CN101928747A - E3泛素连接酶chip在脑胶质瘤疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，在胶质瘤组织中，CHIP主要表达在肿瘤细胞的胞浆中，与星形胶质细胞的标记蛋白GFAP共定位，且随级别的增高而表达增加；CHIP表达量升高后，Survivin的mRNA和蛋白表达均增加；CHIP表达量降低后，Survivin的mRNA和蛋白表达降低，β-catenin的蛋白表达增加。本发明通过免疫组织化学比较不同级别胶质瘤及正常脑胶质细胞中CHIP的表达情况，阐明了CHIP在胶质瘤发生、发展、增殖、侵袭过程中的作用及其病理机制，为今后胶质瘤的生物靶向治疗提供强有力手段。

Description

E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用 

技术领域

本发明涉及脑胶质瘤发病机制的研究领域，具体涉及一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用。 

背景技术

神经胶质瘤简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。神经外胚层发生的肿瘤有两类，一类由间质细胞形成，称为胶质瘤；另一类由实质细胞形成，称神经元肿瘤。由于从病原学与形态学上还不能将这两类肿瘤完全区别，而起源于间质细胞的胶质瘤又比起源于实质细胞的神经元肿瘤常见得多，所以将神经元肿瘤包括有胶质瘤中，统称为胶质瘤。 

胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一股为数周至数月，少数可达数年。恶性程度高的和后颅窝肿瘤病史较短，较良性的或位于静区的肿瘤病史较长。肿瘤若有出血或囊变，症状会突然加重，甚至有类似脑血管病的发病过程。胶质瘤的临床症状可分两方面，一是颅内压增高症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、精神症状等；另一是肿瘤压迫、浸润、破坏脑组织所产生的局灶症状，早期可表现为刺激症状如局限性癫痫，后期表现为神经功能缺失症状如瘫痪。 

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占成人颅内肿瘤的35％～60％，其中恶性胶质瘤约占70％，以胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤最为多见。恶性胶质瘤预后差，病死率高，即使手术切除后胶质瘤复发率仍高达70％～90％，5年生存率极低。胶质母细胞瘤与间变性胶质瘤的中位生存期分别只有12～15个月与2～5年。寻找能够改善胶质瘤临床疗效的新疗法是神经外科领域的研究热点。 

现有研究认为胶质瘤侵袭复发是受多种基因、蛋白以及细胞因子等共同调控的结果，这一过程可能涉及到肿瘤细胞粘附、基质降解、迁移、细胞增殖等诸多环节，但其具体机制仍不清楚。近年来，基于对胶质瘤分子机制逐步了解，靶向性分子治疗为胶质瘤治疗提供了新思路，寻找胶质瘤发生发展过程中的重要通路和靶标分子以及安全高效的靶向性载体系统显得尤为重要。 

泛素蛋白酶体通路是转录后调控的重要通路，是体内蛋白质的“质控”机关，包含泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)和26S蛋白酶体。CHIP蛋白由STUB1基因编码，是E3泛素连接酶家族中的一员，参与到多个重要蛋白的降解，但其在肿瘤领 域的研究报道甚少，仅限于乳腺癌。 

CHIP(carboxy terminus of Hsc70 interacting protein)是1999年被Ballinger等从心脏cDNA文库中发现的新蛋白^[1]。该蛋白N端存在3个TPR(tetratricopepdide repeat)结构，C端有1个U-Box结构，具有E3泛素连接酶的功能，能够在热休克蛋白的协助下通过泛素-蛋白酶体通路对一些蛋白进行泛素化降解，参与细胞内蛋白质的质量控制，进而调节细胞的生理或病理过程。近年来最新的研究表明CHIP在神经退行性疾病、心血管疾病及肿瘤等疾病的发展过程中起到了重要作用，CHIP参与细胞生理过程(包括调节凋亡相关通路、TGF-beta相关通路、调节Runx转录因子家族)，CHIP正在成为一个新的研究热点。既往研究认为：CHIP在脑组织中高表达，但其具体的表达定位，其与胶质瘤发生发展、增殖侵袭的关系，国际上无文献报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，通过免疫组织化学比较不同级别胶质瘤及正常脑胶质细胞中CHIP的表达情况，通过慢病毒构建RNA干扰和过表达的稳定载体，并利用裸鼠皮下成瘤模型，观察靶向CHIP慢病毒载体对胶质瘤的影响，阐明了CHIP在胶质瘤发生、发展、增殖、侵袭过程中的作用及其病理机制，为今后胶质瘤的生物靶向治疗提供强有力手段。 

