CN104450727A - X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因及其编码蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了与X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病相关的显性致病基因-PHEX基因的新发突变。具体地，发明人以X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病患病家系为研究对象，对该家系中的患病个体和非患病个体进行了外显子组测序和比较，意外地在PHEX基因中发现一个移码缺失突变(c.1553delT,p.F518Sfs*4)，该突变造成其编码的蛋白质的翻译错误并提前中断。在此基础上，本发明提供了突变的PHEX基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的PHEX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。利用该突变的PHEX基因，可以对X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病进行分子诊断和患病风险评价。该突变基因及其编码蛋白质还可作为治疗该类X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点。

Description

X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及一种人体变异的基因，尤其涉及一种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因-PHEX基因。本发明还涉及突变的PHEX基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的PHEX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。

背景技术

低磷酸盐血症性佝偻病(hypophosphatemic rickets，HR)为家族性的或罕见为获得性的疾病，它与一般佝偻病不同，其发病原因是由于肾小管对磷的再吸收障碍，从而血磷下降，尿磷增多，肠道对磷、钙的吸收不良而影响骨质钙化，形成佝偻病。其临床特点主要包括身材矮小、佝偻病、低磷血症、近端肾小管重吸收磷障碍以及活性维生素D生成不足等。女性患者骨骼疾病较男性为轻，可仅表现为低磷酸盐血症。HR目前发现主要有四种家系遗传模式，包括X-连锁显性遗传HR(XLHR,MIM 307800),常染色体显性遗传HR(ADHR,MIM 193100)，常染色体隐性遗传HR(ARHR1,MIM241520,以及ARHR2,MIM613312)，罕见的X-连锁隐性遗传HR(300554)。至今为止，HR已经发现7个易感基因和6个致病基因。

其中，X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病(XLHR)是最常见的遗传性佝偻病，发病率约为1:12000，典型特征为肾小管重吸收磷减少、活性维生素D生成不足以及骨矿化不全。该病多发生于儿童，主要临床表现为双下肢弯曲、走路无力、腿痛、骨质疏松、生长迟缓以及多发性骨折。该病在儿童阶段表现为佝偻病，在成人阶段则表现为骨关节畸形。尽管可以通过手术的方式予以改善症状，但手术治疗会给患儿家庭带来沉重的经济负担，疗效也因人而异，严重影响患者的生活质量。所以，只有明确其基因突变特点，才能从遗传筛查和基因诊断及治疗入手，避免患儿出生，纠正遗传缺陷，最终从根本上解决问题。

XLHR遗传方式多属X连锁显性遗传，其致病基因是位于X染色体上的PHEX基因((磷酸盐调节基因，可参见Holm IA,Huang X,Kunkel LM.Mutational analysis of the PEX gene in patients with X-linkedhypophosphatemic rickets[J].Am J Hum Genet,1997,60(4):790-797)。该基因位于染色体Xp22.1，包含2247bP跨22个外显子的编码区，编码一条由749个氨基酸构成的蛋白质。最初该基因被认为可以导致调节磷平衡的FGF23失活，PHEX蛋白分为N末端的胞质区，很小的跨膜区和大部分的细胞外区，其中在细胞外区有高度保守的半胱氨酸残基和在17号编码区的Zn结合区。该蛋白属于II型整合膜锌依赖性肽链内切酶家系，参与骨和牙本质矿化以及肾磷酸盐吸收(可参见：Morey M,PHEXro-Feijoo L,Barreiro J et al.Genetic diagnosis of X-linked dominant Hypophosphatemic Rickets in a cohortstudy:tubular reabsorption of phosphate and 1,25(OH)2D serum levels areassociated with PHEX mutation type.BMC Med Genet 2011:12:116；Carpenter TO,Imel EA,Holm IA et al.A clinician's guide to X-linkedhypophosphatemia.J Bone Miner Res 2011:26:1381-1388)。PHEX在鼠骨、鼠牙、人类胎儿骨、人肺和成人卵巢都是表达PHEX/Phex的mRNA，以骨和牙齿的表达水平最高。PHEX基因导致低磷血症的机制目前尚不清楚，其中一种解释为该基因突变导致另一种酶代偿性上调，此酶的过度表达最终导致了XLHR的表型特征(可参见：任利彬，叶玲.X连锁磷酸盐调节基因的进展[J].国际口腔医学杂志，2008,35(4):399-401)。据文献报道，芬兰地区的PHEX基因的突变检测率在家系病例中为100％(5/5)，在散发病例中为93％(14/15)；中国台湾汉族人当中PHEX基因的突变检测率在家系中为100％(3/3)，在散发病例中为43％(3/7)(可参见Tyynismaa H,Kaitila I,Nanto-Salonen K,Ala-Houhala M,Alitalo T.Identification of fifteen novelPHEX gene mutations in Finnish patientswith hypophosphatemic rickets[J].Hum Mutat,2000,15(4):383-384；Jap TS,Chiu CY,Niu DM,Levine MA.Three novel mutations in the PHEX gene in Chinese subjects withhypophosphatemic rickets extends genotypic variability[J].Calcified Tissue Int,2011,88(5):370-377)。目前已发现在PHEX基因编码区的突变有329个,包括终止突变、错义突变、缺失和/或插入、拼接位点突变(www.phexdb.mcgill.ca)。

