CN107115529A - Kindlin‑2蛋白作为靶点在制备治疗糖尿病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Kindlin‑2蛋白作为靶点在制备治疗糖尿病的药物中的应用。经研究结果显示Kindlin‑2蛋白与胰岛素的表达区域基本重合，其表达量与糖尿病存在密切的相关性。Kindlin‑2基因特异性敲除后的小鼠空腹胰岛素水平明显低于对照组，葡萄糖耐受能力显著下降，但对外周组织的胰岛素的敏感性却没有明显差别，提示Kindlin‑2可以作为治疗糖尿病的药物的一个新的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，特别是涉及一种Kindlin-2蛋白作为靶点在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起。随着人们生活水平的提高，糖尿病的病例数和患病率呈逐年上升的趋势。最新的第七版《IDF Diabetes Atlas》报告(2015年)中指出，全球目前约有4.15亿人患有糖尿病，而在中国，糖尿病患者人数约为1.096亿，占世界糖尿病总数的1/4。预计到2040年，世界糖尿病患病者数目可能达到6.42亿。无论是在发达国家还是在发展中国家，糖尿病形势都是非常严峻的。
然而，目前临床上仍然缺乏有效的治疗糖尿病的药物及治疗方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种Kindlin-2蛋白作为靶点在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，所述药物靶向Kindlin-2蛋白。
在一个实施方式中，所述药物靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白。
在一个实施方式中，所述药物能够调节Kindlin-2蛋白的表达量。
在一个实施方式中，所述药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。
在一个实施方式中，所述药物能够提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量。
Kindlin-2蛋白在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用，所述药物靶向Kindlin-2蛋白。
一种治疗糖尿病的药物，所述药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。
一种治疗糖尿病的药物组合物，包括Kindlin-2蛋白促进剂以及靶向剂，所述Kindlin-2蛋白促进剂负载于所述靶向剂上，所述靶向剂靶向Kindlin-2蛋白。
在一个实施方式中，所述靶向剂选自AAV病毒、miRNA和聚合物胶束中的至少一种。
Kindlin-2蛋白在制备糖尿病的检测试剂中的应用，所述检测试剂以Kindlin-2蛋白作为糖尿病的生物标记物。
经研究表明，Kindlin-2蛋白与胰岛素的表达区域基本重合，其表达量与糖尿病存在密切的相关性。Kindlin-2基因特异性敲除后的小鼠空腹胰岛素水平明显低于对照组，葡萄糖耐受能力显著下降，但对外周组织的胰岛素的敏感性却没有明显差别。本研究的实验结果可以为治疗糖尿病的药物提供了一个新的靶点。
附图说明
图1为实施例1中用胰岛素抗体以及Kindlin-2抗体对小鼠胰腺免疫荧光染色后的结果图；
图2为实施例1中用胰高血糖素抗体以及Kindlin-2抗体对小鼠胰腺免疫荧光染色后的结果图；
图3为实施例1中分别对两个月龄的小鼠以及二十个月龄的小鼠的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体以及VEGF(血管内皮生长因子)抗体进行IHC染色后的结果图；
图4为实施例1中分别对正常饮食的小鼠以及高脂饮食处理小鼠的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体进行IHC染色后的结果图；
图5为实施例1中分别对正常人的胰岛β细胞以及T2D患者的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体进行IHC染色后的结果图；
图6为实施例2中Kindlin-2基因敲除后不同组织中的Kindlin-2miRNA含量统计图；
图7为实施例2中实验组和对照组的生长曲线图；
图8为实施例2中两个月龄的实验组和对照组小鼠的外观；
图9为实施例2中实验组和对照组的生存率结果统计图；
图10为实施例3中实验组和对照组的空腹血糖水平测试结果图；
图11为实施例3中实验组和对照组的葡萄糖耐受能力测试结果图；
