CN103451155A - 携带miR-199*的脂肪间充质干细胞在肝癌细胞治疗中的应用及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-199*（miR-199a/b-3p）的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，及其在肝癌细胞治疗中的应用。本发明公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。利用本发明所述的携带miR-199*的AMSC制备肝癌细胞治疗制剂和化疗增敏剂，并应用于肝癌荷瘤小鼠模型的细胞治疗和化疗，可抑制异位肝癌的增殖，控制肝癌的转移；并可显著提高原位肝癌对化疗药物的敏感性，提高化疗效果，进而降低化疗剂量，减轻化疗副反应。本发明为制备新型的肝癌细胞治疗制剂和化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-199*（miR-199a/b-3p）的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，及其在肝癌细胞治疗中的应用。
背景技术
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的死亡率一直高居不下，其对化疗和放疗的敏感性差，过去10年中仅发现有1种激酶抑制剂型化疗药物索拉非尼（sorafenib）对肝癌治疗有所帮助。因此探索肝癌的新型基因或分子标志物，并开发针对该靶点的治疗策略是肝癌治疗的重要问题。
最近，miRNA与肝癌的关系日益受到关注。已有多项研究发现，在肿瘤组织中存在多种miRNAs的表达失调，这些miRNA可能通过对细胞恶性表型相关基因的表达调控而参与肿瘤的发生发展。而在肝癌组织中，miR-21、miR-26、miR-29、miR-122、miR-155、miR-221/222和miR-199a*(miR-199a/b-3p)等多种miRNAs分别以细胞凋亡逃逸、细胞周期调控、浸润和转移调控、炎症调控等方式影响肝癌进程。这其中，miR-199a*是最具价值的肝癌治疗靶点之一。研究发现，HCC的发生发展伴随miR-199a*的低表达，而外源导入miR-199a*则可抑制肝癌细胞增殖，并可增加其化疗敏感性、降低其侵袭性；另外还发现miR-199a*还可抑制HCV和HBV的复制，而HCV和HBV的持续感染与肝癌相关，因此miR-199a*有望作为肝癌防治的新靶点。
发明内容
本发明的目的是提供构建携带miR-199a*的AMSC的方法，并应用于制备肝癌细胞治疗制剂中的应用，可以达到抑制肿瘤增殖，转移的效果，从而为临床应用携带miR-199*的AMSC进行肝癌靶向治疗提供依据。
本发明公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤：
1）脂肪来源的间充质干细胞的制备：脂肪组织经DPBS清洗后，用I型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；
2）携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的制备：has-miR-199*表达质粒通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率（转染效率约70%），以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4-6周后可获得稳定表达miR-199*的携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞。
进一步的，所述脂肪组织为成人脂肪组织，所述miR-199*为has-miR-199*。
携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的基本特性。
携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。
携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。（所述携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞为携带miR-199*的人脂肪来源的间充质干细胞）
携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞化疗增敏制剂中的应用。
进一步的，所述的肝癌细胞为HepG2,Huh7和Hep3B。
进一步的，所述制剂可控制肝癌细胞增殖和转移。
进一步的，所述制剂可提高肝癌对化疗药物的敏感性。
进一步的，所属制剂的剂型为注射剂。
下面对本发明做进一步的说明。
本发明公开了一种构建携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）的方法，包括如下步骤：
