CN103275987A

CN103275987A - Aqp5基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN103275987A
Application number: CN2013102420949A
Authority: CN
Inventors: 戴兰兰; 张建国; 蒋慧; 杨勇; 林志淼; 曹旭; 汪建; 杨焕明
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Huada medical laboratory Co.,Ltd.; TIANJIN BGI MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103275987B

Abstract

本发明公开了AQP5基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码AQP5突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统，以及用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码AQP5突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。

Description

AQP5基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及AQP5基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码AQP5突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统，用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。

背景技术

掌跖角化症（Palmoplantar keratoderma，PPK）是一种遗传异质性较强的疾病，临床特点表现为是手掌和脚底表皮增厚。根据临床表型，可将掌跖角化症分成4个亚型：弥漫型、点状、片状、条纹型。弥漫性掌跖角化症可被进一步细分成表皮松懈和非表皮松懈型掌跖角化症。其中一种非表皮松懈掌跖角化症被称为Bothnia型掌跖角化症（PPK type Bothnia，PPKB），这种病最初在两个瑞典家庭中被发现，并被导报在瑞典Bothnia一带流行发病，在两个瑞典城市的流行率高达0.3%到0.55%。PPKB的临床特点包括：弥漫性，表型一致，掌跖角化过度伴角质层肿胀，其中PPKB一个独特的临床表征为：接触水后角质层呈现白色海绵状外观。

PPKB是一种常染色体显性遗传模式疾病，前期通过遗传连锁分析和定位克隆研究，科学家已成功定位到一个14-cM的区域，12q11-12q13。但是，截至目前，PPKB的致病基因仍无报道。

因而，目前对Bothnia型掌跖角化症的研究尤其是致病基因的确定仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：发明人通过外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了Bothnia型掌跖角化症的一个致病基因及其突变——AQP5基因的c.367A>T突变。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AQP5突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变，即相对于野生型AQP5基因，本发明的AQP5基因突变体的第367位碱基从A突变为T。根据本发明的实施例，发明人确定了AQP5基因的突变体，该突变体与Bothnia型掌跖角化症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.N123Y突变，即该突变是由于c.367A>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型AQP5，本发明的分离的多肽（即AQP5突变体）的第123位N突变为Y。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变是所述生物样品易患Bothnia型掌跖角化症的指示。通过根据本发明实施例的筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.367A>T突变，判断所述生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测AQP5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该AQP5基因突变体具有c.367A>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码AQP5突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗Bothnia型掌跖角化症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗Bothnia型掌跖角化症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的Bothnia型掌跖角化症患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，Bothnia型掌跖角化症患者家系中患者及家系内正常人，以及家系外正常人的AQP5基因c.367A>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

AQP5基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AQP5突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变。在本文中所使用的表达方式“编码AQP5突变体的核酸”，是指与编码AQP5突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与AQP5突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码AQP5突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了AQP5基因的突变体，该突变体与Bothnia型掌跖角化症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患Bothnia型掌跖角化症。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码AQP5突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的Bothnia型掌跖角化症的致病基因AQP5及其致病突变。该致病基因及致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型AQP5基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGAAGAAGGAGGTGTGCTCCGTGGCCTTCCTCAAGGCCGTGTTCGCAGAGTTCTTGG

CCACCCTCATCTTCGTCTTCTTTGGCCTGGGCTCGGCCCTCAAGTGGCCGTCGGCGCTG

CCTACCATCCTGCAGATCGCGCTGGCGTTTGGCCTGGCCATAGGCACGCTGGCCCAGG

CCCTGGGACCCGTGAGCGGCGGCCACATCAACCCCGCCATCACCCTGGCCCTCTTGGT

GGGCAACCAGATCTCGCTGCTCCGGGCTTTCTTCTACGTGGCGGCCCAGCTGGTGGGC

GCCATTGCCGGGGCTGGCATCCTCTACGGTGTGGCACCGCTCAATGCCCGGGGCAATC

TGGCCGTCAACGCGCTCAACAACAACACAACGCAGGGCCAGGCCATGGTGGTGGAGC

TGATTCTGACCTTCCAGCTGGCACTCTGCATCTTCGCCTCCACTGACTCCCGCCGCACC

AGCCCTGTGGGCTCCCCAGCCCTGTCCATTGGCCTGTCTGTCACCCTGGGCCACCTTGT

CGGAATCTACTTCACTGGCTGCTCCATGAACCCAGCCCGCTCTTTTGGCCCTGCGGTG

GTCATGAATCGGTTCAGCCCCGCTCACTGGGTTTTCTGGGTAGGGCCCATCGTGGGGG

CGGTCCTGGCTGCCATCCTTTACTTCTACCTGCTCTTCCCCAACTCCCTGAGCCTGAGT

GAGCGTGTGGCCATCATCAAAGGCACGTATGAGCCTGACGAGGACTGGGAGGAGCAG

CGGGAAGAGCGGAAGAAGACCATGGAGCTGACCACCCGCTGA(SEQ ID NO：1)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MKKEVCSVAFLKAVFAEFLATLIFVFFGLGSALKWPSALPTILQIALAFGLAIGTLAQALGP

