CN108291200B - 基质细胞用于制备微毛囊的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基质细胞用于获得微毛囊的用途，并且涉及其用于评估化妆品、药物或皮肤病学产品的效果的用途，以及还用于对多毛性减弱状态进行预防或治疗处理的用途。

Description

基质细胞用于制备微毛囊的用途

本发明涉及通过培养和扩增基质细胞来产生微毛囊的方法。

本发明同样涉及通过以上提及的方法生产的微毛囊，并且涉及其用于治疗脱发的用途，以及用于评估化妆品、药物和皮肤病学产品的效果的用途。

脱发由各种因素：基因、激素和环境，通过饮食和通过身体活动来调节。毛发具有重要的美学和身份作用。女性或男性的脱发可能因此导致相当严重的心理痛苦。

因此，在人的一生中，拥有健康、强韧和浓密的毛发是大多数女性和男性的追求。

已知许多用于治疗脱发的技术，例如细胞疗法、激光疗法、或其他无需手术的植入物。后者立即见效，并且比手术的侵入性小得多。

为了获得植入物，通过培养毛球中存在的各种细胞类型来获得人毛囊。

毛球是梨形的，并且由以下组成：

-作为真皮起源发育的毛乳头，位于毛囊的基部。毛乳头是高度血管化的部位，通过其生长因子和细胞外基质蛋白的储存参与毛发生长的营养和调节。该信息将被传送到在基质中产生的基质细胞，以允许其分化(Rees JL.Genetics ofhair and skin color [毛发和肤色的遗传学]；Voyage 3D au Coeur du cheveu[3D voyage to the Heart of thehair(对毛发中心的3D航海)]网址-URL：www.hair-science.com)；

-基质，其是遮盖真皮乳头的区域，由一簇没有特别分化的基质细胞构成。基质是强烈的有丝分裂活动的所在地。基质细胞，位于毛球中并且在真皮乳头周围形成小细胞簇，主要由角质形成细胞的前体细胞构成，该前体细胞构成发芽层并且迅速增殖以便分化形成毛干，因此基质细胞在毛发周期中起着重要作用。从生长期开始直到所述阶段结束时，这些基质细胞将增殖直到退化期，并然后在静止期消失。(Ebling FJ.The biology of hair.[毛发的生物学]Dermatol Clin.[临床皮肤病]1987年7月；5(3)：467-81.Review[综述]；Saitoh M，Uzuka M，Sakamoto M.Human hair cycle.[人类毛发循环]J Invest Dermatol.[调查性皮肤病杂志]1970年1月，54，第65至81页。细胞分化将允许外上皮鞘(ORS)、内上皮鞘(IRS)、和之后毛干的各种细胞类型的形成。它还是控制毛发形状的该基质。该基质围绕直发的对称轴均匀分布，而对于卷发的一侧基质分布则更多(Voyage 3D au Coeur ducheveu[3D voyage to the Heart ofthe hair(对毛发中心的3D航海)]网址-URL：www.hair-science.com；Melissopoulos A和Levacher C.Les annexes cutanées[Theskin appendages(皮肤附属器)].在：La peau：structure et physiologie[The skin：structure and physiology(皮肤：结构和生理)]，由Lavoisier出版；1998.第57至99页)。基质还包含负责毛发色素沉着的毛囊黑色素细胞。这些基质细胞的增殖和分化由真皮乳头控制(Botchkarev VA，Kishimoto J.Molecular control of epithelial-mesenchymalinteractions during hair follicle cycling.[毛囊周期中上皮-间质相互作用的分子控制]J Invest Dermatol Symp Proc.[调查性皮肤病研讨会论文集]2003年6月；8(1)：46-55.Review[综述])；

-外上皮鞘和内上皮鞘，由毛球的上层基质产生，还被称为角质化区域。外上皮鞘构成了毛囊的外包膜：它是表皮的内陷。它特别容纳干细胞，毛囊将由这些干细胞循环再生。内上皮鞘将外上皮鞘与毛干分开。该鞘由组织在角质化同心层中的三种类型的细胞组成，该角质化同心层伴随毛发的生长。亨利氏层(Henlé′s layer)、赫胥黎氏层(Huxley’slayer)、以及由扁平细胞形成的指向毛发基质的角质层是不同的；

-毛干，部分可见的是毛发。毛干的结构从外到内由三个不同的层组成。角质层、皮质、和髓质全部构成了所有的角质化细胞。

或多或少接近人类毛囊的毛囊已经开发出来若干年了。例如，可以提及通过培养毛球的各种细胞而获得的毛囊，在以下文献中进行了描述：EP 2 274 419，EP 2 447 357。