1）脂肪来源的间充质干细胞（AMSC）的制备：吸脂手术采集的成人脂肪组织经DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
2）所述的携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）是按以下方法制备的：has-miR-199*表达质粒（pGCMV/EGFP/has-miR-199*/Blasticidine）通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，转染效率约70%。以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4-6周后可获得稳定表达miR-199*的AMSC-miR-199*。
3）所诉的hsa-miR-199*序列为：ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA。
所述的携带has-miR-199*的AMSC采用荧光定量PCR鉴定miR-199*的表达：消化收集细胞后，采用Life technology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000232-1-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。PCR体系为：SYBR-10ul；miR-199*上游引物-2ul；miR-199*下游引物-2ul；ROX2-0.4ul；水-1.6ul；模板-4ul；PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。
本发明公开了一种AMSC-miR-199*抑制肝癌细胞增殖的应用。
所述的肝癌细胞为HepG2,Huh7和Hep3B。
所述的应用为，AMSC-miR-199*分别以transwell板（FALCON公司，353090）与HepG2,Huh7和Hep3B共培养3天，胰酶消化收集细胞后进行肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估，以单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B作为对照。本发明所述的携带miR-199*的成人脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在体外与HepG2,Huh7和Hep3B肝癌细胞共培养后，能抑制肝癌细胞增殖及活性。
所述的肝癌细胞增殖及活性评估采用MTT法，步骤如下：
1.胰酶消化收集共培养3天的肝癌细胞（HepG2,Huh7和Hep3B），及单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B，按5000/孔，接种96孔细胞培养板；
2.培养48小时后，弃去培养液，每孔加入20μl终浓度为5mg/ml的MTT溶液，于培养箱中孵育4小时；
3.弃去培养液，加入150μl的DMSO，溶解蓝紫色产物甲臜（formazan)，于摇床上轻摇5-10分钟至甲臜完全溶解；
4.在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
本发明公开了一种hAMSC-miR-199*抑制肝癌细胞转移的应用。
所述的肝癌细胞为HepG2,Huh7和Hep3B。
所述的应用为，AMSC-miR-199*分别以transwell板（FALCON公司，353090）与HepG2,Huh7和Hep3B共培养3天，胰酶消化收集细胞后进行肝癌细胞侵袭性的评估，以单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B作为对照。本发明所述的携带miR-199*的成人脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在体外与HepG2,Huh7和Hep3B肝癌细胞共培养后，能降低肝癌细胞的侵袭性，抑制其转移。
所述的肝癌细胞侵袭性的评估采用细胞芯片法，步骤如下：
1.胰酶消化收集共培养3天的肝癌细胞（HepG2,Huh7和Hep3B），及单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B细胞，按15000/孔，接种于细胞芯片板（CIM-Plate16）；
2.继续培养48小时，采用细胞芯片仪（RTCA DP）进行肝癌细胞转移程度的实时评估。
本发明公开了一种AMSC-miR-199*提高肝癌细胞化疗敏感性的应用。
所述的肝癌细胞为HepG2,Huh7和Hep3B。