图12为实施例4中实验组和对照组的空腹胰岛素水平测试结果图；
图13为实施例4中实验组和对照组的胰岛素耐受性测试结果图；
图14为实施例5中实验组和对照组的β细胞面积/胰腺面积的统计结果图；
图15为实施例5中实验组和对照组的β细胞总量的统计结果图；
图16为实施例5中实验组和对照组的胰岛面积/胰腺面积的统计结果图；
图17为实施例6中采用胰岛素抗体和Ki67抗体分别对实验组和对照组的β细胞免疫荧光染色后的结果图；
图18为实施例7中实验组和对照组在葡萄糖刺激下胰岛素分泌量的统计结果图；
图19为实施例7中实验组和对照组在高浓度的葡萄糖刺激下胰岛素分泌量的统计结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其中，该药物靶向Kindlin-2蛋白。
Kindlin-2蛋白是一种粘着斑蛋白，可参与整合素的激活，有研究表明其在肌肉细胞的延长上扮演重要角色。然而关于Kindlin-2蛋白作为靶点治疗的研究较少，目前尚未见其在糖尿病方面的研究报道。而本发明的发明人经实验研究后意外发现Kindlin-2蛋白与胰岛素的表达区域基本重合，且其表达量与糖尿病存在密切的相关性。Kindlin-2基因特异性敲除后的小鼠空腹胰岛素水平明显低于对照组，葡萄糖耐受能力显著下降，但对外周组织的胰岛素的敏感性却没有明显差别。本研究的实验结果可以为治疗糖尿病的药物提供了一个新的靶点。药物通过靶向Kindlin-2蛋白，从而调剂体内Kindlin-2蛋白的表达量，协助糖尿病治疗。
具体的，本文中所说的“治疗糖尿病的药物”可以是为治疗已经确诊为糖尿病的病人制备的药物，也可以是为预防糖尿病而制备的药物。
在一个实施方式的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用中，该药物靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白。胰腺与糖尿病具有密切的关联，通过药物靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白，能够进一步的增强药物的特异性，减少副作用。
在一个实施方式的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用中，该药物能够调节Kindlin-2蛋白的表达量。以Kindlin-2作为靶点，针对不同的患者的病情，调节体内的Kindlin-2蛋白的表达量，从而使得体内的Kindlin-2蛋白表达量分泌正常。
具体的，在Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用中，该药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。研究结果表明，Kindlin-2基因特异性敲除后的小鼠空腹胰岛素水平明显低于对照组，葡萄糖耐受能力显著下降，但对外周组织的胰岛素的敏感性却没有明显差别。提示当Kindlin-2蛋白分泌量降低时，葡萄糖耐受能力较差，可通过药物提高Kindlin-2蛋白的表达量来提高体内吸收利用葡萄糖的能力。
进一步的，在Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用中，该药物能够提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量。通过药物提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量，增强药物的特异性，进而提高体内吸收利用葡萄糖的能力，进一步预防或治疗糖尿病。
一实施方式的Kindlin-2蛋白在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用，其中，该药物靶向Kindlin-2蛋白。经实验研究后发现Kindlin-2蛋白在二型糖尿病病人的胰岛β细胞中表达量明显下降，提示Kindlin-2蛋白可以作为治疗糖尿病的药物的一个新的靶点。
进一步的，Kindlin-2蛋白在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用中，该药物可以靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白。在一个实施方式中，该药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。具体为能够提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量。