VSGGHINPAITLALLVGNQISLLRAFFYVAAQLVGAIAGAGILYGVAPLNARGNLAVNAL

NNNTTQGQAMVVELILTFQLALCIFASTDSRRTSPVGSPALSIGLSVTLGHLVGIYFTGCSM

NPARSFGPAVVMNRFSPAHWVFWVGPIVGAVLAAILYFYLLFPNSLSLSERVAIIKGTYEP

DEDWEEQREERKKTMELTTR(SEQ ID NO：2)。

本发明的AQP5基因突变体的cDNA序列如下所示：

ATGAAGAAGGAGGTGTGCTCCGTGGCCTTCCTCAAGGCCGTGTTCGCAGAGTTCTTGG

CCACCCTCATCTTCGTCTTCTTTGGCCTGGGCTCGGCCCTCAAGTGGCCGTCGGCGCTG

CCTACCATCCTGCAGATCGCGCTGGCGTTTGGCCTGGCCATAGGCACGCTGGCCCAGG

CCCTGGGACCCGTGAGCGGCGGCCACATCAACCCCGCCATCACCCTGGCCCTCTTGGT

GGGCAACCAGATCTCGCTGCTCCGGGCTTTCTTCTACGTGGCGGCCCAGCTGGTGGGC

GCCATTGCCGGGGCTGGCATCCTCTACGGTGTGGCACCGCTCAATGCCCGGGGCAATC

TGGCCGTCAACGCGCTCTACAACAACACAACGCAGGGCCAGGCCATGGTGGTGGAGC

TGATTCTGACCTTCCAGCTGGCACTCTGCATCTTCGCCTCCACTGACTCCCGCCGCACC

AGCCCTGTGGGCTCCCCAGCCCTGTCCATTGGCCTGTCTGTCACCCTGGGCCACCTTGT

CGGAATCTACTTCACTGGCTGCTCCATGAACCCAGCCCGCTCTTTTGGCCCTGCGGTG

GTCATGAATCGGTTCAGCCCCGCTCACTGGGTTTTCTGGGTAGGGCCCATCGTGGGGG

CGGTCCTGGCTGCCATCCTTTACTTCTACCTGCTCTTCCCCAACTCCCTGAGCCTGAGT

GAGCGTGTGGCCATCATCAAAGGCACGTATGAGCCTGACGAGGACTGGGAGGAGCAG

CGGGAAGAGCGGAAGAAGACCATGGAGCTGACCACCCGCTGA(SEQ ID NO：3)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MKKEVCSVAFLKAVFAEFLATLIFVFFGLGSALKWPSALPTILQIALAFGLAIGTLAQALGP

VSGGHINPAITLALLVGNQISLLRAFFYVAAQLVGAIAGAGILYGVAPLNARGNLAVNAL

YNNTTQGQAMVVELILTFQLALCIFASTDSRRTSPVGSPALSIGLSVTLGHLVGIYFTGCSM

NPARSFGPAVVMNRFSPAHWVFWVGPIVGAVLAAILYFYLLFPNSLSLSERVAIIKGTYEP

DEDWEEQREERKKTMELTTR(SEQ ID NO：4)。

发明人发现的AQP5基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变，即相对于野生型AQP5基因，本发明的AQP5基因突变体的第367位碱基从A突变为T。由此，其所编码的产物与野生型的AQP5相比，具有p.N123Y突变，即该突变是由于c.367A>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型AQP5，本发明的分离的多肽（即AQP5突变体）的第123位N突变为Y。