所述的应用为，AMSC-miR-199*分别以transwell板（FALCON公司，353090）与HepG2,Huh7和Hep3B共培养3天，胰酶消化收集肝癌细胞后接种于细胞培养板，给予梯度浓度的肝癌常规化疗药物48小时后，进行肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估，以未与AMSC-miR-199*共培养（单独培养）的HepG2,Huh7和Hep3B作为对照。本发明所述的携带miR-199*的成人脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在体外与HepG2,Huh7和Hep3B肝癌细胞共培养后，能显著提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性，具体表现为肝癌化疗药物对与AMSC-miR-199*共培养后的肝癌细胞增殖抑制和促凋亡作用都明显增强。
所述的肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估分别采用细胞芯片法和流式Annexin V/PI凋亡检测。
所述的细胞芯片法，步骤如下：
1.胰酶消化收集共培养3天的肝癌细胞（HepG2,Huh7和Hep3B），及单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B细胞，按5000/孔，接种于96孔细胞芯片板（型号DC96-A-NT）；
2.培养24小时后，再分别给予IC50浓度的Sorafenib,Doxorubicin和5-FU；
3.继续培养48小时，采用细胞芯片仪(ACEA Biosciences,lnc)进行肝癌细胞增殖的实时评估。
所述的流式Annexin V/PI凋亡检测，步骤如下：
1.胰酶消化收集共培养3天的肝癌细胞（HepG2,Huh7和Hep3B），及单独培养的HepG2,Huh7和Hep3B细胞，按5×105/孔，接种于6孔细胞培养板；
2.培养24小时后，再分别给予IC50浓度的Sorafenib,Doxorubicin和5-FU；
3.继续培养48小时后，胰酶消化收集细胞，调整细胞数为2～5×105/样本。采用BD公司的Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（货号：556547），按试剂盒说明书进行流式标记；
4.荧光标记后采用BD流式细胞仪（Accuri C6）进行凋亡检测分析；
所述的Annexin V/PI凋亡结果分析为：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为FITC-/PI-；左上象限是坏死细胞，为FITC-/PI+；而右下和右上象限分别为早期凋亡和晚期细胞，为FITC+/PI-和FITC+/PI+。
本发明了还公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂及肝癌化疗增敏剂中的应用，从而为肝癌的系统治疗提供新方法。
本发明公开了一种携带miR-199*的成人脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。
所述的肝癌荷瘤裸鼠模型是通过以下方法建立的：裸鼠腋窝皮下接种或尾静脉输注1×106标记了luciferase的肝癌细胞，以分别建立肝癌皮下荷瘤模型和肝癌转移模型。每周通过测量肿瘤体积及小动物活体成像技术实时检测luciferase的生物发光信号，连续5-6周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
所述的AMSC-miR-199*由DPBS稀释，针对肝癌皮下荷瘤模型，AMSC-miR-199*采用瘤内注射方式；针对肝癌转移模型，AMSC-miR-199*采用尾静脉输注方式。
所述的AMSC-miR-199*瘤内注射方式为，AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×108/mL的浓度，瘤内注射有效剂量为1～2×106/次，输注时间为肝癌细胞接种后2周，4周。
所述的AMSC-miR-199*尾静脉输注方式为，AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×107/mL的浓度，尾静脉输注的有效剂量为2×106/只，输注时间为肝癌细胞尾静脉输注后24小时。
所述的肿瘤体积计算公式为，V(mm3)=a×(b2/2)；a=肿瘤长径，b=肿瘤短径。
所述的小动物活体成像检测方法为：裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-luciferin（luciferase的底物），10-15分钟时采用小动物活体成像仪（LBLS-579）进行luciferase生物发光信号的实时检测。
将本发明所述的AMSC-miR-199*用于肝癌荷瘤裸鼠模型的治疗效果评价：
（1）肿瘤体积测量；
（2）肝癌细胞luciferase的生物发光信号检测；
（3）血清中AFP水平检测；
（4）肝脏组织TUNEL分析；
（5）裸鼠体重及状态监测。
本发明还公开了一种AMSC-miR-199*在提高肝癌荷瘤裸鼠模型化疗敏感性中的应用。
