CN102352407B - Fgf-21活性测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法，其包括培养HL-7702人肝细胞或者L6大鼠肌肉细胞。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体的说，本发明提供了成纤维生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法。
背景技术
成纤维生长因子-21(Fibroblast Growth Factor-21，简称为FGF-21)是一种不依赖胰岛素调节血糖的代谢调节因子，作为一个有效的葡糖糖摄取激活剂。
体内检测方法(包括用动物模型进行检测)成本高，必要时还需要经过人道审批，因此体外测定是FGF-21葡糖糖摄取激活活性的最主要前期检测方式。有文献报道，进行FGF-21活性检测时使用[3H]或[14C]等放射性元素作标记，获得检测结果，进行分析。这样，监测仪器的要求和放射性物质的善后工作非常复杂和繁琐，不适合作为生产中批产品的常规活性监测方法。
例如，中国专利申请200480035794记载了用[14C]标记的葡萄糖进行累积测定FGF-21活性的方法；中国专利申请200580029480记载了用[14C]标记的葡萄糖进行累积测定FGF-21活性的方法，并利用成本更高的小鼠肥胖症动物模型来进行体内测定；中国专利200810223501记载了用[14C]标记的葡萄糖测定人重组FGF-21针对葡萄糖的活性的方法；中国专利申请20080009653记载了用[3H]标记的葡萄糖进行测定FGF-21活性的方法；中国专利申请200910104653记载了用[14C]标记的葡萄糖测定Exendin-4与FGF-21的融合蛋白针对葡萄糖的活性的方法。
另外，由于FGF-21具有刺激细胞增殖的作用，因此有部分方法通过测定细胞增殖的程度来推算葡糖糖摄取激活活性。但是，这种方法的最大缺陷是没有直接检测葡萄糖摄取激活的活性，定性推测结果还差强人意，定性推算的结果就误差较大了。
例如，中国专利200810102542公开了用MTT法测定BaF3细胞增殖，从而表征FGF-21生物活性的方法；中国专利申请200880017036公开了测定内皮细胞增殖来表征FGF-21生物活性的方法；中国专利申请200980130476公开了ELK-用萤光素酶测定法针对293T肾细胞测定FGF-21的生物活性。
本发明根据长期研究和实践，从大量的现有细胞系中，令人意外地发现了HL-7702人肝细胞和L6大鼠成肌细胞，基于它们进行非放射性直接检测FGF-21的葡糖糖摄取激活活性，结果在一定范围内使得FGF-21标准品的浓度对数值与葡糖糖摄取量呈现出良好的线性关系，可以用于体外检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法。
具体而言，本发明提供了成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡糖糖摄取激活活性的体外测定方法，其依次包括：
(a)培养HL-7702人肝细胞或者L6大鼠肌肉细胞；
(b)任选使细胞分化；
(c)细胞饥饿处理；
(d)加入含FGF-21的培养基进行培养；和
(e)检测培养基中的葡萄糖含量，优选所述检测不是放射性检测。
尽管现有大量的细胞系，但是经测试，大量的细胞系在进行上述检测方法中，难以得到良好的线性关系的结果，这可能是各种细胞的代谢水平的差异化所决定的。由于大量细胞系中与FGF-21和葡萄糖代谢相关的细节并未很好地被揭示，因此难以形成规律化的指导。本发明人经过艰苦研究，从大量细胞系中获得了HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞，发现它们适于以上的方法中。
优选在本发明中，步骤(a)中的培养所使用的培养基是完全培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的完全培养基。
优选在本发明中，步骤(b)中的分化所使用的培养基是分化液。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的分化液。