综上，研究结果表明，Kindlin-2蛋白与胰岛素的表达区域基本重合，其表达量与糖尿病存在密切的相关性。Kindlin-2蛋白可以作为制备治疗糖尿病的药物的一个新靶点，在制备预防或治疗糖尿病特别是二型糖尿病的药物中的应用中具有良好的应用前景。
此外，本申请还提供一实施方式的治疗糖尿病的药物，其中，该药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。
在一个实施方式中，该治疗糖尿病的药物靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白，并能够提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量。
研究结果显示，当Kindlin-2蛋白分泌量降低时，葡萄糖耐受能力较差，可通过药物提高Kindlin-2蛋白的表达量来提高体内吸收利用葡萄糖的能力，从而治疗糖尿病。上述药物以Kindlin-2蛋白作为治疗靶点，提高Kindlin-2蛋白的表达量从而治疗糖尿病。
进一步的，本申请还提供一实施方式治疗糖尿病的药物组合物，该组合物包括Kindlin-2蛋白促进剂以及靶向剂，Kindlin-2蛋白促进剂负载于靶向剂上，靶向剂靶向Kindlin-2蛋白。
其中，Kindlin-2蛋白促进剂为能够提高Kindlin-2蛋白表达量的药物或试剂，靶向剂为能够靶向Kindlin-2蛋白。Kindlin-2蛋白促进剂可以通过化学键连接或包覆等物理方式负载于靶向剂上。
在一个实施方式中，靶向剂可以选自AAV病毒(Adeno-associated virus，腺相关病毒)、miRNA(MicroRNA)和聚合物胶束中的至少一种。
具体的，AAV病毒、miRNA或聚合物胶束作为载体将Kindlin-2蛋白促进剂携带至体内特定的部位，Kindlin-2蛋白促进剂释放促进体内Kindlin-2蛋白的表达，从而提高Kindlin-2蛋白的表达量，促进体内葡萄糖的吸收利用，预防或治疗糖尿病。
在一个实施方式中，AAV病毒上还可以携带表达Kindlin-2蛋白的基因，从而在体内表达Kindlin-2蛋白，提高Kindlin-2蛋白的表达量。
上述治疗糖尿病的药物组合物，包括Kindlin-2蛋白促进剂以及靶向剂，两者协同作用，提高Kindlin-2蛋白的表达量，进而预防或治疗糖尿病。
此外，本申请还提供一实施方式的Kindlin-2蛋白在制备糖尿病的检测试剂中的应用，其中，该检测试剂以Kindlin-2蛋白作为糖尿病的生物标记物。
通过研究表明，Kindlin-2蛋白的表达量与糖尿病存在密切的相关性，因此Kindlin-2蛋白可作为糖尿病的生物标记物。具体地，检测试剂可以通过Kindlin-2蛋白的表达量来判定糖尿病的病情。
综上，经实验研究后意外发现Kindlin-2蛋白与胰岛素的表达区域基本重合，且其表达量与糖尿病存在密切的相关性。实验结果提示Kindlin-2蛋白可以作为治疗糖尿病的一个新靶点。Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物或者制备糖尿病的检测试剂中具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
未特别说明，以下实施例中RIP-Cre表示对照小鼠，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠。实验用小鼠由美国拉什大学提供，均为雄性鼠。
实施例1
免疫荧光检测Kindlin-2蛋白的表达区域及表达量
1、免疫荧光染色
将两个月龄的小鼠胰腺石蜡包埋切片，分别用胰岛素抗体、Kindlin-2抗体以及胰高血糖素抗体进行染色，并在激光共聚焦显微镜下观察。结果如图1～图2所示，其中图1中(a)图表示胰岛素抗体染色结果，(b)图表示Kindlin-2抗体染色结果，(c)图表示胰岛素抗体和Kindlin-2抗体共同染色的结果。图2中(a)图表示胰高血糖素抗体染色结果，(b)图表示Kindlin-2抗体染色结果，(c)图表示胰高血糖素抗体和Kindlin-2抗体共同染色的结果，(d)图表示(a)图方框区域的局部放大图，(e)图表示DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的染色结果，(f)图表示(c)图方框区域的局部放大图。从图1中可以看出，Kindlin-2和胰岛素的表达区域完全重合。从图2中可以看出，Kindlin-2与外围的胰高血糖素的表达区域没有重叠，说明Kindlin-2在小鼠的胰岛β细胞中大量表达。
2、免疫组织化学染色(IHC)