所述的肝癌荷瘤裸鼠模型是通过以下方法建立的：裸鼠肝脏原位接种1×106标记了luciferase的肝癌细胞，建立肝癌原位荷瘤模型。每周通过小动物活体成像技术实时检测luciferase的生物发光信号，连续5周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
所述的AMSC-miR-199*输注方式为尾静脉输注，AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×107/mL的浓度，有效剂量为2×106/只，输注时间为肝脏原位接种后3天、17天。
所述的化疗药物为肝癌常规化疗药物，如Sorafenib、5-FU、Doxorubicin，Sorafenib的给药剂量为30mg/kg，5-FU的给药剂量为30mg/kg，Doxorubicin的给药剂量为2mg/kg，均采用腹腔注射。
所述的小动物活体成像检测方法为：裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-luciferin（luciferase的底物），10-15分钟时采用小动物活体成像仪（LBLS-579）进行luciferase生物发光信号的实时检测。
将本发明所述的AMSC-miR-122用于提高肝癌化疗敏感性的效果评价：
（1）肝癌细胞luciferase的生物发光信号检测；
（2）血清中AFP水平检测；
（3）肝癌组织TUNEL分析；
（4）裸鼠体重及状态监测。
由于肝癌异质性高，放化疗敏感性差，因此探索肝癌治疗的新靶点，并开发针对该靶点的治疗策略对于其治疗具有积极意义。近年来，miR-199a*(miR-199a/b-3p)在肝癌发生发展中的作用备受关注。体外研究显示，外源导入miR-199a*则可抑制肝癌细胞增殖，并可增加其化疗敏感性、降低其侵袭性。但基因治疗的另一关键问题是载体选择，如何在体内实现miR-199*向肝脏肿瘤部位的输送对于其临床应用前景至关重要，因此miR-199*靶向输送载体的选择就显得尤为关键。脂肪组织来源的MSC(AMSC)作为一类新型的基因治疗运载系统具有高效、安全、肿瘤靶向性等诸多优点，而且作为一类可重复获取、供者不适度低的干细胞在临床上具有更高的应用价值。
利用本发明所述的携带miR-199*的AMSC制备肝癌细胞治疗制剂和化疗增敏剂，并应用于肝癌荷瘤小鼠模型的细胞治疗和化疗，可抑制异位肝癌的增殖，控制肝癌的转移；并可显著提高原位肝癌对化疗药物的敏感性，提高化疗效果，进而降低化疗剂量，减轻化疗副反应。本发明为制备新型的肝癌细胞治疗制剂和化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。
本发明所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积（W/V）百分比浓度或体积/体积（V/V）百分比浓度。
附图说明
图1为AMSC-miR-199*中的miR-199*表达PCR分析图。
图2为AMSC-miR-199*在体外抑制肝癌细胞转移的结果图。
图3为AMSC-miR-199*在体外增强肝癌细胞化疗敏感性的Annexin V/PI凋亡分析结果图。
图4为肝癌异位荷瘤模型的肿瘤体积检测图，其中横坐标代表肝癌细胞接种时间。
图5为肝癌转移模型实验终点的小动物活体成像检测图；其中组1整个肺部有明显的luciferase生物发光信号，而组2仅在局部具有生物发光信号最弱。
图6为肝癌转移模型的体重变化图，其中横坐标代表肝癌细胞输注时间。
图7为肝癌原位荷瘤模型的小动物活体成像数据图，其中横坐标0代表给药起始时间。
图8为肝癌原位荷瘤模型的体重变化图，其中横坐标0代表给药起始时间。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。
所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积（W/V）百分比浓度或体积/体积（V/V）百分比浓度。
实施例一：携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在抑制异位肝癌进展中的应用。
1、脂肪间充质干细胞（AMSC）的制备：
脂肪组织（可以是通过吸脂手术分离出的成人的脂肪组织，或者是小鼠等动物体分离得到的脂肪）经DPBS清洗后，用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清（MSC适宜胎牛血清）的低糖DMEM培养基的塑料培养瓶内，24小时后全量换液，除去血细胞，贴壁细胞视生长情况2～3天半量换液，增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代数次，达到纯化和扩增AMSC的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
2、AMSC-miR-199*的构建：