本发明的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用。 

所述的E3泛素连接酶CHIP在正常脑组织中主要表达于神经元细胞的胞质中，在正常胶质细胞中未见表达；在胶质瘤组织中，CHIP的表达量随级别的增高而增加，与GFAP表达量呈负相关关系；在胶质瘤细胞系中，CHIP主要表达于肿瘤细胞的胞浆中，与星形胶质细胞的标记蛋白GFAP共定位。 

通过靶向CHIP的RNA干扰和过表达慢病毒载体的构建，干扰片段的干扰效率达到75％以上，过表达病毒载体能够提升CHIP的表达水平达70％以上。 

所述的E3泛素连接酶CHIP其表达量降低后，胶质瘤细胞的增殖能力减弱，克隆形成能力减弱；CHIP表达量上升后，胶质瘤细胞的增殖能力增强，克隆形成能力增强。 

所述的E3泛素连接酶CHIP表达量对细胞凋亡和细胞周期无显著影响。 

通过构建胶质瘤成瘤模型，在瘤体内注射干扰CHIP的慢病毒可以减缓肿瘤的增长速度，注射过表达CHIP的慢病毒可以促进肿瘤的增长。 

所述的E3泛素连接酶CHIP表达量升高后，survivin mRNA和其蛋白表达量均升高， β-catenin mRNA表达水平无显著变化，其蛋白表达量降低；CHIP表达量降低后，survivinmRNA和其蛋白表达量均降低，β-catenin mRNA表达水平无显著变化，其蛋白表达量升。 

与所述的E3泛素连接酶CHIP相关的其他下游分子Hsp90、Hsp70、Bcl-2、AKT、MMP-2表达量无显著变化。 

所述的E3泛素连接酶CHIP是一个促癌蛋白，且它的作用是通过调节Survivin和β-catenin的表达量来实现的。 

有益效果 

本发明通过免疫组织化学比较不同级别胶质瘤及正常脑胶质细胞中CHIP的表达情况，利用慢病毒构建RNA干扰和过表达的稳定载体，将其导入U251和U87两株胶质瘤细胞后，观察CHIP表达量改变对细胞增殖、侵袭、克隆形成等能力的影响及CHIP相关下游分子的表达变化，并利用裸鼠皮下成瘤模型，观察靶向CHIP慢病毒载体对胶质瘤的影响，阐明了CHIP在胶质瘤发生、发展、增殖、侵袭过程中的作用及其病理机制，为今后胶质瘤的生物靶向治疗提供强有力手段。 

附图说明

图1-1为扩增产物熔解曲线；其中，A：actin，B：STUB1； 

图1-2为actin和目的基因扩增产物胶图，上样顺序说明：1：U87；2：U251；M：Marker； 

图1-3为STUB1、β-actin在U251和U87细胞株中的扩增曲线； 

图1-4为STUB1 mRNA在U251和U87细胞株中的表达； 

图1-5为CHIP蛋白在胶质瘤细胞株中的表达； 

图2为CHIP与GFAP在胶质瘤细胞株U87中的双重免疫荧光染色； 

图3-1RNA干扰慢病毒载体构建流程图； 

图3-2目的基因真核表达载体构建流程图； 

图4为质粒DNA图谱； 

图5为真核表达载体信息图； 

图6-1为利用实时定量RT-PCR和WESTENBLOCK验证CHIP的RNA干扰和过表达效果； 

图6-2为U251慢病毒感染荧光图片×200倍；A阴性对照，B转染RNAi-1序列组，C转染RNAi-2序列组，D转染空病毒组； 

图6-3为U87慢病毒感染荧光图片×200倍；A阴性对照，B转染RNAi-1序列组，C转染RNAi-2序列组，D转染空病毒组； 

图7-1为靶向CHIP的RNAi和过表达病毒对胶质瘤细胞株U251和U87细胞增殖、克隆形成能力的影响；(A.U251细胞MTT结果，B.U251克隆形成实验结果，C.U87细胞MTT结果，D.U87细胞克隆形成结果)^*P＜0.01； 

图7-2为靶向CHIP的RNAi和过表达病毒对胶质瘤细胞株U251细胞周期、细胞凋亡的影响；(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组)； 

图7-3为靶向CHIP的RNAi和过表达病毒对胶质瘤细胞株U87细胞周期、细胞凋亡的影响；(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组)； 

图7-4为CHIP干扰和过表达病毒治疗裸鼠皮下成瘤模型后，肿瘤增长速率变化图(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组)； 

图7-5为靶向CHIP的RNAi和过表达病毒对胶质瘤细胞株U251和U87细胞下游分子蛋白表达量的影响(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组)； 

图7-6为靶向CHIP的RNA干扰和过表达对survivin表达量的影响(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组；图A，B：survivin mRNA水平变化；图C，D：survivin蛋白水平变化；^*P＜0.05)； 

