CN104138593A - Chip蛋白在胰腺癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CHIP蛋白在胰腺癌治疗中的用途。特别地，本发明涉及CHIP蛋白以及编码其的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。更特别地，本发明涉及一种CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途，以及一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

Description

CHIP蛋白在胰腺癌治疗中的用途

技术领域

本发明涉及一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。更特别地，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

背景技术

胰腺癌是最难早期发现、恶性程度最高和预后最差的肿瘤之一。美国癌症协会对美国肿瘤发病率及死亡率的统计结果表明，胰腺癌占全部肿瘤死亡原因的第四位，5年生存率在5%以下。其死亡的主要原因是超过50%患者在发现时已处于晚期，肿瘤已包绕血管或发生远处转移，且对传统的放化疗或靶向治疗具有一定耐受性。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。

化疗是目前胰腺癌的主要辅助治疗手段，吉西他滨是治疗局部进展期及转移性胰腺癌的一线药物。但是吉西他滨存在临床应答率低、固有或获得性耐药等问题，导致吉西他滨单药化疗疗效并不理想。随着对胰腺癌细胞生物学行为的加深理解及其细胞分子学机制的掌握，应用分子靶向药物治疗胰腺癌目前已逐渐成为晚期胰腺癌治疗的研究重点。胰腺癌细胞常伴表皮生长因子受体(EGFR，Her1)及其内源配体的高表达，在胰腺癌的形成、进展及转移中具有重要作用。因此，目前针对EGFR的靶向治疗在晚期胰腺癌的治疗中得以重视。

EGFR为I型受体酪氨酸激酶ErbB家族成员之一，其配体包括EGF、TGF-α等。EGFR与配体结合后，激活受体中的酪氨酸激酶（TK）活性，导致其酪氨酸激酶残基发生磷酸化，暴露酪氨酸激酶作用靶蛋白的结合位点，进而激活下游的多条信号通路，最终影响细胞的增殖和分化。研究表明，EGFR在胰腺癌中高表达，与基因拷贝数的增加及其配体的高表达相关。同时EGFR在胰腺癌中也高度保守，其酪氨酸激酶区域不易发生突变，这些结果为靶向治疗的可行性提供了研究基础。目前用于胰腺癌的靶向药物包括单克隆抗体西妥昔单抗，小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼等。2007年5月NCIC研究报告第一次证实厄洛替尼对晚期胰腺癌有确切疗效，研究发现厄洛替尼联合吉西他滨较吉西他滨单药化疗使病人的死亡风险下降了18%，中位生存期从5.91个月延长到6.37个月，1年存活率从17%上升到23%。该项研究证实了厄洛替尼联合吉西他滨作为一线药物对晚期胰腺癌的疗效。但是，与其他肿瘤一样，针对EGFR的多种靶向药物在胰腺癌患者中的总体应答率仍不高，其机制仍不清楚。如何加强针对EGFR的靶向药物的疗效，成为值得深入研究的问题。

研究发现，在不同的恶性肿瘤中EGFR的表达量并不相同。在乳腺癌、宫颈癌和胰腺癌中，EGFR通常是高表达的，但在非小细胞肺癌中EGFR表达量却较低甚至不表达。因此，针对EGFR的调控机制的探索是目前研究的重点之一。EGFR基因CpG岛甲基化的改变，microRNA对EGFR转录水平的调控，以及转录后修饰对EGFR蛋白活性的影响成为EGFR发挥其稳定性的主要原因。转录后修饰主要包括蛋白的磷酸化、乙酰化、SUMO和泛素化等，其中泛素-蛋白酶体系统（UPS）是蛋白活性和结构修饰及异常蛋白清除的主要途径。研究表明，泛素E3连接酶CbI蛋白是EGFR蛋白发生降解的主要限速酶，当EGFR羧基末端酪氨酸残基(Tyr)1045位点磷酸化激活后即与CbI蛋白结合，后者通过募集泛素激活酶(E1)和泛素结合酶(E2)进而将泛素小分子传递到EGFR蛋白表面并与之结合，再通过蛋白酶体系统使得EGFR发生降解。当EGFR的Tyr1045位点发生突变的时候，EGFR即无法与Cb1蛋白结合导致受体无法正常的泛素化，从而继续接受其配体的刺激而促进下游肿瘤相关信号通路的持续激活。值得注意的是，CbI蛋白介导的受体泛素化在EGFR内化过程中并不起主要作用，CbI蛋白突变能够阻止EGFR的下调，但并不影响EGF-EGFR复合物的内化。这一结果支持Cb1介导的泛素化在内化的初始阶段并不起重要作用，而是作用于比较晚的阶段，因此，EGFR泛素化的调控仍需要进一步的研究。

C末端Hsc70反应蛋白（命名为CHIP）是一个种属间高度保守的胞浆蛋白，在平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌和大脑中高度表达。它含有三个功能区，N末端的TPR功能区、C-末端的U-盒子功能区和中间的正负电荷富集区。CHIP作为一个陪伴蛋白（chaperone）即可通过TPR基序（motif）与热休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用，辅助新生蛋白折叠，形成具有正常结构和功能的蛋白，抑制变性蛋白的聚集；又可通过U-盒子功能区作为E3连接酶，促进蛋白底物的泛素化降解。目前已经发现CHIP在多种肿瘤中发挥重要的作用。可与CHIP结合并发生降解的蛋白包括突变的p53，雌激素受体，erbB2，SMAD3，HIF-1，SRC-3，NF-κB，c-Myc，以及磷酸化的AKT等，这些底物都与肿瘤的增殖、侵袭或转移均密切相关。另一方面，CHIP在乳腺癌、胃癌及脑神经胶质瘤中的表达水平要明显低于癌旁的正常组织，这些结果均提示CHIP在多种肿瘤中发挥抑癌的作用，但是目前关于CHIP蛋白与胰腺癌的关系国内外均没有报道。

本发明来源于一个惊人的方法，即，本发明人发现CHIP蛋白的过度表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，而沉默CHIP蛋白胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显增强。

发明内容

通过慢病毒载体将CHIP的microRNA(作为RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3、SW1990中，建立稳定沉默或稳定过表达CHIP的胰腺癌细胞株，本发明人证实CHIP蛋白的过度表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，而沉默CHIP蛋白胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显增强。进一步地，本发明人证实了CHIP蛋白可以增强抗肿瘤剂厄洛替尼诱导的细胞凋亡，沉默CHIP蛋白后厄洛替尼诱导细胞凋亡能力明显减弱。

因而，在第一方面，本发明提供了一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

进一步地，本发明涉及所述CHIP蛋白在制备用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。

进一步地，本发明涉及CHIP蛋白在制备增强厄洛替尼诱导的癌细胞凋亡中的用途。

在另一方面，本发明提供了一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。进一步地，所述编码CHIP蛋白的DNA序列如SEQ IDNO：11所示。

进一步地，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。

进一步地，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强厄洛替尼诱导的癌细胞凋亡中的用途。

附图说明

图1显示为pcDNA6.2载体的结构。

图2显示为pcDNA3.1（+）载体结构。

图3显示为pLenti6.2质粒结构。

图4分别显示为pReceiver-M01质粒结构（图4A）和pReceiver-M011质粒结构（图4B）。

图5显示了九株胰腺癌细胞CHIP表达水平的差异。

图6显示了mRNA水平和蛋白水平检测Bxpc-3细胞转染后CHIP的沉默情况。上图为RT-PCR检测CHIP mRNA表达水平。其中1，2，3，4分别代表四个不同的干扰序列，下图为Western blot法检测CHIP蛋白表达水平，其中2-1，2-2代表第二个干扰序列第一次和第二次转染细胞对CHIP表达的影响。

图7显示了mRNA水平和蛋白水平检测Bxpc-3细胞转染后CHIP的过表达情况。CHIP^OE代表CHIP过表达组。

图8显示了三株细胞稳定沉默或过表达CHIP蛋白。miR代表采用第二个干扰序列包装的病毒在六孔板中的2个孔中进行感染细胞后获得的两个稳定沉默细胞株。CHIP^OE代表过表达CHIP蛋白，后同。

图9显示了Bxpc-3细胞下调CHIP表达后其他蛋白表达情况。

图10显示了沉默CHIP蛋白表达前后胰腺癌细胞株增殖情况。miR1，miR2分别代表沉默CHIP蛋白的细胞亚克隆，对照代表沉默组的对照，以下同。

图11显示了过表达CHIP蛋白前后胰腺癌细胞株增殖情况。CHIP^OE代表过表达CHIP蛋白的细胞组，对照代表过表达组的对照，以下同。

图12显示了沉默CHIP蛋白表达前后胰腺癌细胞株处于S期细胞比率。*代表p<0.05，**代表p<0.01，以下同。

图13显示了过表达CHIP蛋白前后胰腺癌细胞株处于S期细胞比率。

图14显示了厄洛替尼诱导不同细胞的抑制率。

图15显示了CHIP蛋白沉默前后对厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响。

图16显示了过表达CHIP蛋白前后对厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响。

图17显示了CHIP蛋白沉默前后对厄洛替尼诱导细胞产生活性半胱天冬酶3/7的影响。

图18显示了CHIP蛋白过表达前后对厄洛替尼诱导细胞产生活性半胱天冬酶3/7的影响。

图19显示了CHIP沉默前后对胰腺癌细胞侵袭和转移的影响。

图20显示了CHIP过表达前后对胰腺癌细胞侵袭和转移的影响。

图21显示了三株胰腺癌细胞沉默或过表达CHIP后EGFR的改变。miR1和miR2分别代表采用CHIP的microRNA序列沉默CHIP，CHIP^OE代表过表达CHIP。

