CN104561015B - Myl4基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MYL4基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码MYL4突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患心房静止的生物样品的方法，筛选易患心房静止的生物样品的系统，以及用于筛选易患心房静止的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码MYL4突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患心房静止。

Description

MYL4基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及MYL4基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码MYL4突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患心房静止的生物样品的方法，筛选易患心房静止的生物样品的系统，用于筛选易患心房静止的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。

背景技术

心房静止(atrial standstill，AS)是一种非常罕见的心律失常，是指窦性停搏合并房性停搏，且不伴有逆行性心房传导的交界性或室性节律，表现为心房电活动和机械活动的丧失。心电图上表现为心动过缓，p波消失或交接性逸搏。目前已经报道了不同形式的心律失常。例如持续性或暂时性的心房静止，以及整个心房和部分心房静止。在大多数的报道中，心房静止往往是继发于其它临床疾病，如Ebstein’s畸形，Emery-Dreifuss肌营养不良症（X-连锁），Kugelberg-Welander综合症（常染色体隐性遗传），糖尿病或淀粉样变性。

目前AS的基因学方面的研究较少，其致病相关机制仍不明确。因而，目前对心房静止尤其是其致病基因的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患心房静止的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：发明人通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法确定了心房静止的一个新的致病突变——MYL4基因的c.31G>A突变。此外，本发明的完成还依赖于发明人发掘的一个大的AS家系。已知AS家系是探讨AS（即心房静止）相关突变基因的最好模型，但家族性AS比较罕见。目前为止，只有少数的几个原发性心房静止的家系被报道，而且每个家系的患者都非常少（两到三个），而且局限在一代或两代，通过分析这种家系发现AS的致病基因困难较大。而本发明发现的AS家系有6个患者，并且没有任何人有结构性心脏病及全身性疾病的表现，非常适于进行致病基因挖掘。

进而，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码MYL4突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变，即相对于野生型MYL4基因，本发明的MYL4基因突变体的cDNA第31位碱基G突变为A。根据本发明的实施例，发明人确定了MYL4基因的突变体，该突变体与心房静止的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患心房静止。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.Glu11Lys突变，即该突变是由于c.31G>A突变而引起的，具体地，相对于野生型MYL4，本发明的分离的多肽（即MYL4突变体）第11位氨基酸由Glu突变为Lys。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患心房静止。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患心房静止的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变是所述生物样品易患心房静止的指示。通过根据本发明实施例的筛选易患心房静止的生物样品的方法，可以有效地筛选易患心房静止的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患心房静止的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.31G>A突变，判断所述生物样品是否易患心房静止。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患心房静止的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患心房静止的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患心房静止的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测MYL4基因突变体的试剂，其中与SEQID NO：1相比，该MYL4基因突变体具有c.31G>A突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患心房静止的生物样品。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码MYL4突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗心房静止的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗心房静止的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患心房静止的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1I为根据本发明实施例的筛选易患心房静止的生物样品的系统的示意图，

图1II为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1III为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的AS患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明一个实施例，图2所示AS患者家系中先证者I7，患者II1及II3的心电图，

图3I为先证者I7的心电图，

图3II为患者II1的心电图，

图3III为II3的心电图；

图4显示了根据本发明的一个实施例，图2所示AS患者家系的连锁分析结果；

图5显示了根据本发明的一个实施例，图2所示AS患者家系中先证者和家系内正常人，以及家系外正常对照的MYL4基因c.31G>A突变位点的代表性Sanger测序验证峰图；

图6-9显示了根据本发明的一个实施例，本发明的MYL4基因的c.31G>A突变对氨基酸及蛋白功能的影响实验的结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

MYL4基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码MYL4突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变。在本文中所使用的表达方式“编码MYL4突变体的核酸”，是指与编码MYL4突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与MYL4突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码MYL4突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了MYL4基因的突变体，该突变体与心房静止的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患心房静止，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患心房静止。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码MYL4突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法确定的心房静止的致病基因MYL4的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型MYL4基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

