CN104513822B - Stub1基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了STUB1基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码STUB1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统，以及用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码STUB1突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。

Description

STUB1基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及STUB1基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码STUB1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统，用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。

背景技术

性腺发育不全合并小脑共济失调是一类临床罕见的综合征，其常表现为隐性遗传模式或者散发，其发病特点包括：1、病人幼儿或青春期起病；2、病人主要表现为性腺发育不全，不育，及逐渐进展的行走不稳；3、可合并其他症状如：痴呆、视网膜色素变性、脑白质病变、锥体束受损、耳聋等，也可不合并上述症状；4、辅助检查结果可发现相关病人可表现为低促性腺激素分泌不全性性腺发育不全或者高促性腺激素分泌不全性性腺发育不全，头部MRI或者CT往往合并小脑萎缩。本类疾病自100余年前被英国著名学者Gordon Holmes描述过之后，不断被报道，但相关机制尚不明确，致病基因的相关报道较少。

因而，目前对性腺发育不全合并小脑共济失调症的研究尤其是致病基因的确定仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：发明人通过外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了性腺发育不全合并小脑共济失调症的一个致病基因及其突变——STUB1基因的c.737C>T突变。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码STUB1突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变，即相对于野生型STUB1基因，本发明的STUB1基因突变体的第737位碱基从C突变为T。根据本发明的实施例，发明人确定了STUB1基因的突变体，该突变体与性腺发育不全合并小脑共济失调症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.T246M突变，即该突变是由于c.737C>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUB1，本发明的分离的多肽（即STUB1突变体）的第246位T突变为M。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变是所述生物样品易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的指示。通过根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.737C>T突变，判断所述生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测STUB1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该STUB1基因突变体具有c.737C>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码STUB1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者及家系内正常人的STUB1基因c.737C>T突变位点的Sanger测序验证峰图；

图4显示了根据本发明的一个实施例，STUB1蛋白第246位氨基酸位点在不同种群间的序列保守性分析结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

STUB1基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码STUB1突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变。该突变位点在人类参考基因组hg19的位置为chr16：732232。在本文中所使用的表达方式“编码STUB1突变体的核酸”，是指与编码STUB1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与STUB1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码STUB1突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了STUB1基因的突变体，该突变体与性腺发育不全合并小脑共济失调症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码STUB1突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的性腺发育不全合并小脑共济失调症的致病基因STUB1及其致病突变。该致病基因及致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型STUB1基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAGCCCCGAGAAGAGCCCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTCTGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTACGGCCGCGCGATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTGCTACCTGAAGATGCAGCAGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCGCCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTGGGGCAGTGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCGAGCTTACAGCCTGGCCAAGGAGCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCCCCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGGAGCGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCATTGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTGGAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGGGTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCCAAGCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGATGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCGACTACCTGTGTGGCAAGATCAGCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCACGCCCAGTGGCATCACCTACGACCGCAAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCCCGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCTCATCCCCAACTTGGCTATGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGAATGGCTGGGTGGAGGACTACTGA

(SEQ ID NO：1)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MKGKEEKEGGARLGAGGGSPEKSPSAQELKEQGNRLFVGRKYPEAAACYGRAITRNPLVAVYYTNRALCYLKMQQHEQALADCRRALELDGQSVKAHFFLGQCQLEMESYDEAIANLQRAYSLAKEQRLNFGDDIPSALRIAKKKRWNSIEERRIHQESELHSYLSRLIAAERERELEECQRNHEGDEDDSHVRAQQACIEAKHDKYMADMDELFSQVDEKRKKRDIPDYLCGKISFELMREPCITPSGITYDRKDIEEHLQRVGHFDPVTRSPLTQEQLIPNLAMKEVIDAFISENGWVEDY(SEQID NO：2)。