图22显示了过表达或沉默CHIP后p-EGFR的表达水平改变。

图23显示了稳定沉默CHIP蛋白对三株胰腺癌细胞PI3K/AKT/mTOR通路的影响。p-AKT代表磷酸化AKT蛋白，t-AKT代表总的AKT蛋白，后同。

图24显示了稳定沉默CHIP蛋白对三株胰腺癌细胞Src/FAK通路的影响。

图25显示了稳定沉默CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤体积及重量检测(**代表p<0.01)。

图26显示了稳定过表达CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤体积及重量检测(**代表p<0.01)。

图27显示了厄洛替尼干预稳定沉默CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤的体积及重量检测(*代表p<0.05)。

图28显示了厄洛替尼干预稳定过表达CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤的体积及重量检测(**代表p<0.01)。

图29显示了沉默CHIP组及其对照的免疫组化研究和Ki67表达水平（×400，*代表p<0.05）。

图30显示了过表达CHIP组及其对照的免疫组化研究和Ki67表达水平（×400，*代表p<0.05）。

图31显示了同一组织切片不同蛋白的表达差异检测（×400）。

图32显示了厄洛替尼诱导稳定沉默CHIP组和对照组切断的半胱天冬酶-3表达水平检测（×400）。

图33显示了厄洛替尼诱导稳定过表达CHIP组和对照组切断的半胱天冬酶-3表达检测（×400）。

图34显示了脾脏注射稳定CHIP沉默和对照组细胞后肝转移情况。

图35显示了脾脏注射稳定CHIP过表达和对照组细胞后肝转移情况。

具体实施方式

本发明首先通过构建和CHIP及EGFR相关质粒进行胰腺癌细胞株的转染，观察CHIP表达水平与胰腺癌细胞株的增殖、侵袭、转移的相关性研究，了解CHIP水平的改变是否影响胰腺癌细胞的生物学行为；其次观察胰腺癌细胞株中CHIP与其靶蛋白EGFR的相关性，了解其磷酸化位点与CHIP的相互作用，并观察CHIP对肿瘤相关信号通路激活的影响；通过小鼠移植瘤模型进一步观察小鼠体内肿瘤的生长和转移情况，并观察CHIP是否对靶向药物诱导的组织或细胞凋亡的促进作用；最后通过收集组织和血标本和病例资料，观察CHIP在肿瘤组织和血中的表达水平，观察其对患者预后的影响，为寻找新的早期诊断和治疗靶点，改善胰腺癌治疗效果提供一个新的思路。

本发明通过慢病毒载体将CHIP的microRNA(作为RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3、SW1990中，建立稳定沉默或稳定过表达CHIP的胰腺癌细胞株。

本发明通过CCK-8法观察CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞增殖水平的影响。

本发明通过流式细胞术检测CHIP沉默或过表达对靶向药物厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响；通过Transwell小室检测CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。

本发明通过免疫共沉淀技术寻找CHIP的靶蛋白，通过时间依赖梯度观察CHIP对靶蛋白表达水平的影响；通过蛋白电泳和Western blot检测CHIP蛋白对肿瘤相关信号通路中关键蛋白表达水平的影响。

本发明通过建立小鼠皮下移植瘤模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对小鼠成瘤的影响，观察CHIP蛋白沉默或过表达对厄洛替尼诱导肿瘤组织凋亡的影响；通过胰腺癌细胞脾脏注射肝转移模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对肿瘤细胞转移能力的影响；通过免疫组化观察肿瘤组织中CHIP蛋白和靶蛋白表达水平的差异。

本发明通过免疫组化研究明确CHIP蛋白在胰腺癌患者组织中的表达水平及其对患者预后的影响，通过ELISA法检测人CHIP蛋白在肿瘤患者血清中的表达水平，评估其作为鉴别诊断及判断预后的价值。

本发明中术语的“细胞凋亡”是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。细胞凋亡首先出现的是细胞体积缩小、连接消失，然后是细胞质密度增加，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为多个凋亡小体。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。由于本实验所采用的胰腺癌细胞在转染质粒或病毒以后均表达绿色荧光蛋白，因此常用的FITC染料作为荧光探针可和绿色荧光蛋白互相产生干扰；因此本实验改用PE的Annexin V作为荧光探针，可以有效避开绿色荧光波长从而检测到早期凋亡事件。7-AAD是一种核酸染料，在合适的膜通透性情况下，7-AAD可以与细胞核的核酸结合，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，7-AAD可与Annexin V-PE联合使用。

本文中的半胱天冬酶是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，它们在凋亡中发挥重要作用。一般来说，哺乳动物的半胱天冬酶可根据功能分为三类类：细胞因子激活(包括半胱天冬酶s1、4、5、13)，凋亡起始(包括半胱天冬酶s2、8、9、10)和凋亡执行(包括半胱天冬酶s3、6、7)。其中半胱天冬酶-3/7的被剪切形成激活体则代表凋亡已经不可逆转。本实验采用的半胱天冬酶-3/7凋亡检测方法是一种均质发光检测方法，半胱天冬酶-3/7在细胞凋亡过程中如果被激活形成剪切体后，即可剪切试剂盒中的底物Z-DEVD-氨基萤光素，该底物本身并不发光，但是如果被剪切后释放出氨基萤光素，即可产生由重组萤光素酶生成的辉光型发光信号(Luminescence)。该信号可以被辉光接收仪器检测到，其发光强度与存在的半胱天冬酶-3/7活性成正比，通过检测辉光强度即可判断半胱天冬酶-3/7激活成分的含量。

本发明中涉及的细胞侵袭和转移检测是应用Transwell小室，其是一种可放置在孔板中的小室，其小室底部底为聚碳酸酯膜，进行侵袭转移实验的膜为含8um小孔的膜，小室内称上室，培养皿内称下室，通常下室内放入含趋化因子或高浓度营养成分的培养基，而将细胞接种在上室内。由于聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，肿瘤细胞会向营养成分高的下室移动。对于肿瘤侵袭实验需要预先在小室内膜铺上一层基质胶以模仿细胞外基质，肿瘤细胞需要把基质消化后才可以从低营养培养基跑到高营养培养基中，最后通过检测小室膜的外侧面细胞数量即可明确细胞的侵袭和转移能力。

文中的BCA(Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理是在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，而且不易受去垢剂的影响。

本发明涉及的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，蛋白质同SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子大小，因此可以根据蛋白分子量大小将不同的蛋白拉出不同的梯度进而检测。

Western blot即蛋白质印迹。被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。发光值得高低反映蛋白浓度的高低水平。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入结合于Agarose珠上的Protein A或G，抗体的Fc片段即和protein A/G上，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯凝胶电泳，复合物又被分开。然后经Western blot检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。应该注意的是，细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，一般多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)，同时应提高相应的盐浓度以去除较多的非特异杂带。

荧光免疫是根据抗原抗体反应，先将已知抗体标记荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原。在细胞或组织中形成抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而确定抗原的性质，定位，以及利用定量技术测定抗原在细胞或组织中的含量。

ELISA检测人血清中的CHIP表达水平是结合在固相载体（如96孔板）表面的抗体仍保持其免疫活性，受检标本中的抗原可以与固相载体表面的抗体发生抗原抗体反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体符合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗体，使之也通过反应而结合在固体载体上。此时固相上的酶含量即与标本中受监测物质的量呈正比，通过酶催化的底物颜色即可确定标本中抗原的含量。

实施例1：质粒构建和稳定转染细胞株的建立

本实施例涉及构建实验所需质粒，包括CHIP沉默所需microRNA质粒、CHIP过表达质粒（CHIP^OE）、CHIP的截段体质粒（U-box质粒和TPR质粒）、构建CHIP沉默和过表达的慢病毒载体，以及构建EGFR质粒；将上述质粒转染或感染到胰腺癌细胞中建立瞬时或稳定表达/沉默细胞株，并对文献报道的一些和CHIP可能的靶蛋白进行初步的筛选和检测。

1.1实验材料

细胞株：本实验时所用细胞株为人胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3和SW1990。均由德国海德堡大学Freiss.H教授惠赠，本实验室液氮保存。

实验所用载体

microRNA干扰质粒载体

建立CHIP的干扰质粒所需载体使用的是microRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中(Invitrogen，Catalog no.K4936-00，如图1)，该载体含壮观霉素基因，质粒扩增过程中可选壮观霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳转细胞的时候，可使用杀稻瘟菌素作为筛选抗生素。插入序列位于BamHⅠ和BglⅡ两个酶切位点之间。

CHIP过表达或截段体所需质粒载体

构建CHIP过表达质粒所需载体使用的是pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen，V79020，图2)。该载体具有氨苄抗性，质粒扩增时可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳定细胞株的时候可用新霉素作为筛选抗生素。插入序列位于BamH Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点之间。

慢病毒所需载体

构建慢病毒所需载体为pLenti6.2/V5-DEST（Invitrogen，编号V36820，图3）。该载体具有氨苄抗性，质粒扩增时可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳定细胞株的时候可用杀稻瘟菌素作为筛选抗生素。插入序列位于Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点之间。