优选在本发明中，步骤(c)中的饥饿处理所使用的培养基是饥饿培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的饥饿培养基。
优选在本发明中，步骤(d)中的培养基是饥饿培养基。在本发明的具体实施方式中，本发明人优化了针对HL-7702人肝细胞和L6大鼠肌肉细胞的饥饿培养基。
优选在本发明中，步骤(a)中培养的细胞是HL-7702人肝细胞，而且不进行步骤(b)。优选其中，步骤(d)中培养基中的FGF-21浓度为0～100μg/mL。因为在此范围内，呈现良好的线性关系。
优选在本发明中，步骤(a)中培养的细胞是L6大鼠肌肉细胞，而且进行步骤(b)。优选其中，步骤(d)中培养基中的FGF-21浓度为4～250μg/mL。因为在此范围内，呈现良好的线性关系。
优选在本发明中，步骤(e)中的检测是用葡萄糖测定试剂盒进行的检测。
本发明的有益效果在于，提供了替代现有技术的新测定方法，直接测定FGF-21的葡糖糖摄取激活活性，实施方便而廉价，测量的线性效果好。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了用HL-7702人肝细胞测定FGF21的葡糖糖摄取激活活性的测定曲线。
图2显示了用L6大鼠成肌细胞测定FGF21的葡糖糖摄取激活活性的测定曲线。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)等手册和相关试剂的厂商说明来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1用HL-7702人肝细胞测定FGF21生物活性
1、试剂和细胞株
| 基础培养基 | RPMI-1640培养基，购自Hyclone公司(cat no.SH30809.018) |
| 血清 | 胎牛血清(FBS)，购自Hyclone公司(cat no.SV3087.02) |
| 消化液 | 0.25％胰蛋白酶溶液，购自Hyclone公司(cat no.SH30042.01) |
| 双抗 | 青霉素/链霉素溶液(100X)，购自HYclone公司(cat no.SV30010) |
| 完全培养基 | 79％基础培养基+20％血清+1％双抗 |
| 饥饿培养基 | 99％基础培养基+1％血清 |
葡萄糖测定试剂盒，购自长春汇力生物技术有限公司(cat no.K077c)。
HL-7702人肝细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2、培养过程：
取HL-7702人肝细胞，接种在5mL完全培养基中，于37℃，5％CO2的培养箱内培养，使细胞贴壁生长，隔天更换完全培养基，待至培养瓶内的细胞汇合到80％左右(约培养2天)，处于对数生长期，即可进行活性测定。
取处于对数生长期的细胞，吸去培养基，用PBS洗三次后，加1mL 0.25％胰酶溶液，镜下观察细胞间连接松散后，吸走胰酶溶液，再加入1mL完全培养基终止消化，用枪头轻轻触打混匀，取10μL细胞液计数，用完全培养基将细胞稀释到5×104/mL。600μL/孔加入24孔板，于37℃，5％CO2培养24h后，吸去培养基，加600μL饥饿培养基培养24h；将FGF-21标准品用饥饿培养基从100μg/mL开始2倍梯度稀释。培养后，吸去培养基，每孔加各稀释度FGF-21的培养基600μL，每个稀释度3个平行孔，对照组3个平行孔，培养24h后，取培养基上清液，用葡萄糖测定试剂盒测定培养基中葡萄糖含量。取无细胞的培养孔培养基作空白对照。酶标仪510nm，37℃测定吸光度，按如下公式计算葡萄糖吸收率：
根据公式：葡萄糖吸收率＝(空白对照组葡萄糖含量-样品组葡萄糖含量)/空白对照组葡萄糖含量×100％。
结果如图1所示，在FGF-21浓度为0～100μg/mL的范围内，葡萄糖吸收率与FGF-21浓度的以2为底的对数呈现出良好的线性关系。
实施利2用L6大鼠成肌细胞测定FGF21生物活性
1、试剂和细胞株
| 基础培养基 | DMEM/High Glucose培养基，购自Hyclone公司(cat no.SH30243.01) |
| 血清 | 胎牛血清(FBS)，购自Hyclone公司(cat no.SV3087.02) |
| 消化液 | 0.25％胰蛋白酶溶液，购自Hyclone公司(cat no.SH30042.01) |
