛包を調製するための毛母細胞の使用
用語「毛母細胞」は、毛球に位置し、毛乳頭周辺の小細胞集塊を形成する細胞を意味するものとする（Ｅｂｌｉｎｇ ＦＪ．Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈａｉｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ．１９８７ Ｊｕｌ；５（３）：４６７−８１．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓａｉｔｏｈ Ｍ，Ｕｚｕｋａ Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｃｙｃｌｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７０ Ｊａｎ；５４（１）：６５−８１）。これらの細胞の試料を採取することができ、後続の使用目的のためにそれを増幅させ、組織ライブラリー中で貯蔵することができる。
毛母組織の統合性を保存するため、以下の方法に従ってこれらの細胞をサンプリングすることができる：２％の抗生物質および非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿に毛包を位置させる。毛球領域を毛乳頭の頂部において切断し、したがって毛球の上皮を毛乳頭から、および結合組織鞘から分離する。毛母細胞は、微小毛包の調製に要求される全ての細胞を提供し、したがって微小毛包を調製するための毛母細胞の使用は他の細胞タイプを要求せず、いかなる外因性細胞の提供もなしで実施することができる。
微小毛包を得るために十分な量の毛母細胞を得るため、本出願人は、コンフルエンス時にクラスタを形成するＫ８５Ｋ３５ケラチノサイトに分化するようにそれらの細胞を増幅させる方法を開発した。
したがって、本出願人は、微小毛包を調製する方法であって、毛母細胞を、Ｋ８５Ｋ３５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへの前記細胞の分化を可能とするために十分な一定期間、有効量のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で増幅させる少なくとも１つのステップを含む方法を開発した。
微小毛包を調製するこの方法は、
ａ− 頭皮試料から毛包を単離するステップ；
ｂ− 培養培地に浸漬させた前記担体上で、毛球領域を毛乳頭上方で切断するステップ；
ｃ− 結合組織鞘から、および毛乳頭から毛母細胞を細胞集合体の形態で分離するステップ；
ｄ− グリーン（ｇｒｅｅｎ）７Ｆ培地中でマイトマイシンにより遮断された３Ｔ３ｉ線維芽細胞のフィーダー層上で細胞集合体を堆積させるステップ；
ｅ− 毛母細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で前記担体の表面において増幅させるステップ；
ｆ− Ｋ８５Ｋ３５ケラチノサイトを回収するステップ；
ｇ− ステップｆ）において得られたケラチノサイトを３Ｄ培養で培養するステップ
を含むことを特徴とする。
顕微解剖
毛母細胞は、成長期における毛髪からのみサンプリングすることができる。
毛母体の領域は、極めて少数の細胞を含有する。
したがって、克服すべき１つの困難性は、高品質および十分量の毛母細胞を得ることである。
これは、通常条件下、毛髪が抜ける場合、または引き抜かれた後、毛乳頭−毛母細胞コンパートメントが頭皮の真皮中に留まるためである。このコンパートメントは、新たな毛周期の発生を開始させ、新たな微小毛包を再度生じさせる。
したがって、毛髪の引き抜きによってはそれらの毛母細胞を得ることが可能でなく；したがって、頭皮生検を実施し、次いでそれらの細胞を顕微解剖により単離することが必要である。
本発明によれば、毛母細胞は、細胞の量および統合性を保存する新規顕微解剖技術により得られる。それというのも、毛母細胞が互いに分離されないためである。これは、微小毛包が担体上で単離され、毛球領域が毛乳頭上方で切断され、毛母細胞が同一担体上で細胞集合体の形態で回収されるためである。この顕微解剖により、毛母細胞の全てを単離および保存することが可能となる。
増幅
毛母細胞は、単離困難であることに加え、少なくとも以下の理由のため培養も困難である：
ａ）毛母細胞の数が特に少ない；
ｂ）毛母細胞は容易に解離し、したがって顕微解剖の間にそれらを正確に特定することが困難である；
ｃ）毛母細胞はプラスチック担体に接着しない；
ｄ）毛母細胞は毛乳頭からのまたは結合組織鞘からの線維芽細胞により汚染されることが多いため、純粋形態での増幅が困難である。
一部の著者らは、毛母細胞を毛乳頭線維芽細胞との同時培養で培養することを提案している。この方法の欠点は、得られる培養物が均一でなく、毛母細胞が同時培養に使用される毛乳頭からの真皮線維芽細胞により汚染されることである（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＡＪ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＣＭ，Ｊａｈｏｄａ ＣＡ Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９３ Ｏｃｔ；１０１（４）：６３４−８）。
Ｌｕｏらは、顕微解剖とそれに続くプラスチック担体上での毛母細胞の培養の技術を提案している（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌｓ；Ｒｅｇ．ｎｕｍｂｅｒ：Ｈ１６１０；Ｎｏｖ．５，１９９６）。しかしながら、この顕微解剖技術は毛母細胞の極めて低い収量をもたらす。
