JP2018528784A - 微小毛包を調製するための毛母細胞の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
− 皮膚由来の出芽物であり、毛包の基部に位置する毛乳頭(papilla)。これは成長因子および細胞外毛母体タンパク質(extracellular matrix proteins)のその貯蔵を介する毛髪の栄養摂取およびその成長の調節に関与する血管の多い部位である。この情報は毛母体中で産生された毛母細胞に伝達され、その分化を可能とする(非特許文献1);
− 毛乳頭を包み込む区域であり、それほど分化していない毛母細胞の集塊から構成される毛母体。これは、強力な有糸分裂活性のシートである。毛球に位置し、毛乳頭周囲の小細胞集塊を形成する毛母細胞は、主として、毛芽層を構成し、急激に増殖して分化して毛幹を形成するケラチノサイトの前駆体から構成され、したがって、毛周期における不可欠な役割を担う。成長期の開始から前記期の終了まで、それらの毛母細胞は退行期まで増殖し、次いで休止期において消失する。(非特許文献2)、(非特許文献3)。細胞分化は、外上皮鞘(ORS)の、内上皮鞘(IRS)の、および次いで毛幹の種々の細胞タイプの形成を可能とする。毛髪の形状を調整するのも、この毛母体である。毛母体は、直毛についてほぼ対称軸で均一に分布する一方、それは縮毛について片側で大きく分布する(非特許文献1);(非特許文献4)。毛母体は、毛髪の色素沈着を担う毛包メラノサイトも含む。これらの毛母細胞の増殖および分化は、毛乳頭により制御される(非特許文献5);
− 角化区域としても公知の毛球の上方毛母体により産生される外および内上皮鞘。外上皮鞘は毛包の外殻を構成し:これは表皮の陥入である。これは、毛包が周期的に再生される特定の幹細胞を包む。内上皮鞘は、外上皮鞘を毛幹から離隔する。この鞘は、毛髪の成長を伴う同心円状の角化層において組織化される3つの細胞タイプから構成される。ヘンレ層、ハックスレー層および扁平細胞から形成され、毛母体に方向付けされる毛小皮が区別される;
− 部分的に可視的である毛幹、すなわち毛髪。毛幹の構造は、外側から内側まで3つの区別される層から構成される。毛小皮、毛皮質および毛髄が存在し、全て、ケラチノサイト全てを構成する
から構成される。
用語「毛母細胞」は、毛球に位置し、毛乳頭周辺の小細胞集塊を形成する細胞を意味するものとする(Ebling FJ.The biology of hair.Dermatol Clin.1987 Jul;5(3):467−81.Review;Saitoh M,Uzuka M,Sakamoto M.Human hair cycle.J Invest Dermatol.1970 Jan;54(1):65−81)。これらの細胞の試料を採取することができ、後続の使用目的のためにそれを増幅させ、組織ライブラリー中で貯蔵することができる。
a− 頭皮試料から毛包を単離するステップ;
b− 培養培地に浸漬させた前記担体上で、毛球領域を毛乳頭上方で切断するステップ;
c− 結合組織鞘から、および毛乳頭から毛母細胞を細胞集合体の形態で分離するステップ;
d− グリーン(green)7F培地中でマイトマイシンにより遮断された3T3i線維芽細胞のフィーダー層上で細胞集合体を堆積させるステップ;
e− 毛母細胞をROCK阻害剤の存在下で前記担体の表面において増幅させるステップ;
f− K85K35ケラチノサイトを回収するステップ;
g− ステップf)において得られたケラチノサイトを3D培養で培養するステップ
を含むことを特徴とする。
毛母細胞は、成長期における毛髪からのみサンプリングすることができる。
毛母細胞は、単離困難であることに加え、少なくとも以下の理由のため培養も困難である:
a)毛母細胞の数が特に少ない;
b)毛母細胞は容易に解離し、したがって顕微解剖の間にそれらを正確に特定することが困難である;
c)毛母細胞はプラスチック担体に接着しない;
d)毛母細胞は毛乳頭からのまたは結合組織鞘からの線維芽細胞により汚染されることが多いため、純粋形態での増幅が困難である。
K35およびK85マーカーについて陽性であり、コンフルエンス時に規則的なクラスタを形成するケラチノサイトは、酵素的処理により回収する。
微小毛包がインビボでの毛包の特徴を有することを考慮すると、それを場合により、代用皮膚と組み合わせたインプラントとして使用することができる。
本発明による微小毛包同等物により、特に体毛または頭髪の経時的成長ならびにしたがって、インビボ状況で生存し、可能な限り完全な多数の毛髪を要求する任意の試験、例えば、毛周期の試験およびこの周期に影響し得る因子の試験(毛髪成長を促進する活性剤の試験まで及ぶ)、脱毛の撲滅を可能とする活性剤の試験または体毛成長を減速させる活性剤の試験を実施することが可能となる。
実験プロトコル
i.毛母細胞顕微解剖
