CN109504651A - 一种体外表皮三维模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外表皮三维模型的建立方法，包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养。本发明通过将饲养层细胞和角质细胞共培养，得到体外表皮模型，此构建过程不使用胶原支架，依赖细胞自身分泌的细胞外基质构建，通过HE染色检测，显示该体外表皮模型与人体皮肤结构相似；在角质细胞的制备过程中，使用基质胶包被的培养板进行培养，该基质胶可模拟体内Hacat细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于Hacat细胞的体外培养和分化，通过这种方法培养的Hacat细胞，避免了检测结果上的局限性和滞后性；通过对该体外表皮模型进行皮肤体外刺激性实验，表明该体外表皮模型的组织生存率和组织灵敏度均满足皮肤测试的要求。

Description

一种体外表皮三维模型的建立方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种体外表皮三维模型的建立方法。

背景技术

皮肤，是包覆在身体表面，直接同外界环境接触，具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用的一种器官。皮肤分表皮和真皮两层，表皮在皮肤表面，又可分成角质层和生发层两部分。

人工皮肤模型是将体外培养扩增的大量的具有增殖能力的皮肤细胞，种植于具有生物兼容性的高分子材料中，目的是获得与正常皮肤类似的可替代的人工皮肤。皮肤模型按照复杂程度分为上表皮模型、真皮模型和表皮-真皮(复层皮肤)模型3种，这些体外替代模型对于体内、体外的毒理学评价具有重要意义。

体外皮肤模型主要应用于检测领域，目前有使用Hacat细胞株构建皮肤模型，但常使用支架材料作为真皮基质，接种3T3成纤维细胞后，再与Hacat细胞共培养，得到包括角质层、颗粒层和基底层的与正常皮肤结构相似的皮肤模型，在此过程中，需要构建胶原支架，胶原支架的存在，会对细胞形态、分布以及细胞外基质产生影响，而且，人工构建的胶原支架，在生物相容性方便有待验证；在Hacat细胞的培养过程中，通常采用常规方法，因此使用Hacat细胞构建的皮肤模型在检测结果上具有局限性和滞后性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种体外表皮三维模型的建立方法，通过将饲养层细胞和角质细胞共培养，得到体外表皮模型，在此构建过程中，不使用胶原支架，依赖细胞自身分泌的细胞外基质进行构建，通过HE染色检测，显示该体外表皮模型与人体皮肤结构相似；在对角质细胞进行制备的过程中，使用基质胶包被的培养板进行培养，该基质胶可模拟体内Hacat细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于Hacat细胞的体外培养和分化，通过这种方法培养的Hacat细胞，避免了检测结果上的局限性和滞后性；通过对该体外表皮模型进行组织灵敏度实验和组织生存率实验，表明该体外表皮模型可用于替代皮肤检测。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种体外表皮三维模型的建立方法，包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养，具体方法步骤如下：

步骤a：取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，经处理，播种至transwellⅠ底部培养，得饲养层细胞；

步骤b：角质细胞的制备，包括：

步骤b1.取冻存的Hacat细胞，复苏后，接种至T25培养瓶中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T75培养瓶Ⅱ中进行传代培养，得Hacat细胞Ⅱ；

步骤b2.使用基质胶对transwellⅡ进行包被，设定transwellⅡ的位置为高位置；

步骤b3.将所述Hacat细胞Ⅱ培养至80％-90％融合度，得Hacat细胞Ⅲ，将所述Hacat细胞Ⅲ使用胰酶进行消化处理，收集消化处理后的所述Hacat细胞Ⅲ，接种至所述transwellⅡ内，得角质细胞；

步骤c：饲养层细胞和角质细胞的共培养，包括：

步骤c1.使用PBS缓冲液对所述饲养层细胞进行清洗，清洗完成后，向所述transwellⅠ内加入Hacat细胞增殖培养基；

步骤c2.将所述transwellⅡ放置于所述饲养层细胞上方进行共培养，共培养4d后，吸去所述transwellⅡ和所述transwellⅠ内的增殖培养基，吸取完成后，向所述transwellⅠ底部加入Hacat分化培养基，进行气升式培养；