含标签载体

构建含Flag标签的CHIP或构建含His标签的CHIP质粒所需载体使用的是pReceiver-M01/M11载体(GeneCopoeia，V79020，图4)。该载体具有氨苄抗性，质粒扩增时可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳定细胞株的时候可用新霉素作为筛选抗生素。插入序列位于BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间。(图4)

插入序列基因片段

CHIP的microRNA寡聚单链DNA序列，共4条作为可选microRNA

阴性对照

引物序列由上海生工合成，各序列前边按所需要的不同酶切位点加入相应的酶切片段和保护碱基。

EGFR基因序列及其引物

EGFR序列ORF框为

ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCG

GGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAG

ATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCT

ATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGC

CCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAA

ATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGA

GAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAG

AGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCAC

CTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAA

CTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAG

TGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCC

GCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGT

ACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGT

AATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGA

AGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTG

GTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCA

GTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCC

ACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGA

AAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTC

AGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTG

ATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTG

TTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGG

CCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTG

CCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGT

TTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCA

CAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACC

TGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTG

CCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGG

GCCTAAAATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGG

GATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGA

GGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGG

AAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGG

ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA

AGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCC

TGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGA

CTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAA

GGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCGGCCAGGAACGTACTGGTGA

AAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAA

TACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTCTACACAGAATCTA

TACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCC

ATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACC

CATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAA

GTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGG

GGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAG

ACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCA

CGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATA

GAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACA

GGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGAATACATAAACCAGTCCGTT

CCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATCAGCCTCTGAACCCCGCGCCCAGC

AGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGCAGTGGGCAACCCCGAGTATCTCAACACTGTCCA

GCCCACCTGTGTCAACAGCACATTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAAAGGCAGCCACCAAATTA

GCCTGGACAACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAAATGGCATCTTTAAGG

GCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCAGTGAATTTATTGGAGCATAG

1.2实验方法

（1）、CHIP相关microRNA的构建和提取

根据本领域的常规操作以及相关试剂盒的说明书，首先将pcDNA6.2质粒转化大肠杆菌Ecoli DH5α感受态、进行pcDNA6.2质粒小提、采用Promega公司的BamHⅠ和BglⅡ对pcDNA6.2质粒双酶切、回收pcDNA6.2质粒的酶切产物、对寡聚DNA退火、连接DNA片段、将连接产物转化至大肠杆菌Ecoli DH5α感受态中、测定DNA的序列、使用Wizard Plus Midipreps DNA Purification System(Promega，#A7640)配合Laboratory Vacuum Manifold，20samplecapacity(Promega，#A7231)进行质粒的大量提取。

（2）、CHIP/EGFR过表达质粒的构建和扩增（以CHIP基因为例）

如上所述对pcDNA3.1的质粒进行转化和扩增，细菌筛选和扩增所用的抗生素为氨苄青霉素。于BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切反应体系和回收方法同上。培养293T细胞:待六孔板内293T细胞培养至70%-80%至对数生长期，弃掉培养基，用PBS清洗两次后待用。使用Trizol，提取总细胞RNA，并采用Promega公司的逆转录试剂盒，将总RNA逆转录为cDNA，使用PCR扩增目的片段，将纯化的目的基因CHIP和质粒pcDNA3.1用BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶双酶切。如上所述，进行DNA片段的连接、完成DNA片段转化至细菌，并进行ＤＮＡ测序。

（3）、慢病毒的构建和滴度测定

慢病毒载体与目的基因的构建

Ａ、将实验步骤第一部分获得的pcDNA3.1中的质粒和Plent6.2质粒进行双酶切，酶切位点为NheI和BamHI。

对于pcDNA6.2质粒：37℃酶切2小时后凝胶电泳回收约0.9Kb目的条带；

对于Plenti6.2质粒：37℃酶切2小时后凝胶电泳回收约10Kb目的条带

Ｂ、连接两个目的片段并测序。

慢病毒的包装

Ａ、取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5%CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；

Ｂ、取9ug包装质粒混合物（含pLP1、pLP2、pLP/VSVG三个质粒，Invitrogen）和3ug慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM（经37℃预热）中，轻轻混匀。取36ul lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5分钟。轻轻混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20分钟；

Ｃ、将3ml质粒脂质体复合物小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5%CO2的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10%FBS。48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10分钟，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤。

Ｄ、将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于100ul DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。

慢病毒滴度测定

Ａ、将HEK293细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含8ug/mlpolybrene和2%FBS的细胞培养基；

Ｂ、第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37度培养过夜，感染时细胞长至30－50％的融合密度；

小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37度的细胞培养箱中过夜培养。第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；

第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

细胞顺时转染方法

将处于对数生长期的Bxpc-3细胞消化并计数，按每孔6×105个细胞接种于6孔板中，加完全培养基并置于37℃5%CO2孵箱中培养20小时，细胞汇合度达到70%左右，去掉完全培养基，改为无血清培养基1.5ml饥饿细胞2小时；

按下表进行取样，放置5分钟后混合，室温孵育20分钟；

六孔板每孔加入500ul上述混匀后悬液，使每孔总体积为2ml，转染5小时以后去掉培养基，用PBS洗涤两次后加入完全培养基孵育24-48小时。

慢病毒转染建立稳定沉默或过表达细胞株

将处于对数生长期的Panc-1、Bxpc-3和SW1990分别铺96孔板，每个孔5000个细胞，待细胞贴壁后将杀稻瘟菌素按1ug/ml直到10ug/ml稀释10个不同的浓度加入到96孔板中，每列为一个浓度梯度，每2天换液一次，观察三种不同细胞死亡情况。待第7天找到杀死所有细胞的最小杀稻瘟菌素的浓度即为稳定筛选细胞所需浓度。

将对数生长期的Panc-1、Bxpc-3和SW1990细胞消化计数，按一定比例铺到六孔板中，汇合度达70%-80%，换成不含抗生素的完全培养基；

将慢病毒自-80℃取出冰上融化，根据文献报道的MOI值将病毒加入到培养基中，同时培养基中加入8ug/ml的Polybrene以提高病毒感染效率，感染8-12小时以后更换完全培养基。

转染3天以后通过荧光显微镜观察感染效率。根据不同的细胞对杀稻瘟菌素的反应计量加入相应浓度的筛选药物，每2-3天换液，待细胞由集落逐渐汇合后转入25cm培养皿中加入药物继续筛选，同时进行Western blot检测沉默或过表达效率。

1.3实验结果

通过凝胶电泳和测序分析，证实了成功建立了质粒pcDNA6.1与CHIP的microRNA的重组、质粒pcDNA3.1与CHIP基因的重组、质粒pcDNA3.1与CHIP截段体基因的重组和EGFR重组质粒的构建。详细的电泳和测序结果未表明。

（1）不同胰腺癌细胞株中CHIP表达水平的差异

提取实验室保存的九株胰腺癌细胞株的蛋白并检测CHIP表达水平（图5）。结果发现，Aspc-3、Colo-357细胞表达CHIP水平相对较高，MiaPaca-2和T3M4细胞表达CHIP水平较低，其余细胞表达水平中等。因此，本实验采用Bxpc-3细胞、Panc-1细胞和SW1990三株细胞作为CHIP过表达或沉默调控所研究细胞。

（2）干扰序列对胰腺癌细胞Bxpc-3中CHIP表达水平的影响

将前述已经构建好的含干扰CHIP基因序列共四个，分别转染到胰腺癌细胞Bxpc-3中，转染24小时以后提取Bxcp-3细胞的总RNA，逆转录后合成cDNA，通过CHIP的正反引物检测CHIP在胰腺癌细胞中的mRNA表达水平。结果发现，含干扰CHIP基因的第二个序列沉默CHIP基因的效果较好。以此序列为基础，进一步检测第二个干扰序列对胰腺癌细胞Bxpc-3顺时转染后的蛋白表达水平。结果发现，第二个干扰序列可以有效沉默CHIP基因。（图6）

（3）CHIP表达质粒对胰腺癌细胞Bxpc-3中CHIP表达水平的影响

将前述构建好的含CHIP基因的质粒转染Bxpc-3细胞中，转染24小时后检测细胞内CHIP的mRNA表达水平和蛋白表达水平。结果发现，CHIP质粒转染以后，其mRNA水平表达水平明显升高，而蛋白水平表达也明显升高。提示CHIP过表达质粒构建成功。（图7）。

（4）慢病毒的构建和建立稳定转染细胞株

本部分根据前述结果，将第二个干扰序列自pcDNA6.1切下转入pLenti6.2质粒中，以及将CHIP基因序列自pcDNA3.0转至pLenti6.2质粒中，以准备包装病毒。电泳以及测序结果表明CHIP基因序列正确地转至pLenti6.2质粒（结果未表明）。