CTCTCTGGCTGCTCCGGCATATTTGAGAAGGTCTGTTTCCCTGGTCCTTCTGGGTTTCCACCAATTGGCAAGAAGGGATCAGCCTGTCCTAGAGATCACTCCTCTGCCAAAGATCCCAACAAGACAACATGGCTCCCAAGAAGCCTGAGCCTAAGAAGGAGGCAGCCAAGCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCAGCCCCTGCACCAGCCCCTGCCCCAGCTCCTGAGGCTCCCAAGGAACCTGCCTTTGACCCCAAGAGTGTAAAGATAGACTTCACTGCCGACCAGATTGAAGAGTTCAAAGAGGCCTTTTCATTGTTTGACCGGACCCCGACTGGAGAGATGAAGATCACCTACGGCCAGTGCGGGGATGTACTGCGGGCCCTGGGCCAGAACCCTACCAATGCCGAGGTGCTGCGTGTGCTGGGCAAGCCCAAGCCTGAAGAGATGAATGTCAAGATGCTGGACTTTGAGACGTTCTTGCCCATCCTGCAGCACATTTCCCGCAACAAGGAGCAGGGCACCTATGAGGACTTCGTGGAGGGCCTGCGTGTCTTTGACAAGGAGAGCAATGGCACGGTCATGGGTGCTGAGCTTCGGCACGTCCTTGCCACCCTGGGAGAGAAGATGACTGAGGCTGAAGTGGAGCAGCTGTTAGCTGGGCAAGAGGATGCCAATGGCTGCATCAATTATGAAGCCTTTGTCAAGCACATCATGTCAGGGTGAAGCAGAGTCTTCCAGGTGCCTGGCCCTTGGCTTTAGCCATACCAGGGTGAGTTAAAGAGAGGCCCCGGCTGGGTGAGCTGAGATGGAGTCCTCGACTTATCACCACACCACTGCCCCAAGGACCTTACAGGCCCTCCCTGTTAATAAACAGCTCTAACACGGCCAGGCTGGGCTCTGGGATTCTGA(SEQ ID NO：1)，其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MAPKKPEPKKEAAKPAPAPAPAPAPAPAPAPEAPKEPAFDPKSVKIDFTADQIEEFKEAFSLFDRTPTGEMKITYGQCGDVLRALGQNPTNAEVLRVLGKPKPEEMNVKMLDFETFLPILQHISRNKEQGTYEDFVEGLRVFDKESNGTVMGAELRHVLATLGEKMTEAEVEQLLAGQEDANGCINYEAFVKHIMSG(SEQ ID NO：2)。

发明人发现的MYL4基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变，即相对于野生型MYL4基因，本发明的MYL4基因突变体的cDNA第31位碱基G突变为A。由此，其所编码的产物与野生型的MYL4相比，具有p.Glu11Lys突变，即该突变是由于c.31G>A突变而引起的，具体地，相对于野生型MYL4，本发明的分离的多肽（即MYL4突变体）第11位氨基酸由Glu（E）突变为Lys（K）。

已知MYL4基因编码心房重要轻链的蛋白（ELCa），ELCa在胚胎发育过程中的心房和心室，以及胎儿的骨骼肌中均有表达。而在成年人中，ELCa只在心房中表达。目前，人们对于体内的MYL4基因的认知较少，也尚未见MYL4基因及其上的c.31G>A突变为心房静止的致病突变的相关报道。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型MYL4相比，该分离的多肽具有p.Glu11Lys突变，即该突变是由于c.31G>A突变而引起的，具体地，相对于野生型MYL4，本发明的分离的多肽（即MYL4突变体）第11位氨基酸由Glu突变为Lys。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码MYL4突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患心房静止，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患心房静止。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患心房静止的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品MYL4是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患心房静止的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中MYL4是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含MYL4编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患心房静止的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患心房静止的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集MYL4外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用MYL4外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集MYL4外显子，从而能够进一步提高筛选易患心房静止的生物样品的效率。根据本发明的实施例，MYL4外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，该MYL4外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列：