步骤c3.气升式培养4d后，更换所述transwellⅠ底部的Hacat分化培养基，继续培养3d后，更换所述transwellⅠ内的饲养层细胞，该过程中的饲养层细胞均为丝裂霉素C处理过的饲养层细胞；

步骤c4.重复步骤c3；

步骤c5.气升式培养完成，得表皮三维模型样品；

步骤d：对所述表皮三维模型样品进行组织灵敏度实验和组织生存率实验，包括：

步骤d1.准备24孔transwellⅢ，向所述24孔transwellⅢ内加入Hacat分化培养基；

步骤d2.环切所述表皮三维模型样品，移入所述24孔transwellⅢ内，将所述24孔transwellⅢ分为三组，分别为阴性对照组、阳性对照组和空白组；

步骤d3.每隔2分钟，分别向所述阴性对照组和所述阳性对照组内加入DPBS缓冲液和SDS缓冲液，15分钟后，停止加样，使用PBS缓冲液清洗所述阴性对照组和所述阳性对照组，清洗完成后，将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述空白组配合转移至24孔transwellⅣ内；

步骤d4.将所述24孔transwellⅣ放置入二氧化碳培养箱，培养24h，培养完成后，更换所述24孔transwellⅣ内的Hacat分化培养基，继续培养18h；

步骤d5.活性检测：移取CCK-8试剂至混合器，向所述混合器内加入所述Hacat分化培养基，得混合试剂，向所述24孔transwellⅣ内加入所述混合试剂，添加量为0.5mL/孔，添加完成后，将所述24孔transwellⅣ内样品配合转移至24孔transwellⅤ内；

步骤d6.将所述24孔transwellⅤ放置入二氧化碳培养箱内继续培养5h，培养完成后，移取3份所述24孔transwellⅤ内24孔样品至96孔板内，移取量为100uL/孔；

步骤d7.将所述96孔板放置入酶标仪内进行吸光度检测，设定检测波长为450nm，获取数据并进行统计和分析；

步骤e：对所述表皮三维模型样品进行HE染色检测。

进一步地，所述步骤a的具体操作过程为：

步骤a1.取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，接种至T75培养瓶Ⅰ中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T150培养瓶中进行传代培养，细胞生长至100％融合度，得3T3细胞Ⅱ；

步骤a2.使用丝裂霉素C对所述3T3细胞Ⅱ进行处理，处理时间为2h，，处理完成后，使用所述PBS缓冲液对所述3T3细胞Ⅱ进行清洗，清洗完成后，使用胰酶对所述3T3细胞Ⅱ进行消化处理，得3T3细胞Ⅲ；

步骤a3.收集所述3T3细胞Ⅲ，播种至transwellⅠ底部，培养1-3天，至所述3T3细胞Ⅲ完全贴壁，得饲养层细胞。

本发明的有益效果是：

本发明通过将饲养层细胞和角质细胞共培养，得到体外表皮模型，在此构建过程中，不使用胶原支架，依赖细胞自身分泌的细胞外基质进行构建，通过HE染色检测，显示该体外表皮模型与人体皮肤结构相似；在对角质细胞进行制备的过程中，使用基质胶包被的培养板进行培养，该基质胶可模拟体内Hacat细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于Hacat细胞的体外培养和分化，通过这种方法培养的Hacat细胞，避免了检测结果上的局限性和滞后性；通过对该体外表皮模型进行组织灵敏度实验和组织生存率实验，表明该体外表皮模型可用于替代皮肤检测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明提供的体外表皮三维模型建立方法的流程示意图；

图2是本发明提供的饲养层细胞的制备流程示意图；

图3是本发明提供的transwellⅡ内部结构示意图；

图4是本发明提供的角质细胞的制备流程示意图；

图5是本发明提供的饲养层细胞和角质细胞的共培养的流程示意图；

图6是本发明提供的饲养层细胞和角质细胞的共培养图；

图7是本发明提供的经HE染色后的体外表皮模型照片；

图8是本发明提供的表皮三维模型组织灵敏度实验和组织生存率实验流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