尽管如此，这些模型都不包含基质细胞，它们是形成毛干所必需的细胞，以足够的数量代表人微毛囊的大部分特征。

令人惊讶的是，本申请人已经证明，在Y27632存在下培养基质的细胞允许这些细胞相当大的增殖，并将其分化成对K85 K35标记呈阳性的角质形成细胞，其达到汇合同时形成规则簇。

这些放置在3D培养中的细胞使得有可能出乎意料地获得显示出体内微毛囊的大部分特征的微毛囊，特别包括角质形成细胞和黑色素细胞。形成该毛囊的细胞表现出表达k85 k35标记的特征。

因此，根据本发明的方法证明是有利的，这归因于它使得通过使用单一细胞类型能够获得微毛囊的事实，基质细胞的类型提供用于形成微毛囊所需的所有细胞类型。

因此，根据其第一个主题，本发明涉及基质细胞用于制备微毛囊的用途。

使用基质细胞制备微毛囊

术语“基质细胞”旨在意指位于毛球中的细胞，并且这些细胞形成真皮乳头附近的小细胞簇(Ebling FJ.The biology ofhair.[毛发的生物学]Dermatol Clin.[皮肤病临床学]1987年7月；5(3)：467-81.Review[综述]；Saitoh M，Uzuka M，Sakamoto M.Human haircycle.[毛发周期]J Invest Dermatol.[调查性皮肤病杂志]1970年1月；54(1)：65-81)。这些细胞的样品可以被采集，并且它们可以被扩增并存储在组织库中以用于随后使用的目的。

为了保持基质组织的完整性，可以根据以下方法对这些细胞进行取样：将毛囊置于含有补充有2％抗生素和非必需氨基酸的最小培养基的有盖培养皿中。毛球区域在真皮乳头顶部被切割，并且因此将毛球上皮与真皮乳头和结缔组织鞘分开。基质细胞提供了制备微毛囊所需的全部细胞，并且因此使用基质细胞制备微毛囊不需要其他细胞类型，并且可以在不提供任何外源细胞的情况下进行。

为了获得足够量的用于获得微毛囊的基质细胞，本申请人已经开发了一种扩增这些细胞的方法，使得它们在聚集时分化成在汇合时形成簇的K 85K 35角质形成细胞。

因此，本申请人已经开发了用于制备微毛囊的方法，该方法包括至少一个步骤：在有效量的ROCK抑制剂的存在下扩增基质细胞，持续足够的一段时间以允许所述细胞分化成对K85 K35标记呈阳性的角质形成细胞。

用于制备微毛囊的此方法特征在于该方法包括以下步骤：

a-从头皮样品中分离毛囊；

b-在浸入培养基的所述支持物上切割真皮乳头上方的毛球区域；

c-从结缔组织鞘和从真皮乳头中分离处于细胞团块形式的基质细胞；

d-在Green 7F培养基中，在3T3i成纤维细胞的饲养层上沉积细胞团块，用丝裂霉素阻断；

e-在ROCK抑制剂的存在下，在所述支持物的表面上扩增基质细胞；

f-回收K85 K35角质形成细胞；

g-在3D培养中培养步骤f)中获得的角质形成细胞。

显微解剖

在毛发生长期可以仅从毛发中对基质细胞取样。

基质区域包含极少数的细胞。

因此，待克服的一个困难是获得高质量并且处于足够数量的基质细胞。

这事因为，在正常条件下，当毛发脱落或被拔出后，真皮乳头-基质细胞隔室保留在头皮的真皮中。这个隔间将启动一个新的毛发周期的发展，并将再次提供新的微毛囊。

因此，拔出毛发不能获得这些基质细胞；因此将对于进行头皮活组织检查是必须的，并然后通过显微解剖分离这些细胞。

根据本发明，通过新颖的显微解剖技术获得基质细胞，该技术保留细胞的量和完整性，因此这些细胞彼此不分离。这是因为微毛囊被分离在支持物上，毛球区域在真皮乳头上方被切割，并且在相同的支持物上以细胞团块的形式回收基质细胞。该显微解剖能够分离和保存所有的基质细胞。