本发明的STUB1基因突变体的cDNA序列如下所示：

ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAGCCCCGAGAAGAGCCCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTCTGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTACGGCCGCGCGATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTGCTACCTGAAGATGCAGCAGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCGCCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTGGGGCAGTGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCGAGCTTACAGCCTGGCCAAGGAGCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCCCCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGGAGCGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCATTGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTGGAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGGGTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCCAAGCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGATGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCGACTACCTGTGTGGCAAGATCAGCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCATGCCCAGTGGCATCACCTACGACCGCAAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCCCGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCTCATCCCCAACTTGGCTATGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGAATGGCTGGGTGGAGGACTACTGA

(SEQ ID NO：3)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MKGKEEKEGGARLGAGGGSPEKSPSAQELKEQGNRLFVGRKYPEAAACYGRAITRNPLVAVYYTNRALCYLKMQQHEQALADCRRALELDGQSVKAHFFLGQCQLEMESYDEAIANLQRAYSLAKEQRLNFGDDIPSALRIAKKKRWNSIEERRIHQESELHSYLSRLIAAERERELEECQRNHEGDEDDSHVRAQQACIEAKHDKYMADMDELFSQVDEKRKKRDIPDYLCGKISFELMREPCIMPSGITYDRKDIEEHLQRVGHFDPVTRSPLTQEQLIPNLAMKEVIDAFISENGWVEDY(SEQID NO：4)。

发明人发现的STUB1基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变，即相对于野生型STUB1基因，本发明的STUB1基因突变体的第737位碱基从C突变为T。由此，其所编码的产物与野生型的STUB1相比，具有p.T246M突变，即该突变是由于c.737C>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUB1，本发明的分离的多肽（即STUB1突变体）的第246位T突变为M。

目前已知，泛素蛋白酶体通路障碍可引起性腺发育不全合并脊髓小脑共济失调，其中一种E3连接酶RNF213和一种去泛素酶OTUD4的基因突变都可以引起此类症状，但是目前尚未见STUB1突变与性腺发育不全合并小脑共济失调症相关的报道。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型STUB1相比，该分离的多肽具有p.T246M突变，即该突变是由于c.737C>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUB1，本发明的分离的多肽（即STUB1突变体）的第246位T突变为M。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码STUB1突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品STUB1是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中STUB1是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含STUB1编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自ABI3730、Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序，优选ABI3730测序仪。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自ABI3730、Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序，优选ABI3730测序仪。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集STUB1外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用STUB1外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集STUB1外显子，从而能够进一步提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，STUB1外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些STUB1外显子特异性引物具有SEQ ID NO：15和16所示的核苷酸序列：

正向引物：5’-ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGC-3’（SEQ ID NO：15）；

反向引物：5’-GTAGTCCTCCACCCAGCCATTCTCAGAGAT-3’（SEQ ID NO：16）。

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中通过显著有效地完成对STUB1外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应STUB1的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.737C>T突变，则指示生物样品易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集STUB1外显子，进一步提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有STUB1外显子特异性引物，以便利用STUB1外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，STUB1外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：15和16所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自ABI3730、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种，优选ABI3730测序仪。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1相比，是否具有c.737C>T突变，判断生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变，是生物样品易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒包括：适于检测STUB1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该STUB1基因突变体具有c.737C>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测STUB1基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测STUB1编码基因的试剂，也可以是检测STUB1突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：15-16所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码STUB1突变体的核酸，即本发明的STUB1基因突变体。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的STUB1基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定性腺发育不全合并小脑共济失调症致病突变

1、样本收集

发明人收集到一个表现为性腺发育不全合并小脑共济失调的家系，其家系图见图2。如图2所示，其中，○表示正常女性，□表示正常男性，■表示男性患者，●表示女性患者。

发明人收集获得上述性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、全外显子组测序

发明人利用NimbleGenSeqCap EZ Human Exome Library v2.0全外显子捕获平台结合Solexa高通量测序技术，对上述性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的两名患者和一名家系内正常人的STUB1基因的外显子区域序列进行了测序。