Ａ、慢病毒的包装和感染293T细胞效果

将慢病毒重组质粒和包装质粒共转染293T细胞，24小时后观察转染效果。

Ｂ、慢病毒浓度梯度计算：96孔板按10倍系数进行稀释，稀释到第6号孔观察到表达绿色荧光的细胞分别为8个和10个，则病毒的滴度为：

第六孔（8+10）/2=9    9TU/（2*10-8）ml=4.5*108TU/ml

慢病毒液用DMEM培养液稀释至1*10E8TU/ml，按照每管100ul分装十管，保存于-80度。

Ｃ、慢病毒感染胰腺癌细胞株Bxpc-3、Panc-1和SW1990的感染效率

Panc-1细胞，Bxpc-3细胞，SW1990细胞分别转染慢病毒后，48小时荧光检测转染效率，发现其转染效率在80-95%左右。

Ｄ、检测杀稻瘟菌素对不同细胞的筛选浓度。

以96孔板每一纵列为一个浓度梯度，按不同浓度梯度检测细胞生存情况，如下表所示

Ｅ、三株细胞稳定转染的蛋白表达水平检测

三株胰腺癌细胞Panc-1、Bxpc-3、SW1990分别感染沉默和过表达慢病毒，72小时后加用杀稻瘟菌素进行筛选，每2-3天换液一次，待7-10天细胞重新长满后用Western blot检测细胞CHIP蛋白表达水平（图8）。结果提示，三株细胞已经分别能够稳定沉默CHIP蛋白的表达或稳定过表达CHIP蛋白。

（5）初步探索胰腺癌细胞Bxpc-3中CHIP干扰后对特定蛋白的影响：

根据既往的文献报道，我们对可能和CHIP蛋白相互作用的一些蛋白的表达水平在胰腺癌Bxpc-3中进行了检测。结果发现，很多在其他的细胞中可能受到CHIP调控的蛋白，在胰腺癌细胞中并未受到CHIP表达的影响。提示CHIP蛋白可能通过其他的一些方式对胰腺癌细胞发挥作用（图9）。

1.4实验结论

（1）成功构建CHIP的沉默序列和过表达重组质粒，成功构建CHIP的两个截段体重组质粒，成功构建EGFR过表达重组质粒；

（2）成功构建出诱导CHIP沉默和过表达的慢病毒载体；

（3）成功构建出Panc-1、Bxpc-3和SW1990三株细胞稳定沉默或过表达CHIP的细胞株；

（4）胰腺癌中CHIP与文献中已报道在其他肿瘤发现的几个相关蛋白并无联系。

实施例2：CHIP对胰腺癌细胞功能的影响

本实施例主要研究CHIP蛋白稳定沉默或过表达以后对三株胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3和SW1990的肿瘤学特征产生的影响，包括肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力；另外，还对厄洛替尼诱导的细胞凋亡进行流式分析，观测CHIP蛋白沉默或过表达对其诱导的细胞凋亡及半胱天冬酶-3活性的影响，从而从功能上观察CHIP是否对胰腺癌细胞产生影响。

2.1实验材料

人胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3，SW1990由德国海德堡大学Freiss.H教授惠赠，本实验室液氮罐保存。向DMEM/高糖培养基或RPMI-1640培养基中加入FBS，使FBS终浓度为10%，不加抗生素。4℃保存。CCK-8法检测所需仪器及材料是美国Molecular Devices公司生产的Spectra Max190酶标仪以及日本同仁化学研究所的CCK-8检测试剂盒。细胞周期检测所需仪器及材料为：流式细胞仪FACS Aria（美国BD公司）、PI、RNA酶、TritonX-100（美国Sigma-Aldrich公司）。细胞凋亡检测所需仪器及材料为Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）、Annexin V-PE和7-AAD试剂盒（美国Beckman Coulter公司）、厄洛替尼（瑞士罗氏公司）。半胱天冬酶-3活性检测所需仪器及材料为Centro LB960检测仪（德国Berthold公司）、半胱天冬酶-Glo3/7分析试剂盒（美国普洛麦格生物技术有限公司）。细胞侵袭和转移检测所需仪器及材料为Leica DFC倒置显微镜（德国莱卡公司）、Transwell小室（8um）（Corning）、ECM（美国Sigma-Aldrich公司）、苏木素、伊红染液（北京中杉金桥生物技术有限公司）。特殊材料的配置方法为：厄洛替尼：采用碾磨杵将150mg/片的厄洛替尼片剂碾碎，碾碎后加入DMSO进行溶解，使得最终浓度为1mM作为储液，用0.2um的滤器过滤后备用。

2.2实验方法

（1）、人胰腺癌细胞株的培养

细胞复苏

从液氮罐中分别取出冻存的细胞株（Panc-1，Bxpc-3，SW1990），迅速置于37℃水浴中，振摇使之快速融化后，将冻存管内容物全部移入15ml离心管中，缓慢加入适量相应的完全培养基（各细胞株所用培养基见下表）5ml，轻轻吹打使细胞悬浮，1000rpm4℃离心5分钟，弃上清。再次加入5ml相应的完全培养基，反复吹打使细胞悬浮后，将其移入T25细胞培养瓶，置于37℃，5%CO2孵箱内。次日换液，根据细胞生长速度及密度适时传代。

细胞传代

当细胞培养瓶中细胞铺至70-80%时，进行细胞传代。弃去培养瓶中的培养基，用PBS轻柔冲洗2次。加入适量（T25培养瓶约2ml，T75培养瓶约3ml）的0.25%1×胰蛋白酶消化贴壁细胞。于光学显微镜下动态观察，待细胞胞体变圆，细胞间隙增大时，加入适量完全培养基（T25培养瓶约5ml，T75培养瓶约8ml）或FBS（T25培养瓶约0.5ml，T75培养瓶约0.8ml）终止消化，并用吸管轻轻吹打，使细胞脱离瓶底后，将培养瓶内的细胞悬液移入15ml离心管中，1200rpm离心5分钟，弃上清。在离心管中加入适量的完全培养基，并充分吹打使细胞重悬，按照1:2-1:3接种于新的培养瓶中，并补加相应的完全培养基（T25培养瓶终体积5ml，T75培养瓶终体积15ml）。

细胞冻存

当细胞生长状态良好，处于对数生长期，细胞汇合度达到70-80%时可冻存细胞。0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清，加入适量完全培养基重悬细胞，计数＞2×106/ml，台盼蓝染色观察存活率＞95%时可冻存细胞。于1.5ml冻存管内先后加入细胞悬液和细胞冻存液（90%FBS:10%DMSO）各0.5ml，充分混匀后旋紧瓶盖，标记冻存细胞种类、数目（＞1×106/支）、传代次数和冻存日期，逐渐降温后转入-80℃冰箱内，24小时后转入液氮容器中长期保存。

细胞计数

充分吹打混匀待计数的细胞悬液，分别取70μl加入2个灭菌的1.5ml离心管中。其中之一用NucleoCassette计数板抽取细胞悬液后放入NucleoCounter仪器中计数，得到待测样品中死细胞数（个/ml）；另一份加入70μl A液（Lysis Buffer，chemometec）和70μl B液（Stabilizing Buffer，chemoetec），充分混匀后，再用NucleoCassette计数板抽取细胞悬液后以NucleoCounter计数，得到待测样品中活细胞及死细胞总数（个/ml）。

按以下公式计算：活细胞数（个/ml）=3×总细胞数-死细胞数

（2）胰腺癌细胞增殖情况的检测

细胞生长曲线是了解细胞生物学特性的基本参数之一，也是判定细胞活力的重要指标。一般贴壁细胞在传代贴壁后经过长短不同的潜伏期，进入大量分裂的对数生长期；在细胞生长至饱和密度后即停止生长，进入平台期，此后开始逐渐退化衰亡。本实验通过CCK-8法，绘制胰腺癌生长曲线。

实验原理

CCK-8试剂中含有WST–8，其化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

工作曲线的测定

取对数生长期细胞，如前方法消化离心细胞，培养基重悬后分装至两个离心管，调整细胞浓度为320，000个/ml和200，000个/ml。给予培养基梯度稀释细胞浓度至160，000个/ml、80，000个/ml、40，000个/ml、20，000个/ml、10，000个/ml、5，000个/ml以及10，000个/ml、50，000个/ml、25，000个/ml。各取100ul接种到96孔板中，每个浓度设置6个复孔，同时设置只加培养基的空白对照组。在37℃，5%CO2孵箱中培养24小时，取出后每孔加入10ul的CCK-8试剂，培养箱中孵育2小时。酶标仪用450nm波长测定吸光度，各孔吸光度减去空白对照组即为不同细胞浓度对应吸光度，确定吸光度和细胞数目的关系，绘制CCK-8法的工作曲线。

实验步骤

A.培养Panc-1、Bxpc-3及SW1990细胞对照组及实验组培养至对数生长期，细胞汇合度达70-80%。0.25%胰酶消化、收集细胞，离心、重悬、计数，了解细胞存活率。

B.用完全培养基将细胞悬液稀释至104/ml，103细胞/孔接种于96孔培养板中，培养基总量100μl，每个时间点设置6个重复孔，100μl/孔纯培养基作为空白对照。

C.将已接种细胞于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内连续培养1-6天，每24小时进行CCK-8检测一次。弃去陈旧培养基，PBS漂洗一次，更换新鲜培养基，将CCK-8试剂每孔加入10μl，37℃孵育3小时后，用酶标仪测定450nm处吸光度（OD450nm），OD630nm作为参考。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。计算细胞的倍增时间。