扩增

除了难以分离之外，基质细胞还难以培养，至少出于以下原因：

a)基质细胞数量特别少；

b)基质细胞易于解离，并且因此在显微解剖过程中难以找准；

c)基质细胞不粘附于塑料支持物；

d)由于基质细胞常常被来自真皮乳头或来自结缔组织鞘的成纤维细胞污染，因此基质细胞很难被扩增纯化。

一些作者提出在与乳头成纤维细胞共培养时培养这些细胞。该方法的缺点是获得的培养物不均匀，基质细胞被来自用于共培养的乳头的真皮成纤维细胞污染(Reynolds AJ，Lawrence CM，Jahoda CA，Human hair follicle germinative epidermal cellculture.[人毛囊萌发的表皮细胞培养]J Invest Dermatol.[调查性皮肤病杂志]1993年10月；101(4)：634-8)。

Luo等人已经提出显微解剖技术，随后在塑料支持物上培养基质细胞(Luo等人：Methods for culturing hair follicle epithelial matrix cells[用于培养毛囊上皮基质细胞的方法]；登记编号：H1610；1996年11月5日)。然而，该显微解剖技术导致基质细胞的产率非常低。

本申请人已经分离出基质细胞，并且开发了用于培养这些细胞的方法。具体地，在Y27632生长因子的存在下，该因子是ROCK抑制剂，这些细胞迅速扩增并分化为K85 K35角质形成细胞，直到它们达到汇合同时形成规则簇。

根据Rheinwald和Green技术(Cell[细胞]，第6卷，331-344，1975)通过在由成纤维细胞组成的饲养支持物上，在本领域技术人员已知的合适的培养基中，在生长因子(特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺氨酸、和pH缓冲溶液)的存在下进行培养来扩增细胞。特别地，这样的培养基可以特别包含至少一种针对角质形成细胞的促有丝分裂生长因子(例如表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松，以及任选地抗生素(例如，庆大霉素，二性霉素B)，向该培养基中添加ROCK抑制剂，Y27632。

有利地，所述培养基还可以包含血清或垂体提取物，例如牛科动物来源的，肾上腺素、转铁蛋白和/或非必需氨基酸。

用于该培养的成纤维细胞将更优先地是3T3成纤维细胞。3T3成纤维细胞是对本领域技术人员熟知的。这是自1962年来已知的成纤维细胞细胞系。“3T3”表示“3天转移，3x10⁵个细胞接种”。

细胞培养优选地在成纤维细胞(优先地3T3成纤维细胞)上培养，细胞的增殖事先停止，优先地通过先前辐照细胞(例如用UV辐射)或先前用丝裂霉素处理。丝裂霉素(特别是丝裂霉素C)阻断这些细胞的增殖，然而不阻止它们产生可用于角质形成细胞增殖的营养物质。

用该技术，基质细胞在与其他细胞类型分开的支持物上增殖。这使得可以保留足够数量的基质细胞。细胞在Y27632的存在下迅速增殖直至汇合，并分化成对早期毛发角蛋白标记K35和K85呈阳性的细胞，同时形成规则簇。