如图1所示的一种体外表皮三维模型的建立方法，包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养，饲养层细胞和角质细胞的共培养后得到表皮三维模型样品，对得到的表皮三维模型样品进行HE染色检测验证表皮结构的一致性，对得到的表皮三维模型样品进行体外模型刺激性实验，验证表皮理化活性。

如图2所示，饲养层细胞的制备，包括以下步骤：

1)取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，接种至T75培养瓶Ⅰ中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用0.25％的胰酶溶液进行消化，消化后的细胞，接种至T150培养瓶中进行传代培养，细胞生长至100％融合度，得3T3细胞Ⅱ，胰酶消化中止液可直接使用3T3-Swiss albino培养基；

2)使用丝裂霉素C对3T3细胞Ⅱ进行处理，处理时间为2h，，处理完成后，使用PBS缓冲液对3T3细胞Ⅱ进行清洗，清洗完成后，使用0.25％的胰酶溶液对3T3细胞Ⅱ进行消化处理，得3T3细胞Ⅲ；

3)收集3T3细胞Ⅲ，播种至transwellⅠ底部，培养1-3天，至3T3细胞Ⅲ完全贴壁，得饲养层细胞。

如图3至图4所示，角质细胞的制备，其中，1代表transwellⅡ高位置，2代表transwellⅡ中位置，3代表transwellⅡ低位置，角质细胞的制备包括以下步骤：

1)取冻存的Hacat细胞，复苏后，接种至T25培养瓶中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用0.25％的胰酶溶液进行消化，消化后的细胞，接种至T75培养瓶Ⅱ中进行传代培养，得Hacat细胞Ⅱ；

2)使用基质胶对transwellⅡ进行包被，transwellⅡ分别有高位置中位置和低位置3种位置，设定transwellⅡ的位置为高位置，该过程中使用的基质胶为BDMatrigel^TMMatrix基质胶，模拟体内Hacat细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于Hacat细胞的体外培养和分化；

3)将Hacat细胞Ⅱ培养至80％-90％融合度，得Hacat细胞Ⅲ，将Hacat细胞Ⅲ使用0.25％的胰酶溶液进行消化处理，收集消化处理后的Hacat细胞Ⅲ，接种至transwellⅡ内，得角质细胞。

如图5至图6所示，饲养层细胞和角质细胞的共培养，其中，4代表角质细胞，5代表饲养层细胞，饲养层细胞和角质细胞的共培养包括以下步骤：

1)使用PBS缓冲液对饲养层细胞进行清洗，清洗完成后，向transwellⅠ内加入Hacat细胞增殖培养基；

2)将transwellⅡ放置于饲养层细胞上方进行共培养，共培养4d后，吸去transwellⅡ和transwellⅠ内的增殖培养基，吸取完成后，向transwellⅠ底部加入Hacat分化培养基，进行气升式培养；

3)气升式培养4d后，更换transwellⅠ底部的Hacat分化培养基，继续培养3d后，更换transwellⅠ内的饲养层细胞，该过程中的饲养层细胞均为丝裂霉素C处理过的饲养层细胞；

4)重复步骤c3；

5)气升式培养完成，得表皮三维模型样品。

如图7所示，对表皮三维模型样品进行HE染色检测，染色结果显示，通过本方法制备的表皮模型，在结构上与天然皮肤类似，且层次分明。

如图8所示，对表皮三维模型样品进行组织灵敏度实验和组织生存率实验，具体操作步骤如下：

1)准备24孔transwellⅢ，向24孔transwellⅢ内加入Hacat分化培养基；

2)环切表皮三维模型样品，移入24孔transwellⅢ内，将24孔transwellⅢ分为三组，分别为阴性对照组、阳性对照组和空白组；

3)每隔2分钟，分别向阴性对照组和阳性对照组内加入DPBS缓冲液和SDS缓冲液，15分钟后，停止加样，使用PBS缓冲液清洗阴性对照组和阳性对照组，清洗完成后，将阴性对照组、阳性对照组和空白组配合转移至24孔transwellⅣ内；