最近，外显子组测序(exome sequencing)被成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如Freeman–Sheldon综合症的MYH3基因，Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62突变等(可参见：A.Hoischen,B.W.van Bon,C.Gilissen,P.Arts,B.van Lier,M.Steehouwer,P.de Vries,R.de Reuver,N.Wieskamp,G.Mortier,K.Devriendt,M.Z.Amorim,N.Revencu,A.Kidd,M.Barbosa,A.Turner,J.Smith,C.Oley,A.Henderson,I.M.Hayes,E.M.Thompson,H.G.Brunner,B.B.de Vries,J.A.Veltman,De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome,NatGenet 42(2010)483-485；K.Bilguvar,A.K.Ozturk,A.Louvi,K.Y.Kwan,M.Choi,B.Tatli,D.Yalnizoglu,B.Tuysuz,A.O.Caglayan,S.Gokben,H.Kaymakcalan,T.Barak,M.Bakircioglu,K.Yasuno,W.Ho,S.Sanders,Y.Zhu,S.Yilmaz,A.Dincer,M.H.Johnson,R.A.Bronen,N.Kocer,H.Per,S.Mane,M.N.Pamir,C.Yalcinkaya,S.Kumandas,M.Topcu,M.Ozmen,N.Sestan,R.P.Lifton,M.W.State,M.Gunel,Whole-exome sequencing identifies recessiveWDR62 mutations in severe brain malformations,Nature 467(2010)207-210；S.B.Ng,E.H.Turner,P.D.Robertson,S.D.Flygare,A.W.Bigham,C.Lee,T.Shaffer,M.Wong,A.Bhattacharjee,E.E.Eichler,M.Bamshad,D.A.Nickerson,J.Shendure,Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 humanexomes,Nature 461(2009)272-276)。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体(包括患者及正常对照)的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。

因此，本研究利用外显子组测序技术区寻找X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病(XLHR)的致病基因，以期为XLHR的患者治疗提供全新的理论依据，丰富和完善XLHR疾病的诊断流程，从而对XLHR患者的临床诊断提供更多的支持和参考。

发明内容

本发明的主要目的在于利用外显子组测序技术鉴别X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病(XLHR)致病基因新的突变位点。在此基础上，提供突变的PHEX基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的PHEX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒，以对X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病进行分子诊断和患病风险评价，为进一步治疗该病提供设计药物的靶点，同时为阐明该病的致病机制提供理论基础。

因此，一方面，本发明提供了一种突变的PHEX基因，所述突变的PHEX基因导致X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的发生，其基因序列如SEQ IDNO:2所示。野生型PHEX基因序列如SEQ ID NO:1所示，编码区具有2250个碱基，与野生型的PHEX基因序列相比，该突变的PHEX基因发生了移码缺失突变(c.1553delT,p.F518Sfs*4)，即SEQ ID NO:1中第1553位后面紧接着的碱基T缺失了，只有2249个碱基，导致了第1553位后所有的碱基序列发生移码。从而使得PHEX基因编码的氨基酸序列第518位的苯丙氨酸变成了丝酰胺，第518位以后的氨基酸序列也发生改变，直至第521位亮氨酸密码子突变为终止密码子，使得多肽链合成中断。