CCK-8检测厄洛替尼靶向治疗敏感性

A.培养PANC-1、Bxpc-3及SW1990细胞对照组及实验组培养至对数生长期，细胞汇合度达70-80%。0.25%胰酶消化、收集细胞，离心、重悬、计数，调整细胞浓度为1×105/ml，取100ul接种96孔板孵育24小时。

B.吸出培养基，加入不同浓度的厄洛替尼，每列6孔为一个浓度梯度，逐渐递增。同时设置对照转染组，无药物作用的细胞对照组和只加培养基的空白对照组。药物作用24小时以后，每孔加入10ul CCK-8试剂，37℃，5%CO2作用2小时，在酶标仪上450nm波长测定其吸光度，630nm作为参比波长，计算细胞抑制率和IC50。

改良寇式法计算IC50公式：lgIC50=Xm-I×(P-(3-Pm-Pn)/4)，其中

Xm：lg最大剂量

I：lg（最大剂量/相临剂量）

P：各剂量药物抑制率之和

Pm：最大抑制率

Pn：最小抑制率

抑制率=1-存活率

细胞周期检测

实验原理

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期和分裂期两个阶段。间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。分裂期为M期。PI即碘化丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA酶将细胞内RNA去掉后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。由于PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞)，因此在标本制备时，必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性，才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。

实验步骤

A、培养Panc-1、Bxpc-3及SW1990细胞对照组及实验组培养至对数生长期，细胞汇合度达70-80%。0.25%胰酶消化、收集细胞，离心、重悬、计数。

B、将细胞悬液调整为1×105/ml共1ml，收集于1.5ml离心管中，1000转5分钟离心，弃上清后沉淀用1mlPBS重悬，收集于1.5mlEP管中，再次离心，沉淀再次用PBS重悬后，用300ulPBS彻底重悬，向离心管中逐滴加入-20℃预冷无水乙醇700ul，混匀后4℃过夜固定。

C、第二天采用1000rpm离心5分钟，去除上清液以去除乙醇，PBS洗涤2次，1000rmp离心并去上清后，将沉淀重新悬浮于500ul的PBS，加入2ulRNaseA(10mg/ml)以去除内源性RNA，0.2%的Triton X-100使细胞膜通透性增加，室温放置45分钟后再加入PI（1mg/ml），避光反应1分钟。

D、采用流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波为488nm，发射光波长630nm，产生红色荧光，通过作图分析结果。

E、以上实验每组细胞重复3次，取平均值和标准差进行统计分析。

细胞凋亡检测

实验原理

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。细胞凋亡首先出现的是细胞体积缩小、连接消失，然后是细胞质密度增加，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为多个凋亡小体。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。由于本实验所采用的胰腺癌细胞在转染质粒或病毒以后均表达绿色荧光蛋白，因此常用的FITC染料作为荧光探针可和绿色荧光蛋白互相产生干扰；因此本实验改用PE的Annexin V作为荧光探针，可以有效避开绿色荧光波长从而检测到早期凋亡事件。7-AAD是一种核酸染料，在合适的膜通透性情况下，7-AAD可以与细胞核的核酸结合，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，7-AAD可与Annexin V-PE联合使用。

实验步骤

A、培养Panc-1、Bxpc-3及SW1990细胞对照组及实验组培养至对数生长期，细胞汇合度达70-80%。根据细胞敏感性的不同加用适当浓度的厄洛替尼诱导细胞凋亡，诱导时间为1天，上清液用15ml离心管收集，同时贴壁细胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化，将上清液和贴壁细胞同时收集后，离心、重悬、计数。

B、将每组细胞分为4个离心管，分别代表不加染料组，只加Annexin V-PE染料组，只加7-AAD组，同时加Annexin V-PE和7-AAD染料组。

C、将细胞悬液调整为1×105/ml共1ml，收集于1.5ml离心管中，用4℃离心机1000转5分钟离心，弃上清后沉淀用1mlPBS重悬，收集于1.5mlEP管中，再次离心，沉淀再次用PBS重悬再离心。

D、完全清除上清液后，将所有含细胞的离心管置于冰上，用预冷的1×BindingBuffer100ul每离心管重悬细胞，离心管中加入10ul Annexin V-PE染料，混匀后避光孵育15分钟。

E、反应后每个离心管中加入400ul的1×Binding Buffer，离心管中加入10ul7-AAD染液，混匀后避光孵育等待上机。

F、采用流式细胞仪检测，其中细胞内表达的绿色荧光蛋白采用FL1通道，其激发波长为494nm，发射波长为518nm；Annexin V-PE的橙红色荧光使用FL2通道检测，激发波长488nm;发射波长578nm；7-AAD红色荧光使用FL3通道检测，其激发波长546nm;发射波长647nm。总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率

G、以上实验每组细胞重复3次，取平均值和标准差进行统计分析。

半胱天冬酶-3/7活性检测

实验原理

半胱天冬酶是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，它们在凋亡中发挥重要作用。一般来说，哺乳动物的半胱天冬酶可根据功能分为三类类：细胞因子激活(包括半胱天冬酶s1、4、5、13)，凋亡起始(包括半胱天冬酶s2、8、9、10)和凋亡执行(包括半胱天冬酶s3、6、7)。其中半胱天冬酶-3/7的被剪切形成激活体则代表凋亡已经不可逆转。本实验采用的半胱天冬酶-3/7凋亡检测方法是一种均质发光检测方法，半胱天冬酶-3/7在细胞凋亡过程中如果被激活形成剪切体后，即可剪切试剂盒中的底物Z-DEVD-氨基萤光素，该底物本身并不发光，但是如果被剪切后释放出氨基萤光素，即可产生产生由重组萤光素酶生成的辉光型发光信号(Luminescence)。该信号可以被辉光接收仪器检测到，其发光强度与存在的半胱天冬酶-3/7活性成正比，通过检测辉光强度即可判断半胱天冬酶-3/7激活成分的含量。

实验步骤

A.Panc-1、Bxpc-3及SW1990细胞对照组及实验组培养至对数生长期，细胞汇合度达70-80%。0.25%胰酶消化、收集细胞，离心、重悬、计数。按每孔5000个细胞加入白色不透明96孔板中培养使细胞贴壁。

B.设置空白对照，细胞未处理对照和处理细胞实验组，其中细胞实验组按细胞不同敏感程度加入厄洛替尼，每孔100ul培养基，在CO2孵箱中孵育24小时。

C.将试剂盒中的底物Z-DEVD-氨基荧光素和结合缓冲液从-20℃冰箱中拿出室温融化后，将结合缓冲液加入底物中使底物充分混匀。

D.每孔加100ul半胱天冬酶-3/7混合物100ul，在酶标仪震荡混匀30秒后，孵箱孵育1小时。

E.将96孔板放入化学发光微孔板式检测仪中，检测辉光强度。按处理组的辉光强度比细胞未处理组辉光强度，即为厄洛替尼处理后的相对辉光强度值。

F.辉光比值=处理细胞辉光值-空白辉光值

            未处理细胞辉光值-空白辉光值

G.以上实验每组细胞重复3次，取平均值和标准差进行统计分析。

细胞侵袭和转移检测

实验原理

Transwell小室是一种可放置在孔板中的小室，其小室底部底为聚碳酸酯膜，进行侵袭转移实验的膜为含8um小孔的膜，小室内称上室，培养皿内称下室，通常下室内放入含趋化因子或高浓度营养成分的培养基，而将细胞接种在上室内。由于聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，肿瘤细胞会向营养成分高的下室移动。对于肿瘤侵袭实验需要预先在小室内膜铺上一层基质胶以模仿细胞外基质，肿瘤细胞需要把基质消化后才可以从低营养培养基跑到高营养培养基中，最后通过检测小室膜的外侧面细胞数量即可明确细胞的侵袭和转移能力。

实验步骤

A.小室的准备：侵袭实验需要在小室的内膜面加入ECM胶，将ECM胶从-20℃冰箱中拿出放入冰上融化，然后和无血清培养基在冰上按1:9混合，按每孔40ul加入小室的内膜面，去除气泡，放入孵箱中孵育5小时使胶凝固，实验前半小时加入70ul无血清培养基使胶水化，去除上液备用；转移实验不需此步骤。

B.制备细胞悬液：制备细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿2小时。0.25%胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍。用无血清培养基重悬细胞，使细胞密度在1-6×105/ml，待用。

C.接种细胞：下室中加入含10%血清的完全培养基500ul/孔，使之与上室形成浓度梯度。将上室放入下室，取细胞悬液100ul加入Transwell小室中。注意下层培养液与小室之间不能有气泡，否则影响培养液的趋化作用。将培养板放入孵箱中孵育24小时。

D.去除上孔培养基，直接用棉签轻轻反复旋转擦拭膜上表面以去除未转移的细胞，直接转入下室含4%福尔马林溶液600ul中固定10分钟，固定的时候注意膜的下表面不能有气泡，否则固定不完全易脱落。

E、取出小室将小室膜常温风干，选用苏木素染细胞核8分钟，水洗去除非特异结合的苏木素，再用伊红染细胞胞浆1分钟，水洗去除非特异结合的伊红。采用倒置显微镜物镜和目镜各10×观察小室膜外侧细胞，按上、下、左、右、中5个区间分别计数，取平均值和标准差进行统计分析。

统计方法：

每次试验至少设置3次重复，计量资料采用平均值±标准差表示，两组间比较采用Student t检验。对于某一研究对象在不同时间点进行多次测量，采用重复测量数据的方差分析。统计软件采用SPSS13.0，取p<0.05作为两组间有统计学差异。采用Graphpad Prism5.0进行统计作图。