正向引物：5’-CTGTACCCTGCTGGCGTTTC-3’（SEQ ID NO：3）；

反向引物：5’-TGCCCTCACCTGCCGTAA-3’（SEQ ID NO：4）。

发明人惊奇地发现，通过采用上述引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对MYL4外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应MYL4的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.31G>A突变，则指示生物样品易患心房静止。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患心房静止的生物样品的方法，可以有效地筛选易患心房静止的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患心房静止的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易患心房静止的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患心房静止的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患心房静止的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集MYL4外显子，进一步提高筛选易患心房静止的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有MYL4外显子特异性引物，以便利用MYL4外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，MYL4外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患心房静止。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.31G>A突变，判断生物样品是否易患心房静止。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变，是生物样品易患心房静止的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患心房静止的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患心房静止的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患心房静止的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患心房静止的生物样品的试剂盒包括：适于检测MYL4基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该MYL4基因突变体具有c.31G>A突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患心房静止的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测MYL4基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测MYL4编码基因的试剂，也可以是检测MYL4突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患心房静止的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患心房静止的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患心房静止的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码MYL4突变体的核酸，即本发明的MYL4基因突变体。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗心房静止的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的MYL4基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗心房静止的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定心房静止致病突变

1、样本收集

发明人收集到一个心房静止家系（即AS家系），其家系图见图2。如图2所示，其中，○表示正常女性，□表示正常男性，■表示男性患者，●表示女性患者，表示表现已逝正常男性，表示已逝正常女性；箭头所指为先证者I7。

该AS家系含有44名成员，包括6患者，该家系患病的特点是二三十岁起病，初始表现为晕厥和心动过缓，逐渐进展为各种复杂的心律失常，三四十岁时出现AS和心衰。持续性AS患者很可能发生晕厥和脑血管事件，需安装心室起搏器及抗凝药物以防血栓和猝死。其中，先证者I7和患者II1、II3的心电图见图3。在该家系中AS疾病呈常染色体隐性遗传。

发明人采集获得上述心房静止患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、目标区域捕获测序

发明人利用Agilent SureSelect Human All Exon Kit结合Solexa高通量测序技术，对上述AS患者家系中的两名患者II1、II3的外显子组序列进行了测序。

具体如下：

2.1DNA提取

采集图2所示AS患者家系中患者II1、II3的外周血，利用OMEGA Blood DNA MidiKit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均应位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微克。

2.2目标区域捕获与测序

利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为50×。

3、变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到UCSC人类参考基因组（hg19,build37.1，http://genome.ucsc.edu/)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNPdetection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，在病例II1中发现66376个单核苷酸多态性（SNPs）和5418处的插入/缺失，在病例II3中发现了62958单核苷酸多态性（SNPs）和4876处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp135.txt.gz.）、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）、千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp）、炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库的过滤，去掉上述获得的测序结果中的同义突变、非编码区的变异，以及所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异，并利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到50个可能具有致病意义的基因。

同时发明人再通过连锁分析的方法，成功定位了17q21区段与该家系高度连锁。具体地，对家系内6名患者和19名正常人，利用连锁分析对致病基因进行染色体初步定位，在17号染色体单核苷酸多态（SNP）KRTAP9-4基因和LRRC46基因之间（17q21）发现阳性LOD值，区间最大LOD值Z=5.3(θ=0.00)，提示该家系的致病基因与该区域连锁。其中，连锁分析结果（即单体型分析结果）见图4。

而综合外显子测序及连锁分析结果可知，该17q21区段内外显子测序结果的基因为TUBG2、DCAKD、MYL4。再通过Sanger测序方法，对这三个基因上的侯选突变位点进行验证，结果仅有1个SNP为真正的共分离SNP位点，即MYL4基因的c.31G>A杂合突变，该突变导致氨基酸序列发生p.Glu11Lys错义突变。进一步，通过家族中疾病共分离现象和对正常人的SNP筛查，发明人认为，MYL4基因为AS的致病基因，而该杂合位点可能是致病位点。