第二方面，本发明还提供了SEQ ID NO:2序列编码的蛋白质，由于突变的PHEX基因在第1553位后发生了移码缺失突变，导致其编码的氨基酸序列从518位发生变化，到第521位即终止，使得突变的PHEX蛋白质只有520个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。而野生型的PHEX蛋白质序列有749个氨基酸，比突变型的PHEX蛋白质序列长得多。

在本发明的第三方面，提供了含有上述突变PHEX基因的载体。

在本发明的第四方面，提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或者被上述突变的PHEX基因直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了上述的突变的PHEX基因在作为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点或制备X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病诊断试剂盒中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种用于诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性扩增PHEX基因的引物，或能够特异性检测PHEX基因突变的探针。

在一个优选的实施方案中，所述引物或探针序列为SEQ ID NO:1或2所示的序列中第1553位前后15～30bp长的序列。

在一个优选的实施方案中，所述引物包括上游引物5’-AGTTGCTCCTTCCTATGCTGA-3’，下游引物5’-AGACTCCGCTTCTCACCAAT-3’。

在本发明的第七方面，提供了一种抗体，所述抗体与上述SEQ ID NO:2序列编码的蛋白质特异性结合，且不作用于野生型PHEX基因所编码的蛋白质。

在本发明的第八方面，提供了一种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病治疗剂，所述治疗剂包含上述所述的抗体。

本发明通过外显子组测序技术首次发现了PHEX基因的新发突变，且有此突变的PHEX基因可以导致X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的发病。一方面，为XLHR的发病机制研究奠定重要基础，有可能为XLHR的患者治疗提供全新的理论依据，丰富和完善XLHR疾病的诊断流程，从而对XLHR患者的临床诊断提供更多的支持和参考；通过检测受试者是否携带有PHEX基因致病突变，可以早期筛查X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病突变基因携带者，提供优生优育指导；也可为X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病患者提供新的分子诊断依据。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病。另一方面，本发明可以为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病提供可能的药物靶点。

附图说明

图1是某4代X染色体显性遗传XLHR家系图，其中正方形表示男性，圆圈表示女性；带斜线表示死亡，实心为患病个体，空心为正常个体；

图2为图1所示家系中正常人(III:3)sanger图；

图3为图1所示家系中患者(III:1)杂合p.F518Sfs*4突变sanger图；

图4为图1所示家系中(IV:2)杂合p.F518Sfs*4突变sanger图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围以权利要求书限定的范围为准。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本发明中，“PHEX基因”为磷酸盐调节基因，其基因表达6.6kb转录子，2247bp编码序列仅PHEX基因mRNA的35％，剩余65％为非编码序列(UTRS)。PHEX和中性肤链内切酶基因家族有高度的同源性，其家族包括中性肤链内切酶、Kell抗原及内皮素转换酶1等。小鼠骨、小鼠牙齿、人胎儿骨、人肺及成人卵巢都表达Phex/PHEX mRNA，在骨及牙齿检测到相对高水平的表达。PHEX的生理学相关底物还没有被确切鉴定出，PHEX蛋白质在调节磷酸盐、维生素D及骨矿物代谢的作用机制是未知的。对PHEX基因突变的研究，国外学者大多发现了一系列PHEX基因的突变，包括无义突变、错义突变、拼接突变、插入及缺失。经预测检测到的大部分PHEX突变可能导致截短的PHEX蛋白质产物，部分为单个氨基酸改变的错义突变，经预测可能改变了高度保守的氨基酸。1999年Filisetti等人也报导了在15外显子及17外显子有高密度的突变。除这一丛外，没有检测出其它的突变/热点。推测多数突变可能导致PHEX蛋白质翻译后修饰的方式及二级结构的改变。

在本发明中，术语“外显子”是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。

在本发明中，术语“外显子捕获”与“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。

在本发明中，“高通量测序”是指采用三种第二代测序平台进行高通量测序：454FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。

在本发明中，术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。

在本发明中，术语“突变”是指野生型的PHEX多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。在本发明中，变异体通过缺失野生型基因序列的第1553位的T来实现。

