KR20180053750A - 미세 모낭의 제조에 있어서의 기질 세포의 용도 - Google Patents

미세 모낭의 제조에 있어서의 기질 세포의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세 모낭을 수득하는 데 있어서의 기질 세포의 용도 및 화장품, 의약품 또는 피부과용 제품의 효과의 평가에 있어서의 이의 용도와, 또한 감소된 다모성의 상태의 예방적 또는 치료적 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

미세 모낭의 제조에 있어서의 기질 세포의 용도
본 발명은 기질 세포의 배양 및 증폭에 의한 미세 모낭의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 미세 모낭 및 탈모증의 치료 및 또한 화장품, 의약품 및 피부과용 제품의 효과의 평가에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
탈모증은 다양한 요인, 즉 유전적 요인, 호르몬적 요인 및 환경적 요인에 의해, 다이어트에 의해, 그리고 신체 활동에 의해 좌우된다. 모발은 필수적인 심미적 정체성 역할을 갖는다. 따라서 여성 또는 남성에서의 탈모증은 상당한 정신적 고통에 책임이 있을 수 있다.
따라서, 일생을 통하여 건강하고 강한 모발 및 조밀한 두발은 대부분의 여성 및 남성의 염원이다.
세포 요법, 레이저 요법 또는 그렇지 않으면 수술 없는 이식과 같은 많은 기술이 탈모증 치료용으로 공지되어 있다. 후자는 즉각적인 결과를 제공하며, 수술보다 훨씬 덜 침습적이다.
이식체를 얻기 위하여, 인간 모낭은 모구에 존재하는 다양한 세포 유형을 배양함으로써 얻어진다.
모구는 이형(pear-shaped)이며, 이것은 다음으로 구성된다:
- 모낭의 기저부에 위치하는, 진피 기원의 발아체인 모유두. 이것은 성장 인자 및 세포외 기질 단백질의 저장을 통하여 모발의 성장의 영양 및 조절에 참여하는 고도 맥관화 부위(vascularized site)이다. 이 정보는 기질에서 생성된 기질 세포로 전달되어 이것이 분화되게 한다 (Rees JL. Genetics of hair and skin color; Voyage 3D au Coeur du cheveu [3D voyage to the Heart of the hair], 웹사이트 - URL: www.hair-science.com);
- 그다지 분화되지 않은 기질 세포의 덩어리(clump)로 구성된, 진피 모유두를 캡핑하는(capping) 구역인 기질. 이것은 강한 유사 분열 활동의 시트(seat)이다. 모구에 위치하고 진피 모유두 주위에 작은 세포 덩어리를 형성하는 기질 세포는, 배아층(germinative stratum)을 구성하며 빠르게 증식하여서 분화되어 모간을 형성함으로써 모발의 주기에서 필수적인 역할을 하는 케라틴 세포의 전구체로 주로 구성된다. 생장기(anagen phase)의 시작으로부터 생장기의 마지막까지, 이러한 기질 세포는 퇴행기(catagen phase)까지 증식하고 그 후 휴지기(telogen phase)에서 사라진다. (문헌[Ebling FJ . The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Jul;5(3):467-81]. 개관; 문헌[Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970, Jan 54, pages 65-32]. 세포 분화는 외부 상피초(outer epithelial sheath; ORS), 내부 상피초(inner epithelial sheath; IRS) 및 그 후 모간의 다양한 세포 유형의 형성을 허용할 것이다. 모발의 형상을 좌우하는 것도 이 기질이다. 