具体如下：

2.1DNA提取

采集图2所示性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的两名患者(II-1和II-2)和一名家系内正常人（II-3）的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均应位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于3微克。

2.2外显子捕获与测序

利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成250-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为90×。

3、变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到UCSC人类参考基因组（hg19,build37.1，http://genome.ucsc.edu/)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNPdetection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，在这些样本中，发明人发现：患者II-1的DNA样品中有96183个单核苷酸多态性（SNPs）和7046处的插入/缺失；患者II-2的DNA样品中有98255个单核苷酸多态性（SNPs）和7227处的插入/缺失；家系内正常人II-3的DNA样品中有98507个单核苷酸多态性（SNPs）和7159处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp135.txt.gz.）、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）、千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp）、炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

然后根据生物信息策略成功筛选到STUB1基因的一个T246M蛋白错义突变，即p.T246M蛋白突变，其基因突变为c.737C>T。

接着，发明人在500名家系外正常人中对上述基因突变进行了Sanger测序验证，结果，未发现相关基因变异，证实了上述突变的突变性。

进一步，发明人对STUB1蛋白第246位氨基酸位点进行了相关序列保守性分析，结果见图4。由图4可知，该位点在不同种群中高度保守，从而佐证了上述突变的致病性。

综上所述，发明人认为，STUB1极有可能是性腺发育不全合并小脑共济失调症的致病基因，而STUB1基因的c.737C>T突变为该病的致病突变。

实施例2Sanger法测序验证1

分别对实施例1中所述的性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的所有家系成员（包括患者及家系内正常人）和500名家系外正常人的STUB1基因进行检测：针对STUB1基因的7个外显子分别设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得STUB1有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证STUB1基因与性腺发育不全合并小脑共济失调症之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到具有SEQ ID NO：5-14所示的核苷酸序列的STUB1基因外显子特异性引物，具体序列如下：

Exon1：

正向引物：5’-GGGGACAGGGAACTGGAG-3’(SEQ ID NO：5)，

反向引物：5’-CCCGAAGAGGAGCCAGAC-3’(SEQ ID NO：6)；

Exon2：

正向引物：5’-ATTCTAGCCAGAGCGCAGAA-3’(SEQ ID NO：7)，

反向引物：5’-GGGCTTCACGTCACTCTCTG-3’(SEQ ID NO：8)；

Exon3：

正向引物：5’-GGCCAGAGAGTGACGTGAA-3’(SEQ ID NO：9)，

反向引物：5’-TAAACGCTTGTGTCGGGAGT-3’(SEQ ID NO：10)；

Exon4,5：

正向引物：5’-ATCTGGCCAGGTCCATCTCT-3’(SEQ ID NO：11)，

反向引物：5’-ACACGGTCAGAGGCTGAAAA-3’(SEQ ID NO：12)；

Exon6,7：

正向引物：5’-TTTTCAGCCTCTGACCGTGT-3’(SEQ ID NO：13)，

反向引物：5’-GGGTGGCCAGGAACATAAAC-3’(SEQ ID NO：14)。

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系：

试剂名称	试剂量
		Taq DNA聚合酶(2×)	5μl
正向引物(100ng/μl)	0.5μl
		反向引物(100ng/μl)	0.5μl
DNA模板	1μl
		dd H2O	3μl
总剂量	10μl

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。其中，图3显示了上述性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者(II-1和II-2)及家系内正常人（I-1、I-2和II-3）的STUB1基因c.737C>T突变位点的Sanger测序验证峰图。

然后，利用Chromas软件对获得的sanger测序峰图用进行分析，判断关注位点（STUB1基因cDNA序列的第737位碱基）是否有突变。具体地，利用Chromas软件对Sanger测序峰图用进行分析的步骤如下：