本出願人は毛母細胞を単離し、それらの細胞を培養する方法を開発した。具体的には、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２成長因子の存在下で、毛母細胞は、それがコンフルエンスに達する一方、規則的なクラスタを形成するまで急速に増殖し、Ｋ８５Ｋ３５ケラチノサイトに分化する。
ＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎ（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６，３３１−３４４，１９７５）の技術に従って、成長因子、特にアミノ酸、血清、コレラ毒素、インスリン、トリヨードサイロニンおよびｐＨ緩衝溶液の存在下で、当業者に公知の好適な培地中で線維芽細胞から構成されるフィーダー担体上で培養することにより細胞を増幅させる。特に、このような培養培地は、特に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２が添加された、ケラチノサイトのための少なくとも１つの細胞分裂成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）および／またはケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、特にＫＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび場合により抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ）を含有し得る。
有利には、前記培地は、例えば、ウシ由来の血清もしくは下垂体抽出物、エピネフリン、トランスフェリンおよび／または非必須アミノ酸も含み得る。
この培養に使用される線維芽細胞は、より好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞である。３Ｔ３線維芽細胞は当業者に周知である。線維芽細胞系は、１９６２年から公知である。「３Ｔ３」は、「３日毎の継代、３×１０５個の細胞の接種材料」を意味する。
細胞培養は、好ましくは、線維芽細胞（好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞）上での培養であり、その増殖は、好ましくは、既にそれを放射線照射（例えば、ＵＶ照射による）することにより、または既にそれをマイトマイシンにより処理することにより事前に停止されている。マイトマイシン（特にマイトマイシンＣ）は線維芽細胞の増殖を遮断するが、線維芽細胞がケラチノサイト増殖に有用な栄養物質を産生するのを妨害しない。
この技術を用いると、毛母細胞はそれが他の細胞タイプから分離された担体上で増殖する。これにより、十分な数の毛母細胞を保存することが可能になる。細胞は、コンフルエンスまでＹ２７６３２の存在下で急速に増殖し、早期毛髪ケラチンマーカーＫ３５およびＫ８５について陽性である細胞に分化する一方、規則的なクラスタを形成する。
本発明によれば、用語「有効量」は、コンフルエンスにおけるＫ８５Ｋ３５ケラチノサイトの培養物を得るために要求される量を示す。
本発明によれば、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の有効量は、１〜１００μＭであり、好ましくは、５〜２５μＭであり、好ましくは、１０μＭである。
本発明によれば、毛母細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間培養する。
用語「クラスタ」は、一緒に群化した細胞の集塊を意味するものとする。
用語「コンフルエンスにおける」は、適切な担体上で単層で培養されるそれぞれの接着細胞間の間隔を有さない細胞層を意味するものとする。
微小毛包を得るための３Ｄ培養におけるＫ３５およびＫ８５分化細胞の培養
Ｋ３５およびＫ８５マーカーについて陽性であり、コンフルエンス時に規則的なクラスタを形成するケラチノサイトは、酵素的処理により回収する。
３Ｄスフィアは、ハンギングドロップ法または非接着細胞を培養するためのマイクロプレートを用いる方法（ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ白色紙システム）によりＩｎｓｐｈｅｒｏタイプの９６ウェルマイクロプレート上で得る。
次いで、細胞を３７℃においてグリーン培地中で培養し；微小毛包の出現は培養の少なくとも５日後に観察される。
一実施形態によれば、細胞を培養で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも５日間維持する。
好ましくは、培養で配置される細胞の数は、１０００〜４０００個の細胞であり、好ましくは、３０００個の細胞である。
本発明の別の主題は、本発明による方法により得ることができる微小毛包である。
この微小毛包により、毛量低減状態、特に脱毛症の予防または治療処置のためにそれを使用し、化粧品および／もしくは医薬活性剤の活性または局所成分の副作用についての予測試験を構成することが可能となる。
毛量低減状態、特に脱毛症の予防または治療処置
微小毛包がインビボでの毛包の特徴を有することを考慮すると、それを場合により、代用皮膚と組み合わせたインプラントとして使用することができる。
したがって、本発明による微小毛包は、皮膚障害、例えば、火傷、治癒不全または白色もしくは灰色に変色した毛髪を治療するためのインプラントおよび／または代用皮膚の調製のための使用も有する。