2.3实验结果

（1）CCK-8法检测胰腺癌细胞增殖情况

胰腺癌不同肿瘤细胞CCK-8工作曲线的绘制

绘制三株胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3和SW1990采用CCK-8法检测的工作曲线。在每孔0-20，000个细胞时，每孔接种的细胞数与吸光度呈线性关系，提示CCK-8法可以通过吸光度的改变正确反映细胞数量的变化。

调控CHIP表达水平对胰腺癌肿瘤细胞的影响

如图10所示，在三株胰腺癌细胞中分别沉默CHIP蛋白的表达，CCK-8法连续检测6天对照组和实验组细胞的增殖情况，检测结果发现两个沉默组细胞株的细胞增值率较对照组明显升高，p值均小于0.01，有统计学差异。

如图11所示，在三株胰腺癌细胞中分别过表达CHIP蛋白，CCK-8法连续检测6天对照组和实验组细胞的增殖情况，检测结果发现过表达组细胞的细胞增值率较对照组明显降低，p值均小于0.01，有统计学差异。

（2）胰腺癌细胞周期检测

如图12所示，在三株胰腺癌细胞中分别沉默CHIP蛋白的表达，流式细胞仪分别检测对照组和实验组细胞的细胞周期，检测结果发现沉默组细胞处在S期的细胞比率较对照组明显升高，其中Panc-1组细胞p<0.05，Bxpc-3组细胞p<0.05，SW1990组细胞miR1组的p<0.05，而miR2组细胞的p<0.01，均有统计学意义。这一结果提示，胰腺癌细胞株中沉默CHIP蛋白的表达，可促进胰腺癌细胞株由G1期转入S期。

如图13所示，在三株胰腺癌细胞中分别过表达CHIP蛋白，流式细胞仪分别检测对照组和实验组细胞的细胞周期，检测结果发现过表达组细胞处在S期的细胞比率较对照组明显降低，各组细胞p<0.05，均有统计学意义。这一结果提示，胰腺癌细胞株中过表达CHIP蛋白可抑制胰腺癌细胞株由G1期转入S期。

（3）厄洛替尼诱导细胞凋亡情况检测

各株胰腺癌细胞对厄洛替尼敏感性检测

图14分别显示厄洛替尼对Panc-1、Bxpc-3和SW1990细胞增殖的抑制率情况，从图中可以看到，厄洛替尼对Panc-1细胞的抑制效果最差，SW1990次之，Bxpc-3细胞抑制效果最强。厄洛替尼的浓度及其对细胞的抑制率带入SPSS13.0进行统计分析求出IC50值，结果Panc-1、Bxpc-3、SW1990的IC50分别为134.07umol/L、2.68umol/L和19.08umol/L。根据文献报道按30%的抑制率所需厄洛替尼计量诱导细胞凋亡，则三株细胞诱导凋亡所需加药浓度分别为19.02umol/L、0.877umol/L、2.869umol/L。

CHIP对厄洛替尼诱导胰腺癌细胞凋亡的影响

如图15所示，在三株胰腺癌细胞中分别沉默CHIP蛋白，流式细胞仪分别检测对照组和实验组细胞的细胞凋亡情况，检测结果发现沉默组细胞凋亡比例较对照组明显降低，Panc-1组和SW1990组p<0.01，Bxpc-3组p<0.05，均有统计学意义。这一结果提示，沉默CHIP蛋白以后，细胞对厄洛替尼诱导的胰腺癌细胞凋亡率较对照组明显降低。

如图16所示，在三株胰腺癌细胞中分别过表达CHIP蛋白，流式细胞仪分别检测对照组和实验组细胞的细胞凋亡情况，检测结果发现过表达组细胞凋亡比例较对照组明显升高，各组p均<0.01，均有统计学意义。这一结果提示，过表达CHIP蛋白以后，细胞对厄洛替尼诱导的胰腺癌细胞凋亡率较对照组明显升高。

（4）半胱天冬酶-3/7活性检测

如图17所示，在三株胰腺癌细胞中分别沉默CHIP蛋白，加用不同浓度的厄洛替尼以后，采用LB960仪器分别检测对照组和实验组所发出的辉光值，发现沉默组细胞所发出辉光值较对照组明显降低，其中Bxpc-3miR2组和SW1990miR2组p<0.01，其余组的p<0.05，均有统计学意义。这一结果提示，沉默CHIP蛋白以后，厄洛替尼诱导胰腺癌细胞产生活性半胱天冬酶3/7明显降低。

如图18所示，在三株胰腺癌细胞中分别过表达CHIP蛋白，加用不同浓度的厄洛替尼以后检测对照组和实验组所发出的辉光值，发现过表达组细胞所发出辉光值较对照组明显升高，不同细胞组的p<0.01，均有统计学意义。这一结果提示，过表达CHIP蛋白以后，厄洛替尼诱导胰腺癌细胞产生活性半胱天冬酶3/7明显升高。

（5）胰腺癌细胞侵袭和转移能力检测

检测小室内细胞所需数量

以对照组细胞穿过聚碳酸酯膜所占膜面积30%-70%作为小室内细胞所需数量的标准，发现Panc-1细胞转移实验所需细胞约为4×104/小室，侵袭实验所需细胞约为8×104/小室。Bxpc-3细胞转移实验所需细胞约为2×104/小室，侵袭实验所需细胞约为4×104/小室。SW1990细胞转移实验所需细胞约为5×104/小室，侵袭实验所需细胞约为1×105/小室。结果显示Bxpc-3细胞的侵袭和转移能力最强，Panc-1细胞次之，SW1990细胞侵袭和转移能力稍弱。

如图19所示，在三株胰腺癌细胞中分别沉默CHIP蛋白，采用Transwell方法分别检测对照组和实验组的侵袭和转移能力，其中检测侵袭能力的时候在小室内膜加稀释后的ECM胶，研究发现沉默组细胞的侵袭和转移能力较对照组明显升高，其中Panc-1组和SW1990组细胞实验和对照p<0.01，Bxpc-3组细胞p<0.05，均有统计学意义。这一结果提示，沉默CHIP蛋白以后，胰腺癌细胞侵袭和转移能力均明显增强。

如图20所示，在三株胰腺癌细胞中分别过表达CHIP蛋白，采用Transwell方法分别检测对照组和实验组的侵袭和转移能力，研究发现过表达组细胞的侵袭和转移能力较对照组明显降低，其中Bxpc-3组和SW1990组细胞实验和对照组p<0.01，Panc-1组细胞p<0.05，均有统计学意义。这一结果提示，过表达CHIP蛋白以后，胰腺癌细胞侵袭和转移能力均明显减弱。

2.4实验结论

（1）、CHIP蛋白可以抑制三株胰腺癌细胞的增殖能力，沉默CHIP蛋白胰腺癌细胞增殖能力明显增强。

（2）、CHIP蛋白可以抑制三株胰腺癌细胞的侵袭和转移能力，沉默CHIP蛋白胰腺癌细胞侵袭和转移能力明显增强。

（3）、CHIP蛋白可以增强厄洛替尼诱导的细胞凋亡，沉默CHIP蛋白后厄洛替尼诱导细胞凋亡能力明显减弱。

实施例3：胰腺癌中CHIP与EGFR的相互作用及对相关通路的影响

本实施例主要为CHIP蛋白影响胰腺癌生物学活性的机制研究，探讨胰腺癌中CHIP蛋白对其靶蛋白EGFR的泛素化降解调控，寻找CHIP与EGFR发生作用的相关位点；通过免疫荧光检测CHIP和EGFR的作用方式；并通过调节CHIP表达水平改变了解其对胰腺癌细胞中EGFR下游相关信号通路PI3K/AKT/mTOR和Src/FAK的影响。

3.1实验材料

细胞株与细胞培养相关用品同实施例2所述。

抗体及生产公司

SDS PAGE和Western blot根据本领域公知常识和生产厂商的说明书进行。

3.2实验方法

根据试剂盒说明书的说明以及Molecular cloning:a laboratory manual（2001），Joseph Sambrook等人公开的内容以及本领域的公知常识进行细胞总蛋白提取、通过BCA法测定总蛋白浓度、进行蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blot）、抗原抗体反应、ECL化学发光增强剂显色反应、免疫共沉淀的检测以及免疫荧光反应。

3.3实验结果

（1）、三株胰腺癌细胞稳定转染沉默CHIP或过表达CHIP后EGFR表达水平改变

在三株胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3，SW1990转入CHIP相关microRNA的慢病毒以稳定沉默CHIP蛋白的表达，采用Western blot检测EGFR表达水平，发现EGFR表达水平明显上升。在三株胰腺癌细胞株转入含CHIP基因的慢病毒以稳定过表达CHIP蛋白，结果发现EGFR表达水平明显降低。这一结果提示，在三株不同胰腺癌细胞株中，CHIP均可以与EGFR结合并诱导EGFR的降解。（图21）

（2）、CHIP对EGFR（Tyr845）降解作用的影响

在胰腺癌细胞株Bxpc-3中，当采用质粒沉默CHIP蛋白以后，EGFR的845位点磷酸化水平明显升高，；而当采用质粒过表达CHIP蛋白以后，EGFR的845位点磷酸化水平明显降低。（图22）。