（1）用Chromas软件打开sanger峰图，导出测序序列；

（2）将导出的序列与HG19序列比对，找出关注位点；

（3）在Chromas软件显示的峰图上，查看关注位点是否有突变；

（4）突变判断：snp：关注位点有双峰就是有突变。

对图3所示的Sanger测序峰图的分析结果显示，该性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者均携带有STUB1基因的c.737C>T突变，而家系内正常人及300名家系外正常人均不携带该致病突变。

由此，进一步证明STUB1基因为性腺发育不全合并小脑共济失调症的致病基因，STUB1基因的c.737C>T突变为该病的致病突变。

实施例3Sanger法测序验证2

分别对实施例1中所述的性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的所有家系成员（包括患者及家系内正常人）的STUB1基因进行检测：针对STUB1基因的c.737C>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得STUB1有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证STUB1基因的c.737C>T突变与性腺发育不全合并小脑共济失调症之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、cDNA获得

依据《分子克隆》第二版，于3小时内从受试者外周静脉血中提取RNA，然后，利用逆转录试剂盒（天根）将所提取的RNA进行逆转录得到cDNA。逆转录步骤包括：10μlRNA加入1μlOlig18，1μl无RNA酶水，65℃水浴5分钟；冰浴1分钟；然后，向体系中加入4μl Buffer，1μlRT酶，1μl RI酶，2μl DNTP，42℃水浴1小时；然后，75℃水浴灭火10分钟，得到cDNA，备用。

2、引物设计及逆转录PCR

首先，针对STUB1基因的c.737C>T突变位点，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，根据STUB1基因的相关序列，设计得到具有SEQ ID NO：15-16所示的核苷酸序列的STUB1基因外显子特异性引物，具体序列见下表：

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系：

试剂名称	试剂量
		Taq DNA聚合酶(2×)	5μl
正向引物(100ng/μl)	0.5μl
		反向引物(100ng/μl)	0.5μl
cDNA模板	1μl
		dd H2O	3μl
总剂量	10μl

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。然后，利用Chromas软件对获得的sanger测序峰图用进行分析，判断关注位点（STUB1基因cDNA序列的第737位碱基）是否有突变，分析方法见实施例2。

结果，发明人发现，该性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者均携带有STUB1基因的c.737C>T突变，而家系内正常人均不携带该致病突变。

由此，进一步证明STUB1基因为性腺发育不全合并小脑共济失调症的致病基因，STUB1基因的c.737C>T突变为该病的致病突变。

实施例4检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测STUB1基因的c.737C>T突变的引物，用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品，其中这些引物为STUB1基因外显子特异性引物，其序列如实施例1中所述SEQ ID NO：15-16所示。

利用上述试剂盒筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述STUB1基因的外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.737C>T突变，能够有效地检测本发明的STUB1基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症，进一步，能够从待测者中筛选出易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。

实施例5构建体制备

按照以下步骤，制备包含本发明的STUB1基因突变体基因的构建体：

（1）逆转录PCR产物TA克隆：

随机选取实施例3中经验证具有c.737C>T突变的cDNA片段，然后于微量离心管中配制下表所示的DNA溶液。

pGMT18-T载体	1μl
		cDNA扩增产物	0.1pmol-0.3pmol
dd H2O	补充到5μl

接着，向上述DNA溶液中加入等量体积的SolutionⅠ（TaKaRa公司DNA LigationKit Ver.2.0），16℃反应30分钟。接下来，全量（10μl）加入到100μl TOP10感受态细胞中，冰中放置30分钟后，42℃加热45秒钟，然后在冰中放置1分钟。接着，加入890μl LB培养基，37℃震荡培养60分钟。然后，将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

由此，获得重组质粒。

（2）重组质粒的鉴定：

提取质粒DNA，按实例3的方法进行sanger测序验证，结果证明，具有c.737C>T突变位点的cDNA片段已连入T载体，构建体制备成功。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种分离的编码STUB1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.T246M突变，

任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

3.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码STUB1突变体的核酸。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求3所述的构建体转化受体细胞而获得的。