治療効果は、全体的か部分的かにかかわらず、正常な毛量状態への復帰として定義される。
本発明の目的のため、予防的治療は、対象が脱毛についての前提条件、例えば、家族性体質を有する場合に推奨される。
毛髪量低減の病態は、脱毛症、遺伝性禿頭、瘢痕、火傷または不慮の損傷による結果であり得る。
化粧品および／または医薬活性剤の活性についての予測試験
本発明による微小毛包同等物により、特に体毛または頭髪の経時的成長ならびにしたがって、インビボ状況で生存し、可能な限り完全な多数の毛髪を要求する任意の試験、例えば、毛周期の試験およびこの周期に影響し得る因子の試験（毛髪成長を促進する活性剤の試験まで及ぶ）、脱毛の撲滅を可能とする活性剤の試験または体毛成長を減速させる活性剤の試験を実施することが可能となる。
新規活性剤を同定する目的のための産物スクリーニングプロセスは、前記試験産物を、本発明による頭皮同等物と接触させるステップ（ａ）、次いで頭皮同等物の少なくとも１つのパラメータに対する前記産物の効果を分析するステップ（ｂ）および前記パラメータを改変する産物を選択するステップ（ｃ）を含む。
好ましくは、ステップ（ａ）を実施するため、試験産物を局所的に施与し、例えば、慣用の局所配合物中に配合し、または培養培地中に導入する。
ステップ（ｂ）は、特に、微小毛包の品質と、および／またはホメオスタシスと関連するマーカー、例えば、上皮および／または真皮マーカー、例えば、構造タンパク質の発現、産生および／または活性を分析することにより実施することができる。構造タンパク質の一例としては、毛髪ケラチンを挙げることができる。
このため、毛幹の成長に対する産物の効果をスクリーニングプロセスのステップ（ｂ）において分析する。
産物の効果を分析するステップ（ｂ）は、好ましくは、試験産物と接触させた微小毛包に対して計測された少なくとも１つのパラメータと、同一条件下で培養されたが試験産物を受けなかった対照微小毛包に対して計測されたものとの比較である。
頭皮同等物のパラメータを改変する産物を選択するステップ（ｃ）は、事前に決定された基準に応じて実施する。
このパラメータの改変は、前記マーカーの発現の、産生の、および／もしくは活性の、ならびに／または毛幹の成長の刺激、減少または全体もしくは部分阻害であり得る。
前記産物を選択する基準は、例えば、この産物が計測パラメータに対する刺激または阻害効果を有することである。
本発明による頭皮同等物は、新規活性剤の同定のために化粧品、医薬または皮膚用化合物をスクリーニングする自動化プロセスにおいて使用することもできる。
下記の実施例は、本発明の非限定的な説明として提示する。
実施例１−微小毛包の調製
実験プロトコル
ｉ．毛母細胞顕微解剖
毛包を頭皮の手術残渣から抽出する。前記残渣を最初に５ｍｍ２片に切断し、次いで外科用メスを真皮および皮下組織間で使用して分割する。
毛包は、眼科手術用鉗子を使用して抽出し、次いで外科用メスにより毛乳頭真上で分割する（図２）。次いで、毛球を回収する（図３）。この段階において、毛球は２つのコンパートメントを含む：真皮コンパートメント（毛乳頭および結合組織鞘）。細胞集団を形成する毛母細胞。
上皮部分は、灌流針を使用して真皮部分から分離する。
ｉｉ．培養条件：
培養条件は、３つの主要な構成要素を有する：
・基礎培地：
特に示されない限り、本実施例において使用される培地および緩衝液の全ては、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９７９，（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７６，１２７４−１２７８）、Ａｓｓｅｌｉｎｅａｕ ａｎｄ Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ，１９８４，（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｄｅｒｍ．，１１１，２１９−２２２）またはＡｓｓｅｌｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，（Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏ．，ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｅｄ．Ｌｏｗｅ ＆ Ｍａｉｂａｃｈ，１−７）に記載されている。
ＭＥＭ培地＋１０％のＦＣＳ＋３Ｆ（３Ｆ培地と称する）は、以下の組成を有する。
Figure 0006695964
・培養サプリメント：細胞に、それが分裂または分化しなければならないことをシグナリングする成長因子。１０μＭのＹ２７６３２。
・接着表面：毛母細胞は、マイトマイシン処理により細胞周期を停止させたネズミ３Ｔ３線維芽細胞のフィーダー層の存在下でＧｒｅｅｎベース培地中で接着および増殖する。
ケラチノサイトの培養−増幅
顕微解剖後、毛母細胞集塊を直径６０ｍｍペトリ皿中で堆積させ、それに１００万個の３Ｔ３細胞を事前に播種し、完全培養培地により被覆し；コンフルエンスにおける毛母細胞の培養物を得る。
スフィアを生成するため、細胞をサブコンフルエント段階において酵素処理により回収する。スフィアは、既に記載されている慣用の技術（ハンギングドロップ、遠心分離、非接着担体）により種々の手法で得ることができる。ハンギングドロップの場合、３０００個の細胞をプレート中でインスフェロで（ｉｎ ｓｐｈｅｒｏ）配置する。これらの細胞を４８時間後に９６ウェルプレート中で回収してそれらの進行をモニタリングする。