毛包を頭皮の手術残渣から抽出する。前記残渣を最初に5mm2片に切断し、次いで外科用メスを真皮および皮下組織間で使用して分割する。
培養条件は、3つの主要な構成要素を有する:
・基礎培地:
特に示されない限り、本実施例において使用される培地および緩衝液の全ては、Bell et al.1979,(P.N.A.S.USA,76,1274−1278)、Asselineau and Prunieras,1984,(British J.of Derm.,111,219−222)またはAsselineau et al.,1987,(Models in dermato.,vol.III,Ed.Lowe & Maibach,1−7)に記載されている。
・接着表面:毛母細胞は、マイトマイシン処理により細胞周期を停止させたネズミ3T3線維芽細胞のフィーダー層の存在下でGreenベース培地中で接着および増殖する。
顕微解剖後、毛母細胞集塊を直径60mmペトリ皿中で堆積させ、それに100万個の3T3細胞を事前に播種し、完全培養培地により被覆し;コンフルエンスにおける毛母細胞の培養物を得る。
Claims (19)
- 微小毛包を調製するための、毛球に位置する毛母細胞の使用。
- 微小毛包を調製する「インビトロ」の方法であって、前記毛球に位置する前記毛母細胞を、K85K35マーカーについて陽性であるケラチノサイトへの前記細胞の分化を可能とするために十分な期間、有効量のROCK阻害剤の存在下で培養する少なくとも1つのステップを含む、方法。
- 前記ROCK阻害剤が、Y27632である、請求項2に記載の方法。
- 前記ROCK阻害剤の前記有効量が、1〜100μMである、請求項2または3に記載の方法。
- 前記ROCK阻害剤の前記有効量が、5〜25μMである、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ROCK阻害剤の前記有効量が、10μMである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記毛母細胞を、前記ROCK阻害剤の存在下で少なくとも2日間、好ましくは、少なくとも3日間培養する、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- K85K35マーカーについて陽性である前記ケラチノサイトがコンフルエンスに達する一方、規則的なクラスタを形成することを特徴とする、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
- a− 前記毛包を担体上で単離するステップ;
b− 培養培地に浸漬させた前記担体上で、前記毛球領域を毛乳頭上方で切断するステップ;
c− 前記毛母細胞を、前記担体上の細胞集合体の形態で回収するステップ;
d− 前記毛母細胞を、ROCK阻害剤の存在下で増幅させるステップ;
e− 前記K35K85マーカーについて陽性である前記ケラチノサイトを回収するステップ;
f− ステップe)において得られた前記ケラチノサイトを3D培養で培養するステップ
を含むことを特徴とする、請求項2〜8のいずれか一項に記載の方法。 - ステップf)において、培養で配置されるケラチノサイトの数が、1000〜4000個の細胞であり、好ましくは、3000個の細胞であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 栄養培地が、3F培地であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2〜11のいずれか一項に記載の方法により得ることができる微小毛包。
- ROCK阻害剤の存在下での前記毛球に位置する毛母細胞の増幅および分化から生じる細胞から構成されることを特徴とする、請求項12に記載の微小毛包。
- 前記ROCK阻害剤が、Y27632であることを特徴とする、請求項13に記載の微小毛包。
- 毛量低減状態の予防または治療処置のための、請求項12〜14のいずれか一項に記載の微小毛包。
- 脱毛症の治療のための、請求項12〜14のいずれか一項に記載の微小毛包。
- 毛髪特性に対する活性剤の効果のインビトロ試験のための、請求項12〜16のいずれか一項に記載の微小毛包の使用。
- 体毛および/または頭髪の成長を変調する化合物の同定のための、請求項17に記載の微小毛包の使用。
- 新規活性剤を同定する目的のための産物スクリーニング方法であって、前記試験産物を、請求項12〜16のいずれか一項に記載の微小毛包と接触させるステップ(a)、次いで頭皮同等物の少なくとも1つのパラメータに対する前記産物の効果を分析するステップ(b)および前記パラメータを改変する前記産物を選択するステップ(c)を含む、方法。
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