hsa-miR-199*表达质粒(pGCMV/EGFP/hsa-miR-199*/Blasticidine)（上海吉玛生物）通过LipofectamineTM2000介导转染AMSC，以60-mm小培养皿为例：AMSC接种至60-mm小培养皿，采用无青链霉素的AMSC培养液培养过夜，待细胞密度至80%左右，换为5ml的Opti-MEM；同时用0.5ml的Opti-MEM稀释8μg的hsa-miR-199*表达质粒；并在另0.5ml的Opti-MEM中加入20μl LipofectamineTM2000；室温静置5分钟后，把稀释后的质粒和LipofectamineTM2000进行混合，再室温静置20分钟后加入细胞培养皿中；培养4-6小时后换为无青链霉素的AMSC完全培养液（L-DMEM+5%FBS）。
根据hsa-miR-199*表达质粒所带的EGFP基因指示转染效率，荧光显微镜下观察，转染效率可达70%左右。以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选培养，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-199*的AMSC-miR-199*细胞。
采用荧光定量PCR法鉴定AMSC中miR-199*的表达：
消化收集细胞后，采用Life technology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000232-1-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。
PCR体系为：SYBR-10ul；miR-199*上游引物-2μl；miR-199*下游引物-2μl；ROX2-0.4μl；水-1.6μl；模板-4μl。PCR条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃30s，40个循环。
PCR结果分析：转染miR-199*的AMSC，其miR-199*的表达水平明显高于对照组（图1）
采用流式细胞术鉴定AMSC-miR-199*的间充质干细胞特性，其细胞表型为CD29(+),CD31(-),CD44(+),CD45(-),CD73(+),CD90(+),CD105(+),HLA-DR(-)；细胞周期以G0/G1期为主（＞95%），符合AMSC的干细胞特性标志，与未转染miR-199*的普通AMSC和AMSC-miR-NC（转染无关miRNA的AMSC）的细胞表型和周期均类似。
3、肝癌异位荷瘤模型的建立：
Huh7肝癌细胞通过转染带luciferase基因的慢病毒质粒（和元生物技术有限公司），并经抗性筛选，而得到稳定表达luciferase的Huh7肝癌细胞（Huh7-luci）。5周龄裸鼠腋窝皮下接种1×106的Huh7-luci肝癌细胞，每周通过测量肿瘤体积及小动物活体成像技术实时检测luciferase的生物发光信号，连续6周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
4、AMSC-miR-199*输注：AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×108/mL的浓度，采用瘤内注射方式，有效剂量为1～2×106/次，输注时间为肝癌细胞接种后1周，3周。
5、肝癌异位荷瘤模型的治疗分组：
组1：模型对照组（输注同等体积的DPBS）；
组2：AMSC-miR-199*治疗组；
6、效果评价：
（1）肿瘤体积和重量测量：每周2次，用游标卡尺测量肿瘤长径（a）和短径（b），并按公式计算肿瘤体积：V(mm3)=a×(b2/2)；如图4所示，组2的肿瘤增殖明显低于组1。肝癌细胞接种6周后（实验终点），吸入性麻醉法处死裸鼠后，剥离其肿瘤组织称重，并计算其肿瘤抑制率。显示，组2的瘤重明显低于组1，抑制率达39.7%。
（2）肝癌细胞luciferase的生物发光信号检测：每周1次，采用小动物活体成像仪（LBLS-579）进行luciferase生物发光信号的实时检测。裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-luciferin（luciferase的底物，Perkin Elmer公司），并腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，10-15分钟内进行生物发光信号的检测。结果显示，肝癌组织的luciferase生物发光信号，组2也要明显低于组1。
（3）血清中AFP水平检测：实验终点采用眼底毛细管采血法，收集全血并分离血清，进行AFP蛋白的ELISA检测。组2的AFP蛋白水平低于组1。
（4）肝癌组织TUNEL分析：实验终点，吸入性麻醉法处死裸鼠后，剥离其肿瘤组织，福尔马林固定后石蜡包埋切片，进行TUNEL染色。结果显示，组2的肿瘤组织凋亡程度要高于组1。
（5）裸鼠体重及状态监测：每周2次称量裸鼠体重并观察其状态。两组的体重及状态无明显差异。
上述评价指标显示，AMSC-miR-199*可用于制备肝癌的细胞治疗制剂，AMSC-miR-199*输注可抑制肝癌异位荷瘤模型中肝癌的进展。
实施例二：携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在控制肝癌转移中的应用。