本发明还涉及与所述的PHEX核苷酸杂交且两个序列之间具有至少80％，较佳地至少90％，更佳地至少95％，至少99％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明野生型或突变型PHEX核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明中，“载体”包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的PHEX基因可操作地连接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所述载体任选地还包含选择标记。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。

本发明还涉及到PHEX突变蛋白质，由于在SEQ ID NO:l所示核苷酸序列中第1553位缺失了T，使得PHEX基因编码的氨基酸序列第518位的苯丙氨酸变成了丝酰胺，第518位以后的氨基酸序列也发生改变，直至第521位亮氨酸密码子突变为终止密码子，使得多肽链合成中断，本发明的PHEX突变蛋白质具有SEQ ID NO:3所示的序列，与野生型PHEX氨基酸序列的不同之处为只有520个氨基酸，缺失了后部分的229个氨基酸，因此不具有PHEX蛋白质正常的功能。本发明的PHEX突变蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质，即使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

在本发明中，PHEX突变蛋白质还涉及具有与PHEX突变蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。变异形式包括:同源序列、保守性变异体、诱导突变体等。发明还涉及PHEX突变蛋白质类似物。这些类似物与PHEX突变蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。

本领域技术人员公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本发明提供的突变PHEX基因的用途包括但不限于：用作治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点；制备X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的诊断试剂盒中；用于产生疾病动物模型；为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病提供新的药物作用途径。

本发明所述的“试剂盒”是指本领域技术人员以PHEX野生型或突变型核苷酸为基因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸序列，因此使用这种试剂盒可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒一般包括：引物、探针、核酸芯片、说明书等，还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增PHEX基因是指，在PCR反应中引物只扩增PHEX基因，而不扩增其他基因，此类引物的设计是本领域技术人员公知的。

在本发明中，术语“特异性检测PHEX基因突变的探针”是指探针能够区分出含有突变的PHEX基因基因与不含有突变的PHEX基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，与PHEX基因精确互补的探针可以与不含有突变的PHEX基因基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的突变的PHEX基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的PHEX基因基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的PHEX基因杂交，而不与不含有突变的PHEX基因杂交。在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。

本发明涉及对突变的PHEX蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于突变的PHEX蛋白质。较佳地，指那些能与突变的PHEX蛋白质产物或片段结合但不识别和结合于野生型的PHEX蛋白质相关抗原分子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab，或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

本发明的突变的PHEX蛋白质抗体可以用来鉴定突变的PHEX蛋白质。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记突变的PHEX蛋白质特异抗体，然后让突变的PHEX蛋白质特异抗体与样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突变的PHEX蛋白质特异抗体结合的样品，从而为预测或诊断患者是否存在X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病提供依据和指导。

本发明的突变的PHEX蛋白质抗体还可以用来中和突变的PHEX蛋白质。如果有足够的数据表明某个体的X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病与本发明突变PHEX蛋白质的存在相关，可以考虑用突变的PHEX蛋白质特异性抗体中和这些致病突变PHEX蛋白质分子，从而缓解患者的病症。

实施例1：样本获取

发明人近几年在国内收集到一个XLHR的家系，共4代17个汉族家系成员(如图1所示)，疾病诊断基于低磷酸盐血症性佝偻病的家族史，临床和生化指标以及影像学证剧，结合我们所收集到的家族性病例，提示XLHR的可能性较大。在家系中选取四例患者样本(II:1,III:1,IV:1和IV:2)、五例正常家系样本(II:2,III:2,III:3,III:5和III:7)共九例样本作为研究样本，每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80℃保存。

随机收集500位无关正常个体作为二次验证样本，每位采集外周血样品2ml,加入EDTA抗凝，-80℃保存。

实施例2：样本DNA制备

采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA,提取步骤如下：

(1)取2ml全血样本，加入150ul OB Protease，2.1ml Buffer BL和20ulRNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。

(2)65℃水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。

(3)加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。

(4)将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(6)加入3ml HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(9)4000转离心15分钟，甩干过滤柱。

(10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(12)利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7～2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。

实施例3：外显子捕获与测序

发明人采用NimbleGen SeqCap EZ Exome Library V2结合Solexa高通量测序技术对选取的实施例1的样本(IV:1)的外显子组序列进行了测序和数据分析，具体如下：