实施例2Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的心房静止患者家系中的所有家系成员（包括患者及家系内正常人）以及200名家系外正常人的MYL4基因进行检测：针对MYL4基因的c.31G>A突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证MYL4基因及该突变与AS疾病之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到具有SEQ ID NO：3-4所示核苷酸序列的MYL4基因外显子特异性引物，具体序列如下：

正向引物：5’-CTGTACCCTGCTGGCGTTTC-3’（SEQ ID NO：3）；

反向引物：5’-TGCCCTCACCTGCCGTAA-3’（SEQ ID NO：4）。

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系：

试剂	体积
		2×GC BufferⅠ	5.0μl
dNTPs(10mM)	0.4μl
		LA Taq酶(5U/μl)	0.1μl
引物(100ng/μl)	0.2μl/个
		gDNA模板(50ng/μl)	1.0μl
ddH2O	加至10.0μl

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。

基于测序结果，在本发明的AS患者家系中对MYL4基因的该杂合突变位点进行突变排查，结果发现该家系中患者均携带c.31G>A(p.Glu11Lys)杂合突变，而表现正常的家系成员均不携带c.31G>A(p.Glu11Lys)杂合突变。此外，家系外正常人也均不携带该杂合突变。其中，图5显示了上述AS患者家系中先证者（I7）和家系内正常人（I9），以及家系外正常对照的MYL4基因c.31G>A突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

由此，进一步证明MYL4基因为心房静止的致病基因，MYL4基因的c.31G>A突变为该病的致病突变。

实施例3突变影响氨基酸以及蛋白功能实验

根据文献报道可知，MYL4编码的ELCa N端短肽可以影响肌球蛋白ATPase活性。因而，发明人通过合成野生型和突变型的ELC N端氨基酸短肽，初步探讨MYL4突变对肌球蛋白ATPase活性的影响，以便研究本发明的MYL4基因的c.31G>A突变对氨基酸及蛋白功能的影响，具体步骤如下：

1、质粒构建及蛋白的纯化

通过人工合成基因序列克隆到BamHI和EcoRI位点的质粒，成功构建正常序列质粒和突变序列质粒(pcDNA3.1-MYL4-GG和pcDNA3.1-MYL4-AA)，并通过测序证实序列正确。质粒在含有氨苄的琼脂板上转化到DH5α细胞。蛋白的表达和纯化过程，通过293T细胞转染编码MYL4-GG序列和MYL4-AA序列的质粒，使用PBS透析后在293SFM II培养基培养48小时，使用蛋白A-琼脂糖珠在4摄氏度下沉淀16h后再用0.5M氯化钠的PBS透析，之后使用50mM的柠檬酸钠/50mm甘氨酸（pH值2）洗脱，然后用NaOH中和。纯化后的蛋白使用过滤器(Amicon)和PBS透析来浓缩。

2、合成多肽

分别合成人类心房ELC残基序列的野生型多肽ELCa-wt：APKKPEPKK(E)AAKPA(SEQID NO：5)，以及突变型多肽ELCa-mu：APKKPEPKK(K)AAKPA(SEQ ID NO：6)。

另外，心室ELC蛋白和心房ELC结构非常相似，尤其是N端短肽序列，故发明人又合成了心室肌的突变型N端短肽ELCv-mu：APKKPEPKK(KK)AKAA(SEQ ID NO：7)，以及野生型N端短肽ELCv-wt：APKKPEPKK(DD)AKAA(SEQ ID NO：8)，来以验证ELC N端短肽对ATPase的影响。使用Merrifield固相法合成。纯度达到95%。

3、ATP酶活性分析

首先，测定不同类型及不同浓度的ELCa短肽、ELCv短肽以及ELC蛋白对肌球蛋白、HMM和S1相对酶活性。其中，ATP酶活性的测定采用Synergy2多检测酶标仪进行，吸收波长设置为360nm，突变型或野生型的ELC使用不同的浓度(10、50、100、500nM)，结果见图6-图8。