根据本发明，术语“有效量”表示在汇合时获得K85 K35角质形成细胞培养物所需要的量。

根据本发明，ROCK抑制剂，Y27632的有效量是在1μM和100μM之间，并优选地在5μM和25μM之间，并且优选地是10μM。

根据本发明，在ROCK抑制剂，Y27632的存在下将基质细胞培养至少2天，并优选地至少3天。

术语“簇”旨在意指聚集在一起的一簇细胞。

术语“在汇合时”旨在意指在合适的支持物上的单层中培养的每个粘附细胞之间无空隙的细胞层。

在3D培养中培养K35和K85分化的细胞以获得微毛囊

这些角质形成细胞对K35和K85标记呈阳性，一旦汇合就形成规则簇，通过酶处理回收。

通过悬滴法或用微孔板培养非粘附细胞的方法在Insphero型的96孔微孔板上获得3D球(GravityPLUS White paper system)。

然后在Green培养基中在37℃培养细胞；培养至少5天后观察到微毛囊的外观。

根据一个实施例，将细胞保持培养至少2天，并优选地至少5天。

优选地，置于培养中的细胞数目是在1000个和4000个细胞之间，并且优选地是3000个细胞。

本发明的另一个主题是可以通过使用根据本发明的方法获得微毛囊。

这些微毛囊使得能够使用它们用于对多毛性减弱状态(特别是脱发)进行预防或治疗处理，并且组成针对化妆品和/或药物活性剂的活性或局部成分的其他副作用的预测性测试。

对多毛性减弱状态，特别是脱发进行预防或治疗处理

考虑到微毛囊具有在体内毛囊的特征，该微毛囊可以被用作植入物，任选地与皮肤替代物结合。

因此，根据本发明的微毛囊还将具有用于制备植入物和/或皮肤替代物用于治疗皮肤障碍(例如烧伤、愈合缺陷、或变白或变灰的毛发)的用途。

治疗效果被定义为无论是全部还是部分恢复到正常的多毛性状态。

出于本发明的目的，如果受试者具有脱发的先决条件(例如家族性倾向)，则建议进行预防性治疗。

毛发数量减少的情况可能是由脱发、遗传性脱发、疤痕、烧伤、或意外伤害引起的。

对化妆品和/或药物活性剂活性的预测性测试

根据本发明的微毛囊等效物将使得能够在体毛或头发生长的特定时间过程中进行，并因此任何需要在活体内并且尽可能在体内背景下尽可能完整的多种毛发的研究(例如研究毛发周期和能够影响该周期的因素)，从对促进毛发生长的活性剂的研究，对使得能够防止脱发的活性剂或减缓体毛生长的活性剂的研究。

为了鉴定新颖的活性剂的产品筛选方法包括：步骤(a)使所述测试产品与根据本发明的头皮等效物接触，然后步骤(b)分析所述产品对头皮等效物的至少一个参数的影响，和步骤(c)选择使所述参数改变的产品。

优选地，为了进行步骤(a)，将测试产品局部应用，例如配制成常规局部制剂或引入培养基中的其他制剂。

特别地，可以通过对与微毛囊的质量和/或微毛囊的稳态有关的标记的表达、产生、和/或活性(例如表皮和/或皮肤标记，如结构蛋白)的分析来进行步骤(b)。作为结构蛋白的实例，可以提及毛发角蛋白。

为此，在筛选过程的步骤(b)中将对产品对毛干生长的影响进行分析。

分析产品效果的步骤(b)将优选地将将与测试产品接触的在微毛囊上测量的至少一个参数与在相同条件下培养的但未接受测试产品的对照微毛囊上测量的那些参数进行比较。

选择使头皮等效物参数改变的产品的步骤(c)将作为预先确定的标准功能进行。

该参数的改变可以是对表达、产品和/或所述标记的活性和/或毛干的生长的刺激、降低或全部或部分的抑制。

用于选择所述产品的标准将例如是该产品对所测量的参数具有刺激或抑制作用。

根据本发明的头皮等效物也可以在自动化方法中使用，用于筛选用于鉴定新颖活性剂的化妆品、药物、或皮肤病学化合物。

附图说明

附图使得能够更好地说明本发明，然而不限制其范围。

图1：基质细胞定位

图2：真皮乳头上方的部分

图3：含有基质细胞的毛球

图4：沉积于3T3饲养层上的基质细胞簇

图5：培养3天后的基质细胞

图6：培养10天后汇合的基质细胞

图7：伴随簇形成，对基质细胞进行初始培养

图8：3D培养3天后基质细胞的球

图9：在3D培养中形成芽

图10：芽对K85和K35强烈地呈阳性

图11：展现出微毛囊的球

图12：来自ORS角质形成细胞的3D培养中无芽形成

以下给出的实例被呈现为本发明的非限制性说明。

实例1-微毛囊的制备

实验方案

i.基质细胞显微解剖

从头皮的手术残余物中提取毛囊。首先将所述残余物切割成5mm²的部分，并然后使用解剖刀在真皮与皮下组织之间切片。

使用眼科手术钳将毛囊提取出来，并然后用解剖刀在乳头上方切片(图2)。然后回收毛球(图3)。在该阶段，毛球包括两个隔室：真皮隔室(真皮乳头和结缔组织鞘)。形成细胞块的基质细胞。

使用灌注针将上皮部分与真皮部分分开。

ii.培养条件：

培养条件具有三个主要的部分：

·基础培养基：

除非另有说明，在实例中使用的所有的培养基和缓冲液在Bell等人，1979(P.N.A.S.USA[美国国家科学院院刊]，76，1274-1278)；Asselineau和Prunieras，1984(British J.of Derm.[英国皮肤病学杂志]，111，219-222)或Asselineau等人，1987(Models in dermato.[皮肤病研究模型]，第III卷，Lowe和Maibach编辑，1-7)中进行了描述。