目前已知，水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的蛋白质（内在膜蛋白），在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的跨膜转运。AQP5在人体不可或缺的分泌腺，汗腺体中表达。人类干燥综合征的表征少汗症与AQP5的表达量降低有关。但是，目前尚未见AQP5突变与Bothnia型掌跖角化症相关的报道。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型AQP5相比，该分离的多肽具有p.N123Y突变，即该突变是由于c.367A>T的杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型AQP5，本发明的分离的多肽（即AQP5突变体）的第123位N突变为Y。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码AQP5突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患Bothnia型掌跖角化症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品AQP5是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中AQP5是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含AQP5编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集AQP5外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用AQP5外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集AQP5外显子，从而能够进一步提高筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，AQP5外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些AQP5外显子特异性引物具有SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列：

上游引物：GGAAAAGCTACCCTGACGCT（SEQ ID NO：5）；

下游引物：GGGAGTGGACCAGGATGTTG（SEQ ID NO：6）。

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中通过显著有效地完成对AQP5外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应AQP5的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.367A>T突变，则指示生物样品易患Bothnia型掌跖角化症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集AQP5外显子，进一步提高筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有AQP5外显子特异性引物，以便利用AQP5外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，AQP5外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.367A>T突变，判断生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变，是生物样品易患Bothnia型掌跖角化症的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ IDNO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒包括：适于检测AQP5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该AQP5基因突变体具有c.367A>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测AQP5基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测AQP5编码基因的试剂，也可以是检测AQP5突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码AQP5突变体的核酸，即本发明的AQP5基因突变体。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗Bothnia型掌跖角化症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的AQP5基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗Bothnia型掌跖角化症的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定PPKB致病突变

1、样本收集

发明人收集到一个中国汉族族三代Bothnia型掌跖角化症（在本文中有时也简称为PPKB）患者家系，其家系图见图2。如图2所示，其中，○表示正常女性，

表示男性患者，●表示女性患者，

表示表现正常的已逝男性，

表示已逝女性患者，箭头所指为先证者（III-14）。

由图2可知，该家系目前共有23个成员，其中PPKB患者10名。

其中，先证者III-14主要表现为3年来手掌和脚底进行性增厚，温和的掌跖手汗症在冬天尤为突出，且患有真菌感染引起的复发性脚癣和甲癣。检查时发现，其手掌和脚底粗糙，甚至存在黄色斑块，在手背和脚背有一个清晰的界限，暴露于水中不到一分钟，角质层就膨胀呈现出一个白色海绵状的外观。皮肤样本组织病理学发现，其手背皮肤正常角化，在真皮成上部存在淋巴细胞浸润性轻度炎症。此外，该PPKB患者家系中所有患者都存在相同的临床表现，且在该家族中疾病呈常染色体显性遗传。

发明人收集获得上述PPKB患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、全外显子组测序

发明人利用NimbleGen SeqCap EZ Exome(64M)结合Solexa高通量测序技术，对上述PPKB患者家系中的两名患者（III-14、III-9）和一名家系内正常人（III-8）的AQP5基因的外显子区域序列进行了测序。

具体如下：

2.1DNA提取

采集图2所示PPKB患者家系中的两名患者（III-14、III-9）和一名家系内正常人（III-8）的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均应位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于3微克。

2.2外显子捕获与测序

利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为50×。

3、变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到UCSC人类参考基因组（hg19,build37.1，http://genome.ucsc.edu/)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallelwhole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，在这些样本中，发明人发现：患者III-14的DNA样品中有136560个单核苷酸多态性（SNPs）和11071处的插入/缺失；患者III-9的DNA样品中有147730个单核苷酸多态性（SNPs）和11722处的插入/缺失；家系内正常人III-8的DNA样品中有147665个单核苷酸多态性（SNPs）和11773处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp135.txt.gz.）、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）、千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp）、炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

然后根据遗传模式是常染色体显性且假设为全外显率的情况下，选择在两个患者中存在，而在家系内正常人中不存在的罕见杂合突变作为候选基因。结果，只有两个突变AQP5和SLC4A8基因存在于前期研究定位的区域12q11-12q13内。Sanger验证证明这两个突变都真实的存在于2个患者中，但只有AQP5基因中的杂合错义突变(c.367A>T,p.N123Y)在上述的PPKB家系的23个家族成员中存在共分离，并且在300例家系外正常人群中不存在该突变。

水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的蛋白质（内在膜蛋白），在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的跨膜转运。AQP5在人体不可或缺的分泌腺，汗腺体中表达。人类干燥综合征的表征少汗症与AQP5的表达量降低有关。相应的，发明人假设AQP5中p.N123Y突变可能会增强汗腺的表达或者获得一个获得性汗腺功能的影响。发明人首先在先证者和其同龄正常人中对AQP5的表达模式进行了比较。发明人对取自先证者背部和对照手部的石蜡切片利用专一结合AQP5的单克隆抗体（生产自英国剑桥Abcam公司）进行了免疫组织化学染色试验。结果，发明人观测到先证者和对照的AQP5在汗腺中的表达或分布没有差别。