상기 기질은 직모의 경우 대칭축 주위에 균일하게 분포하는 반면, 곱슬모의 경우 한쪽에 더 많을 것이다 (Voyage 3D au Coeur du cheveu [3D voyage to the Heart of the hair] 웹사이트 - URL: www.hair-science.com; 문헌[Melissopoulos A and Levacher C. Les annexes cutanees [The skin appendages]. La peau: structure et physiologie [The skin: structure and physiology], published by Lavoisier; 1998. P. 57-99)]. 기질은 또한 모발의 색소에 책임이 있는 모낭 멜라닌 세포를 포함한다. 이러한 기질 세포의 증식 및 분화는 진피 모유두에 의해 제어된다 (문헌[Botchkarev VA, Kishimoto J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. 2003 Jun;8(1):46-55. 개관]);
- 케라틴화 구역으로도 공지된, 모구의 상부 기질에 의해 생성되는 외부 및 내부 상피초. 외부 상피초는 모낭의 외피(outer envelope)를 구성하는데, 이것은 표피의 함입부이다. 이것은 특히 모낭이 주기적으로 재생되는 줄기 세포를 수용하고 있다. 내부 상피초는 외부 상피초를 모간으로부터 분리시킨다. 이러한 초는 모발의 성장을 동반하는 케라틴화 동심층(keratinized concentric layer)으로 체계화되는 3가지 세포 유형으로 구성된다. 헨레층(
Figure pct00001
), 헉슬리층(Huxley's layer) 및 모기질(hair matrix) 쪽으로 향하는, 편평한 세포로부터 형성된 각피는 구별된다;
- 부분적으로 보이는 모간 (이것은 모발이다). 모간의 구조는 외측으로부터 내측으로 3개의 특유한 층으로 이루어진다. 각피, 피층(cortex) 및 수층(medulla)이 있으며, 이들 전부는 모두 케라틴화된 세포로 이루어진다.
인간 모낭에 다소 가까운 모낭이 수년 동안 개발되어 왔다. 예를 들어, 하기 문서에 개시된, 모구의 다양한 세포의 배양에 의해 얻어진 모낭이 언급될 수 있다: 유럽 특허 제2 274 419호, 유럽 특허 제2 447 357호.
그럼에도 불구하고, 이들 모델 중 어떤 것도 기질 세포를 인간 마이크로모낭(microfollicle)의 대부분의 특성을 나타내기에 충분한 양으로 포함하지 않는데, 상기 기질 세포는 모간의 형성에 필수적인 세포이다.
놀랍게도, 본 출원인은 Y27632의 존재 하에서의 기질의 세포의 배양이 상당한, 이러한 세포의 증식 및 이의 케라틴 세포 (K85 K35 마커에 대하여 양성임)로의 분화를 허용함을 입증하였는데, 이는 규칙적인 클러스터(regular cluster)를 형성하면서 융합(confluence)에 도달한다.
3D 배양에 두어진 이러한 세포는, 예기치 않게도, 특히 케라틴 세포 및 멜라닌 세포를 포함하는, 생체 내에서 마이크로모낭의 대부분의 특성을 나타내는 미세 모낭을 얻는 것을 가능하게 한다. 이러한 모낭을 형성하는 세포는 k85 k35 마커를 발현하는 특성을 나타낸다.
따라서 본 발명에 따른 방법은 미세 모낭의 형성에 요구되는 모든 세포 유형을 제공하는, 기질 세포의 단일 세포 유형인 단일 세포 유형을 이용함으로써 마이크로모낭을 수득하는 것을 가능하게 한다는 사실로 인하여, 유리한 것으로 입증되었다.
따라서, 본 발명의 첫 번째의 주제에 따르면, 본 발명은 미세 모낭의 제조에 있어서의 기질 세포의 용도에 관한 것이다.
미세 모낭의 제조에 있어서의 기질 세포의 용도
“기질 세포”라는 용어는 모구에 위치하며 진피 모유두 주위에 작은 세포 덩어리를 형성하는 세포를 의미하고자 한다 (문헌[Ebling FJ . The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Jul;5(3):467-81]. 개관; 문헌[Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan;54(1):65-81]). 이러한 세포의 샘플을 취할 수 있으며, 후속 사용의 목적을 위하여 이를 증폭시켜 조직 라이브러리(library)로 보관할 수 있다.