分别将两个月龄的小鼠以及二十个月龄的小鼠(老年小鼠)的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体以及VEGF(血管内皮生长因子)抗体进行IHC染色，并在显微镜下观察。VEGF抗体组作为阴性对照，结果如图3所示，图3中(a)图表示两个月龄的小鼠的Kindlin-2抗体染色结果，(b)图表示二十个月龄的小鼠的Kindlin-2抗体染色结果，(c)图表示两个月龄的小鼠的VEGF抗体染色结果，(d)图表示二十个月龄的小鼠的VEGF抗体染色结果。从图3中可以看出，Kindlin-2在两个月龄的小鼠胰岛β细胞中表达量较高，而在老年小鼠的胰岛β细胞中表达量明显下降。
分别将正常饮食的小鼠(ND)以及高脂饮食处理小鼠(HFD)的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体进行IHC染色，两组均为两个月龄的小鼠，并在显微镜下观察，结果如图4所示，图4中(a)图表示正常饮食的小鼠的Kindlin-2抗体染色结果，(b)图表示高脂饮食处理小鼠的Kindlin-2抗体染色结果。从图4中可以看出，Kindlin-2在高脂饮食处理的小鼠的胰岛β细胞中表达量明显下降，预示Kindlin-2的减少可能导致糖尿病。
分别将正常人以及二型糖尿病病人(T2D)的胰岛β细胞用Kindlin-2抗体进行IHC染色，并在显微镜下观察，结果如图5所示，图5中(a)图表示正常人的胰岛β细胞Kindlin-2抗体染色结果，(b)图表示T2D患者的胰岛β细胞Kindlin-2抗体染色结果。从图5中可以看出，Kindlin-2在二型糖尿病病人的胰岛β细胞中表达量明显下降。
实施例2
敲除Kindlin-2基因对小鼠体重以及生存率的影响
采用基因敲除技术特异性敲除小鼠的Kindlin-2，其中，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠，RIP-Cre表示正常对照的小鼠。敲除后提取相应组织的总RNA，然后进行实时qPCR定量分析，并以测的的相应组织中总RNA与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的比值作为纵坐标作图，结果如图6，结果显示Kindlin-2RIP小鼠的Kindlin-2的敲除是特异的，仅限于胰岛，其他组织例如肝脏、肾脏、心脏、肺等与正常组无明显差异。
实验组和对照组均从小鼠出生后一周开始量体重，每组12只鼠，每周一次，连续称量8周，作图，结果如图7，动物生长曲线显示Kindlin-2RIP小鼠生长比对照组缓慢。
两个月龄的对照小鼠(RIP-Cre)和Kindlin-2特异敲除小鼠(Kindlin-2RIP)的外观如图8，显示Kindlin-2RIP小鼠的个体明显变小。
实验组和对照组均从小鼠出生后就记录小鼠的死亡时间，每组10只小鼠，作图，结果如图9，显示Kindlin-2RIP小鼠在出生后10周左右有50％的小鼠死亡。
以上结果表明，胰岛β细胞中的Kindlin-2对小鼠的体重以及存活具有重要的影响。
实施例3
敲除Kindlin-2基因对小鼠空腹血糖水平以及血糖耐受性的影响
空腹血糖的测定：分别取两个月龄的两组小鼠饥饿过夜，然后尾巴采血，用血糖试纸测量空腹血糖浓度，每组5只鼠。结果如图10，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠，RIP-Cre表示正常对照的小鼠，结果显示Kindlin-2RIP小鼠的空腹血糖水平显著高于对照组。
糖耐量实验(GTT)：分别取两个月龄的两组小鼠饥饿过夜，然后进行葡萄糖腹腔注射，剂量为2g/kg体重，然后在不同时间点采血，测血糖，每组10只鼠。结果如图11，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠，RIP-Cre表示正常对照的小鼠，结果显示Kindlin-2RIP小鼠的葡萄糖耐受能力显著下降。
以上结果显示胰岛中Kindlin-2的表达量减少或不足对血糖水平有重要的影响。预示可以采用药物靶向Kindlin-2蛋白，从而提高Kindlin-2蛋白的表达量来治疗糖尿病。
实施例4
敲除Kindlin-2基因对小鼠血液胰岛素水平以及胰岛素耐受性的影响
空腹胰岛素测定：分别取两个月龄的两组小鼠饥饿过夜，然后尾巴采血，用ELISA试剂盒测定胰岛素水平，每组10只鼠。结果如图12，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠，RIP-Cre表示正常对照的小鼠，结果显示Kindlin-2RIP小鼠的空腹胰岛素水平明显低于对照组。
胰岛素耐受实验(ITT)：分别取两个月龄的两组小鼠饥饿过夜，然后腹腔注射胰岛素，剂量为1unit/kg体重，然后在不同时间点采血，用血糖试纸测定血糖水平，每组10只鼠。结果如图13，Kindlin-2RIP表示胰岛β细胞Kindlin-2特异敲除的小鼠，RIP-Cre表示正常对照的小鼠，结果显示Kindlin-2基因敲除的小鼠与正常对照组的小鼠的外周组织对胰岛素的敏感性没有明显差别。