4)将24孔transwellⅣ放置入二氧化碳培养箱，培养24h，培养完成后，更换24孔transwellⅣ内的Hacat分化培养基，继续培养18h；

5)活性检测：移取CCK-8试剂至混合器，向混合器内加入Hacat分化培养基，得混合试剂，向24孔transwellⅣ内加入混合试剂，添加量为0.5mL/孔，添加完成后，将24孔transwellⅣ内样品配合转移至24孔transwellⅤ内；

6)将24孔transwellⅤ放置入二氧化碳培养箱内继续培养5h，培养完成后，移取3份24孔transwellⅤ内24孔样品至96孔板内，移取量为100uL/孔；

7)将96孔板放置入酶标仪内进行吸光度检测，设定检测波长为450nm，获取数据，公式计算及参照标准如下：

阴性对照平均OD值计算公式为：

式中：r-阴性对照组OD值的平均值；

b-空白组OD值的平均值；

阴性对照组存活率标准偏差计算公式为：

式中：N-实验组数

X_i-阴性对照组OD值；

μ-阴性对照组OD值的平均值；

阳性对照组存活率计算公式为：

C＝(Y-b)/r

式中：Y-阳性对照组OD值的平均值；

具体实验数据如下表1，

表1

依据表格中阴性对照组存活率标准偏差的数据结果和参照标准比对，可知，由此方法制得的体外表皮模型，其组织生存率符合要求；阳性对照组存活率的计算结果与参照标准比对可知，由此方法制造的体外表皮模型，其灵敏度满足要求，综合这两种结果，证明该体外表皮模型可用于皮肤替代测试。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (2)

1.一种体外表皮三维模型的建立方法，其特征在于：包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养，具体方法步骤如下：

步骤a：取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，经处理，播种至transwell Ⅰ底部培养，得饲养层细胞；

步骤b：角质细胞的制备，包括：

步骤b1.取冻存的Hacat细胞，复苏后，接种至T25培养瓶中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T75培养瓶Ⅱ中进行传代培养，得Hacat细胞Ⅱ；

步骤b2.使用基质胶对transwell Ⅱ进行包被，设定transwell Ⅱ的位置为高位置；

步骤b3.将所述Hacat细胞Ⅱ培养至80％-90％融合度，得Hacat细胞Ⅲ，将所述Hacat细胞Ⅲ使用胰酶进行消化处理，收集消化处理后的所述Hacat细胞Ⅲ，接种至所述transwellⅡ内，得角质细胞；

步骤c：饲养层细胞和角质细胞的共培养，包括：

步骤c1.使用PBS缓冲液对所述饲养层细胞进行清洗，清洗完成后，向所述transwell Ⅰ内加入Hacat细胞增殖培养基；

步骤c2.将所述transwell Ⅱ放置于所述饲养层细胞上方进行共培养，共培养4d后，吸去所述transwell Ⅱ和所述transwell Ⅰ内的增殖培养基，吸取完成后，向所述transwellⅠ底部加入Hacat分化培养基，进行气升式培养；

步骤c3.气升式培养4d后，更换所述transwell Ⅰ底部的Hacat分化培养基，继续培养3d后，更换所述transwell Ⅰ内的饲养层细胞；

步骤c4.重复步骤c3；

步骤c5.气升式培养完成，得表皮三维模型样品；

步骤d：对所述表皮三维模型样品进行组织灵敏度实验和组织生存率实验；

步骤e：对所述表皮三维模型样品进行HE染色检测。

2.根据权利要求1所述的一种体外表皮三维模型的建立方法，其特征在于：所述步骤a的具体操作过程为：

步骤a1.取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，接种至T75培养瓶Ⅰ中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T150培养瓶中进行传代培养，细胞生长至100％融合度，得3T3细胞Ⅱ；

步骤a2.使用丝裂霉素C对所述3T3细胞Ⅱ进行处理，处理时间为2h，，处理完成后，使用所述PBS缓冲液对所述3T3细胞Ⅱ进行清洗，清洗完成后，使用胰酶对所述3T3细胞Ⅱ进行消化处理，得3T3细胞Ⅲ；

步骤a3.收集所述3T3细胞Ⅲ，播种至transwell Ⅰ底部，培养1-3天，至所述3T3细胞Ⅲ完全贴壁，得饲养层细胞。