以上结果提示，CHIP蛋白对EGFR的调控主要是通过抑制EGFR蛋白第845位点酪氨酸磷酸化而发挥作用。当EGFR蛋白由于自身或外界诱发第845位点磷酸化的时候，CHIP即可以发挥E3泛素连接酶的作用，与该位点发生磷酸化的EGFR结合并诱导其泛素化降解。这一结果与厄洛替尼通过抑制EGFR的酪氨酸激酶磷酸化进而诱导细胞凋亡是相一致的，此结果为前面所述的CHIP蛋白可以促进厄洛替尼诱导的细胞凋亡提供了理论的依据。

（3）、免疫荧光检测CHIP和EGFR的相互作用

设置对照组和两个实验组，对照组是Bxpc-3细胞转染无基因的空载质粒，实验组一为Bxpc-3细胞转染含Flag标签的CHIP质粒，实验组二为Bxpc-3细胞转染含Flag标签的CHIP质粒，转染24小时后，加入表皮生长因子（EGF）孵育1小时。在免疫荧光染色中，采用兔抗人的EGFR抗体检测细胞EGFR抗原，采用小鼠抗人的Flag标签抗体检测含Flag标签的CHIP抗原。二抗分别是含FITC标签的羊抗兔抗体和含罗丹明标签的羊抗小鼠抗体。结果发现，含Flag标签的CHIP蛋白同时在胞浆和胞核表达，EGFR主要在细胞膜表达呈致密状，但是当用EGF诱导以后，EGFR主要在胞浆和胞核中表达而呈团块状。进一步的研究发现，相对于对照组，实验组的EGFR表达水平明显减弱，在Flag-CHIP表达量较高的区域，EGFR表达量相对较低，而当Flag-CHIP表达量较低的区域，EGFR表达量相对较高。当EGF诱导EGFR由细胞膜转入胞浆和入细胞核以后，细胞核内Flag-CHIP表达量高的地方EGFR表达量较低，核内Flag-CHIP表达量低的地方EGFR表达量较高；同时胞浆中EGFR和Flag-CHIP的位置多发生重合。这些结果提示，CHIP蛋白过表达以后，可以诱导EGFR的降解，当使用EGF蛋白诱导EGFR由细胞膜进入胞浆和胞核的时候，CHIP蛋白在胞浆和胞核中均可以和EGFR结合并诱导EGFR的降解。

（4）、CHIP对EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路的影响

在三株胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3，SW1990转入CHIP相关microRNA的慢病毒以稳定沉默CHIP蛋白的表达，采用Western blot检测EGFR下游信号通路PI3K/AKT/mTOR的相关变化。结果发现，AKT的第473位点丝氨酸的磷酸化水平明显增高，而总AKT的表达水平未发生变化。mTOR的第2448位点的丝氨酸发生磷酸化的水平明显增高，总mTOR的表达水平未发生明显改变。BAD蛋白第136位点丝氨酸发生磷酸化的水平明显升高，总BAD表达水平未发生明显改变。p21蛋白的表达水平明显降低。由于三株胰腺癌细胞株PI3K的表达水平通过Western blot均没有检测出来，因此此图未给予显示。（图23）

以上结果说明，CHIP蛋白沉默以后，EGFR蛋白845位点发生磷酸化增加，进而促进了其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的磷酸化激活，进一步促进了其下游的BAD蛋白的磷酸化，同时抑制了p21蛋白的表达。这一结果与前述的CHIP蛋白的缺失诱导胰腺癌细胞增殖能力的增强，同时促进细胞由G1期转入S期的表型相一致。

（5）、CHIP对EGFR/Src/FAK通路的影响

CHIP通过抑制EGFR/Src/FAK通路抑制抑制的侵袭和转移能力

三株胰腺癌细胞株Panc-1，Bxpc-3，SW1990转入CHIP相关microRNA的慢病毒以稳定沉默CHIP蛋白的表达，采用Western blot检测EGFR下游信号通路Src/FAK/E-Cadherin的相关变化。结果发现，Src的第416位点酪氨酸的磷酸化水平明显增高，而总Src的表达水平未发生变化。FAK蛋白的第925位点的酪氨酸发生磷酸化的水平明显增高，总FAK蛋白表达水平未发生明显改变。三株细胞E-Cadherin蛋白的表达水平明显降低。（图24）

这一结果提示，当CHIP蛋白沉默以后，可以通过促进EGFR的表达及其845位点的磷酸化，进而促进其下游Src/FAK通路的磷酸化激活，激活后通过抑制E-Cadherin的表达进而促进胰腺癌细胞的侵袭和转移能力。这一结果与前述的细胞表型结果是一致的。

3.4实验结论

（1）胰腺癌细胞中当EGFR的845位点磷酸化时CHIP蛋白可以与EGFR结合并诱导其泛素化降解，与EGFR的结合需要CHIP全长而不是其截段体才能完成。

（2）胰腺癌细胞中CHIP蛋白可以下调EGFR介导的PI3K/AKT/mTOR通路的活化进而抑制肿瘤的增殖和细胞由G1期转入S期。

（3）胰腺癌细胞中CHIP蛋白可以下调EGFR介导的Src/FAK通路的活化并促进E-Cadherin的表达进而抑制肿瘤的侵袭和转移能力。

实施例4：CHIP在胰腺癌小鼠移植瘤模型中的功能和机制研究

本实施例主要观察Bxpc-3细胞稳定沉默或过表达CHIP以后对小鼠皮下移植瘤生长大小的影响，同时检测稳定沉默或过表达CHIP蛋白对靶向药物厄洛替尼抑制小鼠皮下移植瘤生长的影响；通过免疫组化研究CHIP蛋白及EGFR蛋白表达水平在移植瘤内的差异，观察CHIP对厄洛替尼诱小鼠移植瘤组织细胞凋亡的影响；通过小鼠脾脏注射肝转移模型观察CHIP表达水平的改变对肿瘤肝脏转移灶形成的影响。

4.1实验材料

细胞培养如上所述。动物均为4-6周的BALB/c雌性免疫缺陷型裸鼠，体重18-22g左右，由北京市维通利华有限公司提供。培养条件为SPF级环境下培养，每笼3-5只小鼠，由专人进行动物的清洁和饲养工作。所有的动物饲养均按照中国医学科学院动物管理和使用委员会规定的原则和程序进行。

4.2实验方法

所有动物的研究均按照中国医学科学院动物管理和使用委员会规定的原则和程序进行。实验研究报送本院伦理委员会审批通过。

所有实验步骤报告本领域的公知技术进行。

（1）小鼠皮下成瘤模型的建立

（2）小鼠脾脏注射肝转移模型的建立

（3）免疫组化检测方法

（4）结果判定

阳性结果呈棕黄色颗粒样染色，阳性细胞计数随机选择5个高倍视野，阳性细胞数0-30%，31%-60%及>60%，分别判定为0、1、2、3分。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为0、1、2、3分。根据两项积分之和判定结果，0分为阴性(-)，1-2分为弱阳性(+)，3-4分为中等阳性(++)，5-6分为强阳性(+++)。评分由两位病理科医师独立分别完成。

（5）统计分析：

对于计数资料采用卡方检验（Chi-square test）或Fisher精确检验；对于计量资料采用平均值±标准差表示，两组间比较采用Student t检验；对于某一研究对象在不同时间点进行多次测量，采用重复测量数据的方差分析。统计软件采用SPSS13.0，取p<0.05作为两组间有统计学差异。采用Graphpad Prism5.0进行统计作图。

4.3实验结果

（1）、Bxpc-3细胞小鼠皮下移植瘤模型的建立

稳定沉默CHIP细胞及对照细胞小鼠皮下移植瘤模型的建立

Bxpc-3对照组和稳定沉默CHIP组细胞种植于裸鼠的皮下，注射计量为5×106个细胞/250ul/只，每组5只老鼠，种植成功后每三天测量肿瘤直径，待一个月左右麻醉处死小鼠，取出肿瘤测量直径和重量。结果发现，沉默CHIP组细胞的生长速度要明显高于对照组，采用重复测量的方差分析有统计学差异（p<0.01）。取出肿瘤以后检测肿瘤直径，沉默CHIP组肿瘤体积为4522.12±850.19mm3，对照组肿瘤体积为1796.8±518.18mm3，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。检测肿瘤重量，沉默CHIP组肿瘤重量为2.232±0.24g，对照组肿瘤重量为1.542±0.15g，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。（图25）

稳定过表达CHIP细胞及对照小鼠皮下移植瘤模型的建立

Bxpc-3对照组和稳定过表达CHIP组细胞种植于裸鼠的皮下，注射计量为5×106个细胞/250ul/只，每组5只老鼠，种植成功后每三天测量肿瘤直径，待一个月左右麻醉处死小鼠，取出肿瘤测量直径和重量。结果发现，过表达CHIP组细胞的生长速度要明显低于对照组，采用重复测量的方差分析有统计学差异（p<0.01）。取出肿瘤以后检测肿瘤直径，过表达CHIP组肿瘤体积为273.22±115mm3，对照组肿瘤体积为923.74±328.62mm3，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。检测肿瘤重量，过表达CHIP组肿瘤重量为1.66±0.18g，对照组肿瘤重量为1.17±0.25g，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。（图26）