其中，不同类型及不同浓度的ELCa短肽对肌球蛋白、HMM和S1相对酶活性曲线见图6。如图6所示，图中横坐标为反应时间，纵坐标为产生的Pi的量（即代表酶反应速度），相同时间内产生的Pi越多，则代表反应速度越快。由图6可知，与ELCa-wt短肽相比，ELCa-mu短肽明显降低肌球蛋白、HMM和S1的ATPase反应速度，但其对ATPase活性的影响与加入的短肽的浓度无明显相关性。

不同类型及不同浓度的ELCv短肽对肌球蛋白、HMM和S1相对酶活性曲线见图7。如图7所示，图中横坐标为反应时间，纵坐标为产生的Pi的量。由图7可知，与ELCv-wt短肽相比，ELCv-mu短肽明显降低肌球蛋白、HMM和S1的ATPase活性，该结论与上述ELCa的结论相同。

野生型和突变型的ELC蛋白对肌球蛋白、HMM和S1相对酶活性曲线见图8。如图8所示，图中横坐标为反应时间，纵坐标为产生的Pi的量。由图8可知，同样，与ELC-wt蛋白相比，ELC-mu蛋白明显降低肌球蛋白、HMM和S1的ATPase活性。其对ATPase活性的影响与加入的短肽的浓度无明显相关性。

然后，通过酶动力学的双倒数法作图（将Michaelis-Menten方程式：v=Vmax/(1+(Km/[S]))转换成双倒数方程是:1/v=1/Vmax+Km/Vmax×1/[S])，以便确定不同浓度底物的酶的酶促动力学最大反应速度Vmax及Km值。其中，双倒数法是根据Michaelis-Menten方程的倒数形式，以1/V对1/[S]作图，可得到一条直线，其中直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，据此可求Km和Vmax。其中，如Michaelis-Menten方程式：v=Vmax/(1+(Km/[S]))所示，V为反应速度，Km为米氏常数，Vmax为酶反应最大速度，[S]为底物浓度。结果见图9。

由图9可知，与加入ELCa-wt纯化蛋白相比，加入ELCa-mu纯化蛋白后，S1的Km和Vmax都明显下降（Km:wt vs.mu,2.18±0.54vs.0.55±0.06,p=0.007;Vmax:wt vs.mu,7.32±1.43vs.3.13±0.34,p=0.008），这表明ELC突变引起肌球蛋白头端ATPase活性的下降。同样，与ELCa-wt纯化蛋白相比，ELCa-mu纯化蛋白明显降低肌球蛋白（Km:wt vs.mu,0.60±0.18vs.0.30±0.27,p=0.007;Vmax:wt vs.mu,7.03±1.02vs.5.60±1.15,p=0.154）和HMM（Km:wt vs.mu,0.46±0.12vs.0.21±0.03,p=0.007;Vmax:wt vs.mu,3.90±0.80vs.3.32±0.47,p=0.255）的Km和Vmax，但未达到统计学差异。这可能与肌球蛋白和HMM的颈部仍携带有正常的ELC蛋白有关。

由此，进一步证明了实施例1中检测获得的该AS家系中MYL4基因的c.31G>A(p.Glu11Lys)突变即为心房静止的致病突变。

实施例4检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测MYL4基因的c.31G>A突变的引物，用于筛选易患心房静止的生物样品，其中这些引物为MYL4基因外显子特异性引物，其序列如实施例1中所述SEQ ID NO：3-4所示。

利用上述试剂盒筛选易患心房静止的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述MYL4基因的外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.31G>A突变，能够有效地检测本发明的MYL4基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患心房静止，进一步，能够从待测者中筛选出易患心房静止的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种分离的编码MYL4突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.31G>A突变。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.Glu11Lys突变。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

5.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码MYL4突变体的核酸。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求5所述的构建体转化受体细胞而获得的。