1、AMSC-miR-199*的构建和验证方法同前；
2、肝癌转移模型的建立：
6周龄裸鼠尾静脉输注1×106的Huh7-luci肝癌细胞，每周通过小动物活体成像技术实时检测luciferase的生物发光信号（检测方法同前），连续5周，确认肝癌转移模型的建立。
3、AMSC-miR-199*输注：AMSC-miR-199*由DPBS稀释，采用尾静脉输注方式；
所述的AMSC-miR-199*尾静脉输注方式为，AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×107/mL的浓度，尾静脉输注的有效剂量为2×106/只，输注时间为肝癌细胞尾静脉输注后24小时。
4、肝癌转移模型的治疗分组：
组1：模型对照组（输注同等体积的DPBS）；
组2：AMSC-miR-199*治疗组；
5、效果评价：
（1）肝癌细胞luciferase的生物发光信号检测：每周1次，采用小动物活体成像仪（LBLS-579）进行luciferase生物发光信号的实时检测。裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-luciferin（luciferase的底物，Perkin Elmer公司），并腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，10-15分钟内进行生物发光信号的检测。结果显示，组1肝癌细胞输注后1周即在肺部可见微弱的luciferase生物发光信号，此后肺部的生物发光信号逐渐明显，实验终点整个肺脏部位均可见明显的luciferase生物发光信号。而组2的luciferase生物发光信号在肝癌细胞输注后1周-3周时均不明显，在4周后略有增强，至实验终点在肺脏局部可观察到较明显的luciferase生物发光信号（图5）。
（2）血清中AFP水平检测：实验终点采用眼底毛细管采血法，收集全血并分离血清，进行AFP蛋白的ELISA检测。组2的AFP蛋白水平明显低于组1。
（3）肺脏组织HE分析及肿瘤组织TUNEL分析：实验终点，吸入性麻醉法处死裸鼠后，切取其肺部组织及肿瘤组织，福尔马林固定后石蜡包埋切片，分别进行HE和TUNEL染色。HE染色显示，组1的肺组织正常结构破坏严重，肿瘤灶呈多发性分布，而组2的肺组织尚保有正常的组织结构，仅有少量散在的肿瘤灶。TUNEL结果显示，组2的肿瘤组织凋亡程度要高于组1。
（4）裸鼠体重及状态监测：每周2次称量裸鼠体重并观察其状态。如图6所示，组1的体重在肝癌细胞尾静脉输注3周后即开始降低，至5周时体重明显减轻；裸鼠活动性变差，拱背，呼吸异常。而组2的体重至5周时也无明显改变，裸鼠活动性和进食量正常。
上述评价指标显示，AMSC-miR-199*可用于制备肝癌的细胞治疗制剂，AMSC-miR-199*输注可控制肝癌转移瘤模型中的肝癌转移，改善裸鼠状态。
实施例三：携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞（AMSC-miR-199*）在原位肝癌化疗增敏中的应用。
1、AMSC-miR-199*的构建和验证方法同前；
2、肝癌原位荷瘤模型的建立：
6周龄裸鼠采用戊巴比妥钠麻醉，开腹后于肝脏原位接种2×106的Huh7-luci肝癌细胞，每周通过小动物活体成像技术实时检测luciferase的生物发光信号，连续5周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
3、AMSC-miR-199*输注：AMSC-miR-199*由DPBS稀释，采用尾静脉输注方式；
所述的AMSC-miR-199*尾静脉输注方式为，AMSC-miR-199*由DPBS稀释为1×107/mL的浓度，尾静脉输注的有效剂量为2×106/只，输注时间为肝癌细胞原位接种后第3天，第17天。
4、肝癌原位荷瘤模型的化疗：
所述的化疗药物为肝癌常规化疗药物Sorafenib（LC Laboratories）；
Sorafenib的配制为，采用1:1体积的纯乙醇与cremophor EL(Sigma-Aldrich)助溶后，再用DPBS稀释到5mg/ml；其给药剂量为30mg/kg或90mg/kg；于肝癌细胞腋下接种后1周开始给药，给药周期为，用药5天，停药2天，持续4周；给药方式采用腹腔注射。
5、肝癌原位荷瘤模型的治疗分组：
组1：模型对照组（输注同等体积的Sorafenib溶剂）；
组2：Sorafenib低剂量治疗组（30mg/kg）；
组3：Sorafenib高剂量治疗组（90mg/kg）；
组4：低剂量Sorafenib+AMSC-miR-199*尾静脉输注组。
6、效果评价：