以上结果显示胰岛中Kindlin-2的表达量与胰岛素的表达量相互关联，Kindlin-2可作为治疗糖尿病药物的靶点从而协同用于治疗糖尿病。
实施例5
敲除Kindlin-2基因对小鼠β细胞的量、胰岛面积以及胰腺面积的影响
将两个月龄的小鼠胰腺石蜡包埋切片，然后对切片用胰岛素抗体进行免疫组化染色，分别测量敲除Kindlin-2基因后的小鼠以及正常对照组的小鼠的胰岛β细胞面积以及胰腺面积，每组10只小鼠，结果显示如图14～图16显示，图14为两组小鼠的β细胞面积/胰腺面积的统计结果，显示Kindlin-2RIP小鼠的β细胞面积所占的比例显著下降。图15为两组小鼠的β细胞的量，显示Kindlin-2RIP小鼠的β细胞的量显著减少。图16为两组小鼠的胰岛面积/胰腺面积的统计结果，显示敲除Kindlin-2基因的小鼠与正常对照组的小鼠没有明显差别。
以上结果显示敲除Kindlin-2基因对小鼠的胰岛面积/胰腺面积无显著的影响，但对胰岛β细胞面积影响较大，进一步预示Kindlin-2可作为治疗糖尿病药物的特异性的靶点。
实施例6
敲除Kindlin-2基因对小鼠β细胞增值的影响
将两个月龄的小鼠胰腺石蜡包埋切片，用胰岛素抗体和Ki67抗体(用于检测增值细胞)进行免疫荧光染色，并在激光共聚焦显微镜下观察。正常对照组的小鼠以及敲除Kindlin-2基因后的小鼠的结果如图17所示，为了便于区分，图17中的较小的圆圈圈出的显示Ki67抗体标记增值细胞。以上结果显示Kindlin-2RIP小鼠的β细胞的增殖明显减慢，预示可通过药物提高Kindlin-2的表达量来治疗糖尿病。
实施例7
敲除Kindlin-2基因对小鼠胰岛素分泌量的影响
葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)：将两个月龄的小鼠饥饿过夜，分别对两组小鼠的腹腔注射葡萄糖，剂量为2k/kg体重，然后在不同的时间点采血，用ELISA试剂盒检测胰岛素的水平。每组8只鼠，结果图18所示，显示在有葡萄糖刺激时，Kindlin-2RIP小鼠的β细胞分泌胰岛素的能力显著降低。
体外GSIS实验：分别采用2.5mmol/L以及16.7mmol/L的葡萄糖检测两组小鼠的胰岛素分泌量，每组10只鼠，结果如图19所示。体外GSIS实验的结果也显示在高浓度的葡萄糖刺激下，Kindlin-2RIP小鼠的胰岛分泌胰岛素的能力显著下降。
以上结果显示敲除Kindlin-2基因后的小鼠的分泌胰岛素的能力显著下降，预示Kindlin-2可作为治疗糖尿病药物的靶点从而协同用于治疗糖尿病。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物靶向Kindlin-2蛋白。
2.根据权利要求1所述的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物靶向胰腺中的Kindlin-2蛋白。
3.根据权利要求1所述的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够调节Kindlin-2蛋白的表达量。
4.根据权利要求1或3所述的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。
5.根据权利要求1所述的Kindlin-2蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够提高胰腺中的Kindlin-2蛋白的表达量。
6.Kindlin-2蛋白在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物靶向Kindlin-2蛋白。
7.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，所述药物能够提高Kindlin-2蛋白的表达量。
8.一种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，包括Kindlin-2蛋白促进剂以及靶向剂，所述Kindlin-2蛋白促进剂负载于所述靶向剂上，所述靶向剂靶向Kindlin-2蛋白。
9.根据权利要求8所述的治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述靶向剂选自AAV病毒、miRNA和聚合物胶束中的至少一种。
10.Kindlin-2蛋白在制备糖尿病的检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂以Kindlin-2蛋白作为糖尿病的生物标记物。
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