기질 조직의 완전성(integrity)을 보존하기 위하여, 이러한 세포를 하기와 같은 방법에 따라 샘플링할 수 있다: 모낭은 2%의 항생제 및 비-필수 아미노산이 보충된 최소 배양 배지를 포함하는 페트리 디쉬(Petri dish)에 두어진다. 모구 영역은 진피 모유두의 정상부(top)에서 절단되며, 따라서 모구의 상피는 진피 모유두 및 결합 조직초로부터 분리된다. 기질 세포는 미세 모낭의 제조에 요구되는 모든 세포를 제공하며, 따라서 미세 모낭의 제조에 기질 세포를 사용하는 것은 다른 세포 유형을 요구하지 않고, 임의의 외인성 세포의 제공 없이 실시될 수 있다.
미세 모낭의 수득에 충분한 양의 기질 세포를 얻기 위하여, 본 출원인은 이러한 세포가 K 85 K 35 케라틴 세포로 분화되어 일단 융합 상태에서 클러스터를 형성하도록 이를 증폭시키는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 출원인은 미세 모낭의 제조 방법을 개발하였으며, 이는 기질 세포를 K85 K35 마커에 대하여 양성인 케라틴 세포로 분화시키기에 충분한 시간 기간 동안 유효량의 ROCK 저해제의 존재 하에 기질 세포를 증폭시키는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
미세 모낭의 이러한 제조 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a- 모낭을 두피 샘플로부터 단리하는 단계;
b- 배양 배지에 침지시킨 상기 지지체 상에서 진피 모유두 위의 모구 영역을 절단하는 단계;
c- 세포 응집물 형태의 기질 세포를 결합 조직초 및 진피 모유두로부터 분리하는 단계;
d- 그린(green) 7F 배지에서, 마이토마이신으로 차단시킨 3T3i 섬유모세포의 영양세포층(feeder layer) 상에 상기 세포 응집물을 퇴적시키는 단계;
e- ROCK 저해제의 존재 하에 상기 지지체의 표면에서 기질 세포를 증폭시키는 단계;
f- K85 K35 케라틴 세포를 회수하는 단계;
g- 단계 f)에서 얻어진 케라틴 세포를 3D 배양으로 배양하는 단계.
현미 해부( Microdissection )
기질 세포는 단지 생장기의 모발로부터 샘플링될 수 있다.
상기 기질의 영역은 매우 소수의 세포를 포함한다.
따라서, 극복되어야 할 한 가지 어려움은 우수한 기질 세포를 충분한 양으로 얻는 것에 있다.
이것은, 정상적인 상태 하에서, 모발이 빠지거나 모발이 뽑힌 후, 진피 모유두-기질 세포 구획이 두피의 진피 내에 남아있기 때문이다. 이 구획은 새로운 모발 주기의 발달을 개시할 것이며, 새로운 마이크로모낭을 다시 제공할 것이다.
따라서, 모발을 뽑는 것은 이러한 기질 세포의 수득을 가능하게 하지 않을 것이며; 따라서 두피 생검을 수행하고 그 후 이러한 세포를 현미 해부에 의해 단리하는 것이 필요할 것이다.
본 발명에 따르면, 기질 세포는 상기 세포의 양 및 완전성을 보존하는 신규한 현미 해부 기술에 의해 얻어지며, 그 이유는 상기 세포가 서로 분리되지 않기 때문이다. 이것은 마이크로모낭이 지지체 상에서 단리되고, 모구 영역이 진피 모유두 위에서 절단되며 기질 세포가 상기 지지체 상의 세포 응집물의 형태로 회수되기 때문이다. 이러한 현미 해부는 모든 기질 세포를 단리 및 보존하는 것을 가능하게 한다.