1)将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

2)文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR))的线性扩增与SeqCap EZ Oligo pool进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp,每个样本的平均测序深度最少为50×。

3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20#比对参考基因组Hg19(参考Li R,Li Y,KristiansenK,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,et al,SOAP2:animproved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009，25(15):1966-1967，通过参考的方式将其全文并入本文)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAP snp(可参见:Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genomeresequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132，通过参考的方式将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。Indel(insertion-deletion，插入/缺失标记)采用BWA(通过Burrows-Wheeler变换比对)(version 0.5.9-r16)比对到参考基因组Hg19(snp132)，然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit)(versionv1.0.4705)确定indel的类型。(可参见Li H,Durbin R.Fast and accuratelong-read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics 2010；26(5):589-595；McKenna,A,Hanna M,Banks E,et al.The genome analysistoolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNAsequencing data.Genome Research 2010；20(9):1297-1303)。

结果，在患者(IV:1)中发现有113054个单核苷酸多态性(SNPs)和11889处的插入/缺失，随后对结果通过dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi),千人基因组数据库(www.1000genomes.org/),HapMap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知变异和影响蛋白功能较小的位点(包括intron，intergenic，UTR，同义突变)，并利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到59个杂合可能具有致病意义的SNP位点和23个Indel。

实施例4：Sanger法测序验证

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步利用Sanger测序法，对上述59个杂合可能具有致病意义的SNP位点和23个Indel进行验证。分别对实施例1中的4名患者、5名家系内正常人和500名家系外正常人基因进行检测，针对PHEX基因的外显子序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得PHEX有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证PHEX与XLHR疾病之间相关性。具体方法步骤如下：

1.DNA提取

采集4名患者、5名家系内正常人和500名家系外正常人的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。

2.引物设计及PCR反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体见下。

引物序列：

外显子	上游引物(5’→3’)	下游引物(5’→3’)
			Exon8	AGTTGCTCCTTCCTATGCTGA	AGACTCCGCTTCTCACCAAT

反应体系：

反应条件：

3.DNA测序

将获得的PCR扩增产物用QIAquick PCR扩增试剂盒(Qiagen公司)进行纯化，然后进行DNA测序。

发明人利用Sanger测序方法，对59个杂合可能具有致病意义的SNP位点以及23个Indel进行验证，结果仅有1个Indel为真正的致病位点，即PHEX基因的移码缺失突变(c.1553delT,p.F518Sfs*4)，该突变导致PHEX蛋白发生移码突变。通过家族中疾病共分离和正常人SNP筛查，患者均为携带相应的移码缺失突变，其正常家属均不携带该致病突变，因此发明人认为该移码缺失位点是XLHR的另一致病位点。Sanger测序结果如图2～图4所示。

实施例5：体外检测XLHR患者的PHEX基因的试剂盒

为了检测其它XLHR家系该基因的致病突变，可以设计该基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列。在该实施例中，试剂盒引物和扩增测序条件如实施例4。

1、试剂盒组成：

引物：如实施例4所示；

Taq酶

缓冲液

dNTP

从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard GenomicDNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物进行纯化；

(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

(5)对BiyDye反应产物纯化；

(6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

Claims (10)

1.一种突变的PHEX基因，其特征在于：所述突变的PHEX基因导致X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的发生，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种如权利要求1所述的突变的PHEX基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求1所述的突变的PHEX基因。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为权利要求3所述的载体转化或转导的宿主细胞。

5.如权利要求1所述的突变的PHEX基因在作为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点或制备X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病诊断试剂盒中的应用。

6.一种用于诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含能够特异性扩增PHEX基因的引物，或能够特异性检测PHEX基因突变的探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述引物或探针序列为SEQ ID NO:1或2所示的序列中第1553位前后15～30bp长的序列。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述引物包括上游引物5-AGTTGCTCCTTCCTATGCTGA-3’，下游引物5-AGACTCCGCTTCTCACCAAT-3’。

9.一种抗体，其特征在于：所述抗体与权利要求2所述的蛋白质特异性结合，且不作用于野生型PHEX基因所编码的蛋白质。

10.一种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病治疗剂，所述治疗剂包含权利要求9所述的抗体。