| 双抗 | 青霉素/链霉素溶液(100X)，购自HYclone公司(cat no.SV30010) |
| 完全培养基 | 89％基础培养基+10％血清+1％双抗 |
| 分化液 | 基础培养基+2％血清 |
| 饥饿培养基 | 基础培养基+0.5％血清 |
葡萄糖测定试剂盒，购自长春汇力生物技术有限公司(cat no.K077c)。
L6大鼠成肌细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2、培养过程：
取L6大鼠成肌细胞，接种在5ml完全培养基中，于37℃，5％CO2的培养箱内培养，使细胞贴壁生长，隔天更换完全培养基，待至培养瓶内的细胞汇合到80％左右(约培养2天)，处于对数生长期，即可进行分化。
取处于对数生长期的细胞，吸去培养基，用PBS洗三次后，加1mL 0.25％胰酶溶液，镜下观察细胞即将脱离后，吸走胰酶溶液，再加入1mL完全培养基终止消化，用枪头轻轻触打混匀，取10μL细胞液计数，用完全培养基将细胞稀释到7×104/mL。以800μL/孔的量将细胞稀释液加入12孔板，于37℃，5％CO2培养48h后，吸去培养液，换800μL/孔分化液，隔天换一次分化液，继续培养14天，细胞分化，长出肌纤维细胞。
吸去孔中的分化液，加800μL饥饿培养基培养24h；将FGF-21标准品用饥饿培养基从250μg/mL开始4倍梯度稀释做不同稀释的培养基。培养后，吸去培养基，每孔加各稀释度FGF-21的培养基800μL，每个稀释度3个平行孔，对照组3个平行孔，培养24h后，取培养基上清液，用葡萄糖测定试剂盒测定培养基中葡萄糖含量。取无细胞的培养孔培养基作空白对照。酶标仪510nm，37℃测定吸光度，按如下公式算葡萄糖吸收率：
葡萄糖吸收率＝(空白对照组葡萄糖含量-样品组葡萄糖含量)/空白对照组葡萄糖含量×100％。
结果如图2所示，尽管低浓度时线性关系不佳，但是在FGF-21浓度为4～250μg/mL的范围内，葡萄糖吸收率与FGF-21浓度的以4为底的对数呈现出良好的线性关系。
Claims (9)
1.成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的葡萄糖摄取激活活性的体外测定方法，其依次包括：
(a)培养HL-7702人肝细胞；
(c)细胞饥饿处理；
(d)加入含FGF-21的饥饿培养基进行培养；和
(e)检测培养基中的葡萄糖含量，
而且，其中不进行使细胞分化的步骤(b)，
而且，在FGF-21浓度为0～100μg/mL的范围内，葡萄糖吸收率与FGF-21浓度的以2为底的对数呈现出线性关系。
2.权利要求1所述的体外测定方法，其中步骤(a)中的培养所使用的培养基是完全培养基。
3.权利要求1所述的体外测定方法，其中步骤(c)中的饥饿处理所使用的培养基是饥饿培养基。
4.权利要求1所述的体外测定方法，其中步骤(e)中的检测是用葡萄糖测定试剂盒进行的检测。
5.成纤维细胞生长因子-21的葡萄糖摄取激活活性的体外测定方法，其依次包括：
(a)培养L6大鼠肌肉细胞；
(b)使细胞分化；
(c)细胞饥饿处理；
(d)加入含FGF-21的饥饿培养基进行培养；和
(e)检测培养基中的葡萄糖含量，
而且，在FGF-21浓度为4～250μg/mL的范围内，葡萄糖吸收率与FGF-21浓度的以4为底的对数呈现出线性关系。
6.权利要求6所述的体外测定方法，其中步骤(a)中的培养所使用的培养基是完全培养基。
7.权利要求6所述的体外测定方法，其中步骤(b)中的分化所使用的培养基是分化液。
8.权利要求6所述的体外测定方法，其中步骤(c)中的饥饿处理所使用的培养基是饥饿培养基。
9.权利要求6所述的体外测定方法，其中步骤(e)中的检测是用葡萄糖测定试剂盒进行的检测。
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| 人FGF-21基因的克隆、表达及其调节脂肪细胞糖代谢的活性;侯玉婷等;《遗传》;20100630;第32卷(第06期);583-587 * |
| 侯玉婷等.人FGF-21基因的克隆、表达及其调节脂肪细胞糖代谢的活性.《遗传》.2010,第32卷(第06期),583-587. |
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