증폭
단리가 어려운 것에 더하여, 기질 세포는 또한 적어도 하기 이유 때문에 배양이 어렵다:
a) 기질 세포의 수가 특히 적음;
b) 상기 세포는 용이하게 해리되며, 따라서 현미 해부 동안 상기 세포의 정확한 포착이 어려움;
c) 상기 세포는 플라스틱 지지체에 부착되지 않음;
d) 상기 세포는 종종 진피 모유두 유래의 또는 결합 조직초 유래의 섬유모세포로 오염되기 때문에 순수하게 증폭시키는 것이 어려움.
일부 저자는 이들 세포를 모유두 섬유모세포와의 공동배양(coculture)으로 배양하는 것을 제안하였다. 이 방법의 결점은, 얻어진 배양물이 균질하지 않고, 기질 세포가 공동배양에서 사용된 모유두 유래의 진피 섬유모세포로 오염된다는 것이다 (문헌[Reynolds AJ, Lawrence CM, Jahoda CA Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J Invest Dermatol.1993 Oct;101(4):634-8]).
루오(Luo) 등은 현미 해부 기술, 이어서 플라스틱 지지체 상에서의 기질 세포의 배양을 제안하였다 (문헌[Luo et al: Methods for culturing hair follicle epithelial matrix cells; Reg. number: H1610; Nov.5, 1996]). 그러나, 이러한 현미 해부 기술은 매우 낮은 수율의 기질 세포를 생성한다.
본 출원인은 기질 세포를 단리하였으며 이러한 세포를 배양하는 방법을 개발하였다. 구체적으로, ROCK 저해제인 Y27632 성장 인자의 존재 하에서, 이러한 세포는 규칙적인 클러스터를 형성하면서 융합에 도달할 때까지 빠르게 증식하고 K85 K35 케라틴 세포로 분화된다.
상기 세포는, 성장 인자, 특히 아미노산, 혈청, 콜레라 독소, 인슐린, 트리요오도타이로닌 및 pH 완충액의 존재 하에, 당업자에게 공지된 적합한 배지에서 섬유모세포로 구성된 영양세포 지지체 상에서 배양함으로써 문헌[Rheinwald and Green, Cell, vol. 6, 331-344,1975]의 기술에 따라 증폭시킨다. 특히, 그러한 배양 배지는 특히 적어도 하나의, 케라틴 세포를 위한 유사 분열 촉진성(mitogenic) 성장 인자 (예를 들어 상피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 및/또는 케라틴 세포 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF), 특히 KGF), 인슐린, 하이드로코르티손 및 선택적으로 항생제 (예를 들어, 겐타마이신, 암포테리신 B)를 함유할 수 있는데, 여기에 ROCK 저해제, Y27632가 첨가되었다.
유리하게는, 상기 배지는 예를 들어 소 기원의 혈청 또는 뇌하수체 추출물, 에피네프린, 트랜스페린 및/또는 비-필수 아미노산을 또한 포함할 수 있다.
이 배양에 사용되는 섬유모세포는 더 우선적으로는 3T3 섬유모세포일 것이다. 3T3 섬유모세포는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이것은 1962년 이래로 공지되었던 섬유모세포주이다. "3T3"은 “3일 계대, 3 x 105개의 세포의 접종”을 의미한다.
바람직하게는 세포 배양물은 섬유모세포 (우선적으로 3T3 섬유모세포) 상의 배양물로서, 이의 증식은 우선적으로는 이를 (예를 들어 UV 방사선으로) 이전에 조사함으로써 또는 이를 미토마이신으로 이전에 처리함으로써 사전에 중단시켰다. 그러나 미토마이신 (특히 미토마이신 C)은 이러한 세포의 증식을, 케라틴 세포 증식에 유용한 영양 물질을 상기 세포가 생성하지 못하게 하는 것 없이 차단한다.