MEM培养基+10％FCS+3F(被称为3F培养基)具有以下组分：

·培养补充物：对细胞发出信号必须分裂或分化的生长因子。10μM的Y27632。

·粘附表面：在基于Green的培养基中，通过丝裂霉素处理在细胞周期中捕获的鼠科动物3T3成纤维细胞的饲养层的存在下基质细胞粘附和增殖。

角质形成细胞的培养-扩增

显微解剖后，基质细胞簇沉积在直径为60mm的有盖培养皿中，事先用1百万个3T3细胞接种，并用完全培养基覆盖；获得在汇合时的基质细胞的培养物。

为了产生球，通过酶处理在亚聚集阶段回收细胞。可以用已经描述的常规技术(悬滴、离心、非粘附性支持)以各种方式获得球。在悬滴的情况下，将3000个细胞以球面放入板中。为了监测它们的进展，48小时后在96孔板中回收这些细胞。

将未解离的基质细胞簇分离并沉积在3T3饲养层上(图4)。培养3天后，细胞开始以基质簇周围的菌落形式增殖(图5)。细胞在10天内达到亚汇合(图6)。

它们的特点是体积非常小，并且增殖能力强。为了确保扩增，然后将细胞接种到T75烧瓶中。因此，将3个毛球培养3周后，在第1代有可能产生大约4000万个基质细胞。

有可能观察到基质细胞能够在体外迅速形成细胞团块。该现象似乎是由于这些细胞的趋性属性。在green 7F培养基中，这些簇形成了一个恢复毛囊芽的规则模式(图7)。

此外，在形成这些簇的期间，发生悬浮液中大量球细胞的产生，并且可以将所述细胞继代培养以产生新的细胞培养物。表征后，这些芽代表基质细胞分化的第一阶段，并且它们对毛发的早期角蛋白(K35和K85)呈阳性。

还进行了用基质细胞的3D培养。培养3天后，这些细胞形成球(图8)。

培养大约7天后，这些球改变了构象，呈现出两极化的组织。出现萌芽，这似乎表明球的分化(图9)。这些芽对K85和K35强烈地呈阳性。

一些球表现出似乎是角质化的纤维形式的结构(图10)，并且从ORS角质形成细胞培养物中未发现该结构。

Claims (18)

1.一种用于制备微毛囊的“体外”方法，所述方法包括至少一个步骤：在有效量的ROCK抑制剂的存在下培养所述位于毛球中的基质细胞，持续足够的一段时间以允许所述细胞分化成对K85 K35标记呈阳性的角质形成细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂的有效量是从1 µM至100 µM。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂的有效量是从5 µM至25 µM。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂的有效量是10 µM。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述基质细胞在所述ROCK抑制剂的存在下培养持续至少2天。

7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述基质细胞在所述ROCK抑制剂的存在下培养持续至少3天。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对K85 K35标记呈阳性的角质形成细胞达到汇合同时形成规则簇。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a-分离支持物上的囊；

b-在浸入培养基中的所述支持物上，切割真皮乳头上方的球区域；

c-在所述支持物上回收处于细胞团块形式的基质细胞；

d-在ROCK抑制剂的存在下扩增所述基质细胞；

e-回收对K35 K85标记呈阳性的角质形成细胞；

f-在3D培养中培养在步骤 e) 中获得的所述角质形成细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于在步骤f) 中，置于培养中的角质形成细胞的数目是在1000个和4000个细胞之间。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于在步骤f) 中，置于培养中的角质形成细胞的数目是3000个细胞。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于营养培养基是3F培养基。

13.一种微毛囊，所述微毛囊可以通过根据权利要求1至12中任一项所述的方法获得，其特征在于所述微毛囊由在ROCK抑制剂的存在下位于毛球中的基质细胞的扩增和分化而形成的细胞所构成，所述细胞是对K85 K35标记呈阳性的角质形成细胞且一旦汇合即呈规则簇的形式。

14.根据权利要求13所述的微毛囊用于制备植入物的“体外”用途，所述植入物用于对多毛性减弱状态进行预防或治疗处理。

15.根据权利要求13所述的微毛囊用于制备植入物的“体外”用途，所述植入物用于治疗脱发。

16.如权利要求13所述的微毛囊的“体外”用途，用于在体外测试活性剂对毛发特性的影响。

17.根据权利要求13所述的微毛囊的“体外”用途，用于在体外鉴定调节体毛和/或头发生长的化合物。

18.一种为了鉴定新颖的活性剂的“体外”产品筛选方法，所述方法包括：步骤(a) 在体外将所述测试产品与根据权利要求13所述的微毛囊接触，然后步骤(b) 分析所述产品对所述微毛囊的至少一种参数的影响，以及步骤(c) 选择使所述参数改变的产品。

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