随后，发明人对野生型AQP5(wtAQP5)和突变AQP5（N123Y）进行了功能性研究。包含人AQP5整个编码区的cDNA克隆购自Origene公司（美国，罗克维尔），然后被克隆到pIRES2-EGFP载体上，载体购自美国Rockville的Clontech公司。AQP5N123Y突变使用的是定点突变系统(快速突变系统，试剂盒生物技术，北京，中国)，HEK293细胞系被瞬时转染了带有1微升lipofectamine2000（美国Carlsbad市的Invitrogen公司）转染液的质粒。首先发明人研究了分别表达wtAQP5或AQP5N123Y的HEK293转染细胞在低渗溶液诱导下（HTS）的细胞肿胀现象（通过绿色荧光测定）。结果，与表达wtAQP5的细胞相比，HTS让表达AQP5N123Y的HEK293细胞的细胞体积发生了更快和更大的增加（1.4倍），表明AQP5N123Y通道是泄漏的和/或者对低渗环境更敏感。

香草素受体亚家族4（TRPV4）是一种在多种组织（包括汗腺）表达的可渗透钙的阳离子通道。在生理上跟AQP5存在交互作用形成一个功能复杂的传感器，将渗透压胁迫和下游信号级联偶联起来。在这一条件下，TRPV4的激活取决于AQP5。如前面描述的，通过膜片钳技术，发明人设计了一个两步法来测试AQP5/TRPV4复合物对低渗溶液的功能改变。低渗溶液首先被用来诱导TRPV4的低渗激活，然后同样的细胞被置于300nM GSK1016790A溶液中诱导完全的激动剂激活。结果，发明人发现，在wtAQP5表达的情况下，TRPV4的基底活性增强。有趣的是，细胞中，相较于wtAQP5，AQP5N123Y的协同表达表现为增强TRPV4基底活动，此外，AQP5N123Y/TRPV4细胞表达中比wtAQP5/TRPV4或单纯TRPV4细胞表达的高温超导感生电流更强，更快。上述结果发明人获得了一个功能获得性的AQP5N123Y/TRPV4复合物。

综上所述，发明人认为，AQP5极有可能是PPKB的致病基因。

实施例2Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的Bothnia型掌跖角化症患者家系中的10名患者及13名家系内正常人，以及300名家系外正常人的AQP5基因进行检测：针对AQP5基因的的c.367A>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得AQP5有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证AQP5基因的c.367A>T突变与Bothnia型掌跖角化症之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到具有SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列的AQP5基因外显子特异性引物，具体序列见下表：

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。

结果，发明人发现，该Bothnia型掌跖角化症患者家系中患者均携带有AQP5基因的c.367A>T突变，而家系内正常人及300名家系外正常人均不携带该致病突变。其中，图3显示了上述Bothnia型掌跖角化症患者家系中患者及家系内正常人，以及家系外正常人的AQP5基因c.367A>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

由此，进一步证明AQP5基因为Bothnia型掌跖角化症的致病基因，AQP5基因的c.367A>T突变为该病的致病突变。

实施例3检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测AQP5基因的c.367A>T突变的引物，用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品，其中这些引物为AQP5基因外显子特异性引物，其序列如实施例1中所述SEQ ID NO：5-6所示。

利用上述试剂盒筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述AQP5基因的外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.367A>T突变，能够有效地检测本发明的AQP5基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患Bothnia型掌跖角化症，进一步，能够从待测者中筛选出易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种分离的编码AQP5突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.N123Y突变，

任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

3.一种筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本；

确定所述核酸样本的核酸序列；

所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.367A>T突变是所述生物样品易患Bothnia型掌跖角化症的指示，

任选地，所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，

任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括：

从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA；以及

基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括：

针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序，

任选地，针对所述核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：

利用AQP5基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及

针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库，

任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。

6.一种筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.367A>T突变，判断所述生物样品是否易患Bothnia型掌跖角化症，

任选地，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，

任选地，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有AQP5基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

8.一种用于筛选易患Bothnia型掌跖角化症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测AQP5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述AQP5基因突变体具有c.367A>T突变，

任选地，所述试剂为核酸探针或引物，

任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。

9.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码AQP5突变体的核酸。

10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受体细胞而获得的。