이러한 기술을 이용하면, 기질 세포는 이것이 다른 세포 유형으로부터 분리된 지지체 상에서 증식한다. 이것은 충분한 수의 기질 세포의 보존을 가능하게 한다. 상기 세포는 Y27632의 존재 하에 융합 상태까지 빠르게 증식하며, 규칙적인 클러스트를 형성하면서 초기 모발 케라틴 마커인 K35 및 K85에 대하여 양성인 세포로 분화된다.
본 발명에 따르면, “유효량”이라는 용어는 융합 상태의 K85 K35 케라틴 세포의 배양물을 얻는 데 요구되는 양을 나타낸다.
본 발명에 따르면, ROCK 저해제, Y27632의 유효량은 1 내지 100 μM, 그리고 바람직하게는 5 내지 25 μM, 바람직하게는 10 μM이다.
본 발명에 따르면, 기질 세포는 ROCK 저해제, Y27632의 존재 하에 적어도 2일 동안, 그리고 바람직하게는 적어도 3일 동안 배양된다.
“클러스터”라는 용어는 함께 그룹화된 세포의 덩어리를 의미하고자 한다.
“융합 상태의”라는 용어는 적절한 지지체 상에서 단층으로 배양된 각각의 유착성 세포간에 간극이 없는 세포층을 의미하고자 한다.
K35 및 K85 분화 세포를 3D 배양으로 배양함에 의한 미세 모낭의 수득
일단 융합 상태에서 규칙적인 클러스터를 형성하는, K35 및 K85 마커에 대하여 양성인 케라틴 세포는 효소 처리에 의해 회수된다.
3D 구체는 비-유착성 세포를 배양하기 위한 마이크로플레이트를 이용한 방법 또는 현적법(hanging drop method) (그래비티플러스 화이트 페이퍼 시스템(GravityPLUS White paper system))에 의해 인스피로(Insphero) 타입의 96웰 마이크로플레이트에서 얻어진다.
그 후 상기 세포는 37℃에서 그린 배지에서 배양되며; 미세 모낭의 출현은 적어도 5일의 배양 후 관찰된다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 세포는 적어도 2일 동안, 그리고 바람직하게는 적어도 5일 동안 배양 상태로 유지된다.
바람직하게는, 배양 상태로 두어진 세포의 수는 1000 내지 4000개의 세포이며, 바람직하게는 3000개의 세포이다.
본 발명의 또 다른 주제는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 미세 모낭이다.
이러한 미세 모낭은 감소된 다모성의 상태, 특히 탈모증의 예방적 또는 치료적 치료에 상기 미세 모낭을 사용하는 것을 가능하게 하며, 화장품용 및/또는 의약품용 활성제의 활성 또는 그렇지 않으면 국소 성분의 부작용에 대한 예측 테스트를 구성한다.
감소된 다모성의 상태, 특히 탈모증의 예방적 또는 치료적 치료
미세 모낭이 생체 내에서의 모낭의 특성을 갖는다면, 이것은 이식체, 선택적으로 피부 대체재와 조합된 것으로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 미세 모낭은 또한 피부 장애, 예컨대 화상, 치유 결함 또는 흰색 또는 회색으로 변한 모발의 치료를 위한 피부 대체재 및/또는 이식체의 제조에 있어서의 용도를 가질 것이다.
치료 효과는 전적으로든지 부분적으로든지 간에, 정상적인 다모성 상태로의 복귀로 정의된다.
본 발명의 목적을 위하여, 예방적 치료는, 대상체가 모발 손실에 대한 전제 조건, 예컨대 가족성 소인(familial disposition)을 가질 경우 권고된다.
감소된 양의 모발의 상태는 탈모증, 유전성 대머리, 흉터, 화상, 또는 사고에 의한 상해의 결과일 수 있다.