（2）、厄洛替尼干预Bxpc-3细胞小鼠移植瘤模型的研究

厄洛替尼干预稳定沉默CHIP细胞及对照细胞小鼠移植瘤模型的研究

Bxpc-3对照组和稳定沉默CHIP组细胞种植于裸鼠的皮下，注射计量为5×106个细胞/250ul/只，每组5只老鼠，种植成功一周后，给予厄洛替尼灌胃，灌胃剂量为50mg/kg，每天一次，每灌胃三天休息一天，共治疗四周，每三天测量肿瘤直径，待灌胃一个月后麻醉处死小鼠，取出肿瘤测量直径和重量。结果发现，厄洛替尼干预后稳定沉默CHIP组细胞的生长速度要高于对照组，采用重复测量的方差分析有统计学差异（p=0.034）。取出肿瘤以后检测肿瘤直径，沉默CHIP组肿瘤体积为1859.91±866.62mm3，对照组肿瘤体积为877.18±290.75mm3，Student t检验差异有统计学意义（p=0.037）。检测肿瘤重量，沉默CHIP组肿瘤重量为1.58±0.18g，对照组肿瘤重量为1.28±0.15g，Student t检验差异有统计学意义（p=0.022）。（图27）

厄洛替尼干预稳定过表达CHIP细胞及对照细胞小鼠移植瘤模型的研究

Bxpc-3对照组和稳定过表达CHIP组细胞种植于裸鼠的皮下，注射计量为5×106个细胞/250ul/只，每组5只老鼠，种植成功一周后，给予厄洛替尼灌胃，灌胃方法同前，待灌胃一个月后麻醉处死小鼠，取出肿瘤测量直径和重量。结果发现，厄洛替尼干预后稳定过表达CHIP组细胞的生长速度要明显低于对照组，采用重复测量的方差分析有统计学差异（p<0.01）。取出肿瘤以后检测肿瘤直径，过表达CHIP组肿瘤体积为273.22±115mm3，对照组肿瘤体积为923.74±328.63mm3，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。检测肿瘤重量，过表达CHIP组肿瘤重量为0.562±0.13g，对照组肿瘤重量为1.3±0.24g，Student t检验差异有统计学意义（p<0.01）。（图28）

（3）、Bxpc-3细胞小鼠皮下移植瘤模型的免疫组化研究

稳定沉默CHIP及对照细胞皮下移植瘤的免疫组化研究

将皮下移植瘤标本进行组织包埋，石蜡封片后进行免疫组化染色，其中所用抗体浓度为CHIP1:100、EGFR1:50、ki671:200，通过显微镜观察发现，Bxpc-3组织细胞对照组CHIP蛋白在胞浆和胞核中均有表达，而CHIP稳定沉默细胞胞浆中基本没有表达，少量细胞胞核中有表达；EGFR蛋白主要表达在细胞膜上，其中对照组呈弱阳性及中等阳性表达，而沉默CHIP细胞组的EGFR蛋白呈中等及强阳性表达。Ki67主要在细胞核中表达，在对照组中强阳性表达ki67的细胞数要少于在实验组中强阳性表达的细胞数。按如下进行评分：CHIP表达水平高低分组（0-2分为低表达，>2分为高表达）；EGFR表达水平高低分组（0-3分为低表达，4-6分为高表达），将对照组和稳定沉默组每个切片取5个视野（×400）进行分析，结果发现，细胞中CHIP表达水平与EGFR蛋白表达水平呈负性相关，p=0.045（表4-1）。将每个切片取一个视野（×400）检测Ki67表达强阳性细胞占总细胞数比例，结果发现，对照组强阳性细胞所占比例为71.6%±10.7%，沉默CHIP组强阳性细胞所占总细胞比例为87.44%±6.1%，有统计学差异（p=0.021），提示沉默组细胞所对应组织的增殖水平要高于对照组细胞。（图29）

表4-1沉默组组织及对照组的CHIP蛋白和EGFR蛋白表达水平分析

稳定过表达CHIP及对照细胞皮下移植瘤的免疫组化研究

按前述方法检测稳定过表达CHIP和对照细胞各蛋白的表达水平，通过显微镜观察发现，Bxpc-3组织细胞对照组CHIP蛋白在胞浆和胞核中均有表达，而CHIP稳定过表达细胞胞浆和胞核中均有表达，其中胞浆中为强阳性表达；EGFR蛋白主要表达在细胞膜上，其中对照组呈弱阳性及中等阳性表达，而过表达CHIP细胞组的EGFR蛋白没有表达或弱阳性表达。对照组中强阳性表达ki67的细胞数要多于在过表达组中强阳性表达的细胞数。按如下进行评分：CHIP表达水平高低分组（0-4分为低表达，>4分为高表达）；EGFR表达水平高低分组（0-1分为低表达，2-6分为高表达），将对照组和稳定沉默组每个切片取5个视野（×400）进行分析，结果发现，细胞中CHIP表达水平与EGFR蛋白表达水平呈负性相关，p<0.01（表4-2）。将每个切片取一个视野（×400）检测Ki67表达强阳性细胞占总细胞数比例，结果发现，对照组强阳性细胞所占比例为70.8%±9.9%，过表达CHIP组强阳性细胞所占总细胞比例为58.4%±11.6%，有统计学差异（p=0.026），提示过表达组细胞所对应组织的增殖水平要低于对照组细胞。（图30）

表4-2过表达组组织及对照组的CHIP蛋白和EGFR蛋白表达水平分析

Bxpc-3细胞成瘤模型中不同蛋白表达水平的差异检测

图31所示，左图和右图是同一组织部位的两张切片，左图以中间的间质为分界线，分为左侧的CHIP低表达区域和右侧的CHIP高表达区域，可见左侧细胞CHIP仅胞核少量表达，胞浆基本没有表达，右侧CHIP胞核和胞浆中均高表达。右图以中间的间质为分界线（间质细胞EGFR蛋白也有表达），分为左侧的EGFR高表达区域和右侧的EGFR低表达区域，其中左侧细胞EGFR表达为中强阳性，主要在胞膜上表达，右侧细胞EGFR胞膜基本没有表达或弱阳性表达。这一结果也证实了CHIP与EGFR的反向相关性，与前述结果相一致。

（4）、厄洛替尼干预小鼠移植瘤模型的免疫组化研究

厄洛替尼干预稳定沉默CHIP和对照组移植瘤的免疫组化研究

按前述方法进行免疫组化检测，其中切断的半胱天冬酶-3抗体稀释比例为1:300，结果发现，切断的半胱天冬酶-3主要在细胞核中表达；在对照组中，每高倍视野中（×400）切断的半胱天冬酶-3阳性细胞数为7±3个，而稳定沉默CHIP组切断的半胱天冬酶-3阳性细胞数为2±1个，两者有统计学差异（p<0.01）。提示稳定沉默CHIP后厄洛替尼诱导细胞凋亡数要低于对照组。（图32）

厄洛替尼干预稳定过表达CHIP和对照组移植瘤的免疫组化研究

按前述方法进行免疫组化检测，结果发现，对照组中每高倍视野中切断的半胱天冬酶-3阳性细胞数为8±2个，而稳定过表达组CHIP组切断的半胱天冬酶-3阳性细胞数为19±5个，两者有统计学差异（p<0.01）。提示稳定过表达CHIP后厄洛替尼诱导细胞凋亡数要高于对照组。（图33）

（5）、Bxpc-3细胞脾脏注射肝转移模型的建立

Bxpc-3稳定沉默组和对照组细胞脾脏注射肝转移模型的建立

按每组5只小鼠分组，每只小鼠按5×105个细胞进行脾脏注射，注射六周后小鼠给予麻醉处死，计数肝表面结节数。进行肝脏组织固定和切片，切片给予HE染色后镜下观察并拍照。结果发现，相较对照组，稳定沉默组肝转移数目明显增多，有统计学差异（p<0.01）。（图34）

Bxpc-3稳定过表达组和对照组细胞脾脏注射肝转移模型的建立

按每组5只老鼠分组，每只老鼠按5×105个细胞进行脾脏注射，注射六周后小鼠给予麻醉处死，计数肝表面结节数。进行肝脏组织固定和切片，切片给予HE染色后镜下观察肝脏转移情况。结果发现，相较对照组，稳定过表达肝转移数目明显减少，有统计学差异（p<0.01）。（图35）

4.4实验结论

（1）、CHIP蛋白可以抑制小鼠皮下抑制瘤的增殖能力；

（2）、小鼠皮下移植瘤模型免疫组化研究发现CHIP与EGFR蛋白表达呈负性相关；

（3）、CHIP蛋白可以促进厄洛替尼诱导的小鼠移植瘤组织细胞的凋亡；

（4）、CHIP蛋白可以抑制小鼠中胰腺癌细胞的肝转移能力。

Claims (9)

1.一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的CHIP蛋白用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

3.一种CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。

4.根据权利要求3的用途，其中所述的抗肿瘤药物是厄洛替尼。

5.一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

6.根据权利要求5的用途，其中所述的编码CHIP蛋白的DNA序列如SEQ IDNO：11所示。

7.根据权利要求5或6的用途，其中编码CHIP蛋白的DNA序列用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

8.一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。

9.根据权利要求8的用途，其中所述的抗肿瘤药物是厄洛替尼。