（1）肝癌细胞luciferase的生物发光信号检测：每周1次（停药2天后），采用小动物活体成像仪（LBLS-579）进行luciferase生物发光信号的实时检测。裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-luciferin（Perkin Elmer公司），并腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，10-15分钟内进行生物发光信号的检测。连续监测发现化疗各阶段，组4的luciferase生物发光信号都要明显低于组1和组2，也略低于组3。显示组4对Sorafenib的敏感性要明显高于组1和组2，也好于组3（图7）。（2）血清中AFP水平检测：在Sorafenib给药2周（化疗中期）及4周后（化疗终点）采用眼底毛细管采血法，收集全血并分离血清，进行AFP蛋白的ELISA检测。给药2周及4周后，组4的血清AFP蛋白水平最低，其次为组3和组2，组1的AFP蛋白水平最高。
（3）肝癌组织TUNEL分析：化疗终点，吸入性麻醉法处死裸鼠后，剥离其肿瘤组织，福尔马林固定后石蜡包埋切片，进行TUNEL染色。结果显示，组4的肿瘤组织凋亡程度要明显高于组1和组2，与组3类似。
（4）裸鼠体重及状态监测：每周2次称量裸鼠体重并观察其状态。组3在Sorafenib给药1个周期后，体重即开始出现下降；给药第2周期后，裸鼠肤色偏暗黄，进食量降低；给药第4周期时裸鼠体重明显减轻，行动迟缓。组1的体重在荷瘤3周后也出现下降，荷瘤5周时体重明显降低，行动缓慢。而组2和组4的体重及活动性均要优于组1和组3，尤以组4更佳（图8）。
上述评价指标显示，AMSC-miR-199*输注可显著提高肝癌原位荷瘤模型中肝癌组织对Sorafenib的敏感性，从而有效控制肝脏肿瘤进展以缓解肝癌对裸鼠肝功能的损伤，进而改善荷瘤模型的状态。并且，AMSC-miR-199*输注可使低剂量Sorafenib发挥更好的肝癌抑制效果，从而降低其给药剂量，减轻毒副作用。
<110> 浙江大学
<120>携带miR-199*的脂肪间充质干细胞在肝癌细胞治疗中的应用及其构建方法
<210> 1
<211> 22
<212>RNA
<213>Homo sapiens
<400> 1
ACAGUAGUCU GCACAUUGGU UA
Claims (10)
1.携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）脂肪来源的间充质干细胞的制备：脂肪组织经DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；
2）携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的制备：miR-199*表达质粒通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4-6周后可获得稳定表达miR-199*的携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述脂肪组织为成人脂肪组织，所述miR-199*为has-miR-199*。
3.携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于：具有间充质干细胞的基本特性。
4.携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于：可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。
5.携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。
6.携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞化疗增敏制剂中的应用。
7.根据权利要求3-6任一所述的应用，其特征在于：所述的肝癌细胞为HepG2,Huh7和Hep3B。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述制剂可控制肝癌细胞增殖或转移。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述制剂可提高肝癌对化疗药物的敏感性。
10.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所属制剂的剂型为注射剂。
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| CN114231626A (zh) * | 2021-10-14 | 2022-03-25 | 杭州师范大学 | 一种miRNA联合标志物在制备诊断检测早期肝癌的试剂盒中的应用 |
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| CN101314766A (zh) * | 2007-05-31 | 2008-12-03 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基 |
-
2013
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131218 |