화장품용 및/또는 의약품용 활성제의 활성에 대한 예측적 테스트
본 발명에 따른 미세 모낭 등가물은 특히 체모 또는 두발 성장의 시간 코스를 수행하는 것을 가능하게 하며, 따라서 생체 내에서의 맥락에서 가능한 한 완전하며 살아 있는 다수의 모발을 요구하는 임의의 연구, 예컨대 모발 주기 및 이 주기에 영향을 줄 수 있는 인자의 연구 (모발 성장을 촉진시키는 활성제, 모발 손실에 대항하는 것을 가능하게 하는 활성제, 또는 그렇지 않으면 체모 성장을 늦추는 활성제의 연구까지의 범위에 이름)를 수행하는 것을 가능하게 한다.
신규한 활성제를 확인하는 목적을 위한 생성물 스크리닝 방법은 상기 테스트용 생성물을 본 발명에 따른 두피 등가물과 접촉시키는 단계 (a), 그 후 두피 등가물의 적어도 하나의 파라미터에 대한 상기 생성물의 영향을 분석하는 단계 (b) 및 상기 파라미터를 변경시키는 생성물을 선택하는 단계 (c)를 포함한다.
바람직하게는, 단계 (a)의 실시를 위하여, 테스트용 생성물을 국소 적용하거나, 예를 들어 통상적인 국소 제형으로 제형화하거나, 또는 그렇지 않으면 배양 배지 내에 도입한다.
단계 (b)는 특히, 미세 모낭의 품질 및/또는 항상성과 연관된 마커, 예를 들어 상피 및/또는 진피 마커, 예컨대 구조 단백질의 발현, 생성 및/또는 활성을 분석함으로써 실시될 수 있다. 구조 단백질의 예로서, 모발 케라틴이 언급될 수 있다.
이를 위하여, 모간 성장에 대한 생성물의 영향을 스크리닝 방법의 단계 (b)에서 분석할 것이다.
생성물의 영향을 분석하는 단계 (b)는 우선적으로, 테스트용 생성물과 접촉시킨 미세 모낭에서 측정한 적어도 하나의 파라미터를 테스트용 생성물을 받지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건 하에 배양한 대조 미세 모낭에서 측정한 것과 비교하는 것이다.
두피 등가물의 파라미터를 변경시키는 생성물을 선택하는 단계 (c)는 사전에 결정한 기준의 함수로서 실시할 것이다.
이 파라미터의 변경은 상기 마커의 발현, 생성 및/또는 활성 및/또는 모간의 성장의 촉진, 감소 또는 전적이거나 부분적인 저해일 수 있다.
상기 생성물의 선택 기준은 예를 들어 이 생성물이 측정되는 파라미터에 대하여 촉진 효과 또는 저해 효과를 갖는다는 것이다.
본 발명에 따른 두피 등가물은 또한 신규한 활성제의 확인을 위한 화장품용, 의약품용 또는 피부과용 화합물의 자동화된 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다.
도면은 본 발명의 범주를 한정하지 않고서 본 발명을 더 잘 예시하는 것을 가능하게 한다.
도 1: 기질 세포의 국지화
도 2: 진피 모유두 위의 섹션
도 3: 기질 세포를 포함하는 모구
도 4: 3T3 영양세포층 상에 퇴적된 기질 세포 덩어리
도 5: 3일간의 배양 후의 기질 세포
도 6: 10일간의 배양 후 융합 상태의 기질 세포
도 7: 클러스터가 형성된 기질 세포의 일차 배양물
도 8: 3일간의 3D 배양 후의 기질 세포의 구체
도 9: 3D 배양에서의 발아체의 형성
도 10: 발아체는 K85 및 K35에 대하여 강하게 양성임
도 11: 미세 모낭을 나타내는 구체
도 12: ORS 케라틴 세포로부터의 3D 배양물에서는 발아체 형성이 없음
하기에 주어진 실시예는 본 발명의 비제한적 예시로서 제시된다.