非解離毛母細胞集塊を単離し、３Ｔ３フィーダー層上で堆積させる（図４）。培養３日後、細胞は、毛母体集塊周囲でコロニーの形態で増殖し始める（図５）。細胞は１０日後にサブコンフルエンスに達する（図６）。
これらの細胞は、極小サイズおよび強力な増殖能を特徴とする。増幅を確保するため、次いで、細胞をＴ７５フラスコ中に播種する。したがって、３つの毛球の培養３週間後、第１継代において約４０００万個の毛母細胞を生成することが可能である。
毛母細胞がインビトロで細胞集合体を極めて急速に形成し得ることを観察することが可能であった。この現象は、これらの細胞の走性に起因すると考えられる。グリーン７Ｆ培地中で、これらの集塊は、毛包芽状物のものを再現する規則的なパターンを形成する（図７）。
さらに、これらの集塊の形成の間、懸濁液中で多数の球状細胞が産生され、前記細胞を継代培養して新たな細胞培養物を生成することができる。特徴付け後、芽状物は毛母細胞の分化の第１段階を表し、それらは毛髪の早期ケラチン：Ｋ３５およびＫ８５について陽性である。
毛母細胞を用いる３Ｄ培養も実施した。これらの細胞は、培養３日後にスフィアを形成する（図８）。
培養約７日後、これらのスフィアは立体構造を変化させ、極性化された組織化を示す。出芽物が出現し、それはスフィアの分化を示すと考えられる（図９）。これらの芽状物はＫ８５およびＫ３５について強力に陽性である。
一部のスフィアは、角化されていると考えられ（図１０）、ＯＲＳケラチノサイト培養から出発する場合には見出されない線維の形態の構造を示す。

Claims (15)

  1. (i)毛球に位置する毛母細胞を、Ｋ８５およびＫ３５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへの前記細胞の分化を可能とするために十分な期間、有効量のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養するステップ、並びに
    (ii) ステップ(i)で得られたＫ８５およびＫ３５マーカーについて陽性であるケラチノサイトを３Ｄ培養するステップ、
    を少なくとも含む、微小毛包を調製するインビトロ方法。
  2. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＲＯＣＫ阻害剤の前記有効量が、１〜１００μＭである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＲＯＣＫ阻害剤の前記有効量が、５〜２５μＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＲＯＣＫ阻害剤の前記有効量が、１０μＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記毛母細胞を、前記ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間培養する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. Ｋ８５およびＫ３５マーカーについて陽性である前記ケラチノサイトがコンフルエンスに達する一方、規則的なクラスタを形成することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ａ− 毛包を担体上で単離するステップ；
    ｂ− 培養培地に浸漬させた前記担体上で、毛球領域を毛乳頭上方で切断するステップ；
    ｃ− 毛母細胞を、前記担体上の細胞集合体の形態で回収するステップ；
    ｄ− 前記毛母細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で増幅させるステップ；
    ｅ− Ｋ３５およびＫ８５マーカーについて陽性である前記ケラチノサイトを回収するステップ；
    ｆ− ステップｅ）において得られた前記ケラチノサイトを３Ｄ培養で培養するステップ
    を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップｆ）において、培養で配置されるケラチノサイトの数が、１０００〜４０００個の細胞であり、好ましくは、３０００個の細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 栄養培地が、３Ｆ培地であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を含む、毛量低減状態の予防または治療処置のための組成物の調製方法。
  12. 前記組成物が脱毛症の治療のためのものである、請求項１１に記載の組成物の調製方法。
  13. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により微小毛包を調製することを含む、毛髪特性に対する活性剤の効果のインビトロ試験方法。
  14. 体毛および／または頭髪の成長を変調する化合物の同定のための、請求項１３に記載のインビトロ試験方法。
  15. 新規活性剤を同定する目的のための産物スクリーニング方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により微小毛包を調製するステップ、前記試験産物を、前記微小毛包と接触させるステップ（ａ）、次いで頭皮同等物の少なくとも１つのパラメータに対する前記産物の効果を分析するステップ（ｂ）および前記パラメータを改変する前記産物を選択するステップ（ｃ）を含む、方法。
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