실시예 1 - 미세 모낭의 제조
실험 프로토콜
i. 기질 세포의 현미 해부
모낭을 두피의 수술적 잔사로부터 추출한다. 상기 잔사를 먼저 5 mm² 부분으로 절단하고, 그 후 진피와 하피 사이를 외과용 메스(scalpel)를 이용하여 절개한다.
모낭을 안과용 외과용 겸자를 이용하여 추출하고, 그 후 외과용 메스를 이용하여 모유두 바로 위에서 절개한다 (도 2). 그 후 모구를 회수한다 (도 3). 이 단계에서, 모구는 다음의 두 구획을 포함한다: 진피 구획 (진피 모유두 및 결합 조직초). 세포 매스(mass)를 형성하는 기질 세포.
상피 부분을 관류 니들을 이용하여 진피 부분으로부터 분리한다.
ii. 배양 조건:
배양 조건은 다음 3가지의 주요 성분을 갖는다:
● 기본 배지:
달리 표시되지 않으면, 실시예에서 사용한 모든 배지 및 완충액은 문헌[Bell et al. 1979, (P.N.A.S.USA, 76, 1274-1278)], 문헌[Asselineau and Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222)] 또는 문헌[Asselineau et al., 1987, (Models in dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7)]에 설명되어 있다.
MEM 배지 + 10% FCS + 3F (3F 배지로 칭해짐)는 하기 조성을 갖는다:
Figure pct00002

● 배양 보충물: 세포에게 분열 또는 분화해야 함을 시그널링하는 성장 인자. 10 μM의 Y27632.
● 유착 표면: 기질 세포는 미토마이신 처리에 의해 세포 주기에서 저지된 쥐과 3T3 섬유모세포의 영양세포층의 존재 하에 그린-기반의 배지에서 유착되어 증식한다.
케라틴 세포의 배양-증폭
현미 해부 후, 기질 세포 덩어리를 100만개의 3T3 세포가 사전에 접종된, 직경이 60 mm인 페트리 디쉬 내에 퇴적시키고, 완전 배양 배지로 덮고; 융합 상태의 기질 세포의 배양물을 수득한다.
구체를 생성하기 위하여, 상기 세포를 효소 처리에 의해 덜 융합된 상태(subconfluent)의 시기에 회수한다. 구체는 이미 설명된 종래의 기술 (현적법, 원심분리, 비-유착성 지지체)을 이용하여 다양한 방법으로 얻어질 수 있다. 현적법의 경우, 3000개의 세포를 구 형태로 플레이트 내에 둔다. 상기 세포를 그의 진행의 모니터링을 위하여 48시간 후 96웰 플레이트에서 회수한다.
비-해리 기질 세포 덩어리를 단리하고, 3T3 영양세포층 상에 퇴적시킨다 (도 4). 3일간의 배양 후, 상기 세포는 기질 덩어리 주위에서 콜로니의 형태로 증식하기 시작한다 (도 5). 상기 세포는 10일 후에 덜 융합된 상태에 도달한다 (도 6). 상기 세포는 매우 작은 크기 및 강한 증식 능력을 특징으로 한다. 그 후, 증폭을 보장하기 위하여, 상기 세포를 T75 플라스크 내에 접종한다. 따라서, 3주간의 3개의 모구의 배양 후, 계대 1에서 대략 4000만개의 기질 세포를 생성하는 것이 가능하다.
기질 세포는 시험관 내에서 세포 응집물을 매우 빠르게 형성할 수 있음을 관찰하는 것이 가능하였다. 이 현상은 이러한 세포의 주성 특성으로 인한 것으로 보인다. 그린 7F 배지에서, 이러한 덩어리는 모낭 발아체의 규칙적인 패턴을 회상시키는 규칙적인 패턴을 형성한다 (도 7).
더욱이, 이러한 덩어리의 형성 동안, 현탁 상태의 다수의 구형 세포의 생성이 나타나며, 상기 세포를 계대 배양하여 새로운 세포 배양물을 생성할 수 있다. 특성화 후, 발아체는 제1기의 기질 세포 분화를 나타내며, 이는 초기 모발 케라틴, 즉 K35 및 K85에 대하여 양성이다.
기질 세포를 이용한 3D 배양을 또한 실시하였다. 이러한 세포는 3일간의 배양 후 구체를 형성한다 (도 8).
일부의 7일간의 배양 후, 이러한 구체는 형태(conformation)가 변화되어서 극성 조직체(polarized organization)를 나타낸다. 발아가 나타나며, 이는 상기 구체의 분화를 나타내는 것으로 보인다 (도 9). 이러한 발아체는 K85 및 K35에 대하여 강하게 양성이다.
일부 구체는 케라틴화되는 것으로 보이고 (도 10) ORS 케라틴 세포 배양을 시작할 때에는 발견되지 않는 섬유의 형태의 구조를 나타낸다.

Claims (19)

  1. 미세 모낭의 제조에 있어서의 모구에 위치하는 기질 세포의 용도.
  2. 모구에 존재하는 기질 세포를 K85 K35 마커에 대하여 양성인 케라틴 세포로 분화시키기에 충분한 시간 기간 동안 유효량의 ROCK 저해제의 존재 하에 상기 세포를 배양하는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, ROCK 저해제는 Y27632인 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, ROCK 저해제의 유효량은 1 내지 100 μM인 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ROCK 저해제의 유효량은 5 내지 25 μM인 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, ROCK 저해제의 유효량은 10 μM인 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 세포를 2일 이상 동안, 그리고 바람직하게는 3일 이상 동안 ROCK 저해제의 존재 하에 배양하는 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, K85 K35 마커에 대하여 양성인 케라틴 세포는 규칙적인 클러스터(cluster)를 형성하면서 융합(confluence)에 도달하는 것을 특징으로 하는 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법:
    a- 지지체 상에서 모낭을 단리하는 단계;
    b- 배양 배지에 침지시킨 상기 지지체 상에서 진피 모유두 위의 모구 영역을 절단하는 단계;
    c- 상기 지지체 상의 세포 응집물의 형태의 기질 세포를 회수하는 단계;
    d- ROCK 저해제의 존재 하에 기질 세포를 증폭시키는 단계;
    e- K35 K85 마커에 대하여 양성인 케라틴 세포를 회수하는 단계;
    f- 단계 e)에서 얻어진 케라틴 세포를 3D 배양으로 배양하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 단계 f)에서, 배양 중에 두어진 케라틴 세포의 수는 1000 내지 4000개의 세포이며, 바람직하게는 3000개의 세포인 것을 특징으로 하는 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 영양 배지는 3F 배지인 것을 특징으로 하는 미세 모낭의 “시험관 내” 제조 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 미세 모낭.
  13. 제12항에 있어서, ROCK 저해제의 존재 하에 모구에 위치하는 기질 세포의 증폭 및 분화에서 생성된 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 미세 모낭.
  14. 제13항에 있어서, ROCK 저해제는 Y27632인 것을 특징으로 하는 미세 모낭.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 다모성의 상태의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 미세 모낭.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 탈모증의 치료를 위한 미세 모낭.
  17. 모발 특성에 대한 활성제의 영향의 시험관 내 테스트에 있어서의 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 개시된 미세 모낭의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 체모 및/또는 두발의 성장을 조절하는 화합물의 확인에 있어서의 미세 모낭의 용도.
  19. 신규한 활성제를 확인하는 목적을 위한 생성물 스크리닝 방법으로서, 상기 테스트용 생성물을 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 미세 모낭과 접촉시키는 단계 (a), 그 후 두피 등가물의 적어도 하나의 파라미터에 대한 상기 생성물의 영향을 분석하는 단계 (b) 및 상기 파라미터를 변경시키는 생성물을 선택하는 단계 (c)를 포함하는 생성물 스크리닝 방법.
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