图7-7为靶向CHIP的RNA干扰和过表达对β-catenin表达量的影响(Scr.转染空病毒组；OE.转染过表达病毒组；KD-1.转染RNAi-1序列组；KD-2.转染RNAi-2序列组；图A，B：β-catenin mRNA水平变化；图C，D：β-catenin蛋白水平变化.^*P＜0.05)。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1 

CHIP在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达及与病理级别的关系 

本实施例利用实时定量RT-PCR、免疫组化、免疫荧光等方法，研究CHIP在脑胶质瘤组织细胞株中的表达及其与病理级别的关系。 

材料与方法 

一、实验材料 

(一)组织标本 

选取上海长征医院2002-2009年手术切除、病理证实、石蜡包埋的脑胶质瘤组织20例，其中低级别胶质瘤10例(毛细胞型星形细胞瘤5例，弥漫性星形细胞瘤5例)，高级别胶质瘤10例(间变性星形胶质细胞瘤5例，胶质母细胞瘤5例)。石蜡包埋的正常脑组织5例。所有病理诊断及分级均由两位病理医生独立阅片确定。 

实验所用的U251和U87细胞株均购自ATCC，其特征已经鉴定。 

(二)主要实验药品及试剂 

RNAi so Trizol Reagen                                           Invitrogen公司 

SuperScript First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR试剂盒   Invitrogen公司 

SYBR Green qPCR Supermix-UDG试剂盒                              Invitrogen公司 

DEPC                                                    上海捷倍思生物科技公司 

PMSF                                                    上海捷倍思生物科技公司 

电泳级琼脂糖                                            上海捷倍思生物科技公司 

DTT                                                     上海捷倍思生物科技公司 

50bp，100bp DNA Marker Takara                                         生物公司 

引物                                                  上海基康生物工程有限公司 

免疫组化Envision二抗试剂盒                                        丹麦DAKO公司 

小鼠抗人β-actin单克隆抗体                                  美国Santa cruz公司 

BCA蛋白定量试剂盒                                               法国Pierce公司 

封闭用正常血清工作液                                  福建迈新生物技术有限公司 

DAB显色剂                                             福建迈新生物技术有限公司 

苏木素体细胞快速染液                                  福建迈新生物技术有限公司 

DAPI                                                     美国Sigma-Aldrich公司 

蛋白酶抑制剂Cocktail                                     美国Sigma-Aldrich公司 

β-巯基乙醇                                                   美国Sigma-Aldrich公司 

TEMED                                                         美国Sigma-Aldrich公司 

FITC标记兔抗小鼠二抗                                          美国Jackson公司 

TRITC标记兔抗山羊二抗                                         美国Jackson公司 

PVDF膜(0.22μm)                                               美国PALL公司 

ECL化学发光试剂国                                             Santa Cruz公司 

预染蛋白marker                                                美国Fermentas公司 

兔抗人CHIP多克隆抗体                                          美国Abgent公司 

小鼠抗人GFAP单克隆抗体                                        美国CST公司 

兔抗人GAPDH单克隆抗体                                         美国Santa Cruz公司 

兔抗人β-actin单克隆抗体                                      美国CST公司 

DAPI抗体                                                      美国CST公司 

二甲苯、无水乙醇、氯化钠、浓盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、Tris、甘氨酸、SDS、甲醇、冰乙酸等均为国产分析纯。 

(一)主要仪器和设备 

Milli-Q纯水器                                                 美国Millipore公司 

Olympus CX31光学显微镜                                        日本Olympus公司 

Leica RM-2135石蜡切片机                                       德国莱卡公司 

组织匀浆机                                                    德国海道夫公司 

Nikon ECLIPSE 55i荧光显微镜                                   日本Nikon公司 

BS210S型电子分析天平                                          德国Sartorius公司 

电热恒温水浴锅                                                日本Sanyo公司 

-80℃超低温冰箱                                               Revco Scientific公司 

Eppendorf 5810R低温离心机                                     德国Eppendorf公司 

Centrifuge 5415D台式高速离心机                                德国Eppendorf公司 

gradient PCR仪                                                    德国Eppendorf公司 

Rotor-Gene 3000实时荧光定量PCR仪                              澳大利亚Corbett Research公司 

台式FE20pH计                                                  梅特勒-托利多中国公司 

数码凝胶图像处理系统                                          上海复旦复日科技有限公司 

二、实验方法 

(一)免疫组化方法 

1、免疫组化主要试剂配制 

1)1×PBS缓冲液 

准确称取KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.48g，NaCl 8.0g，KCL 0.20g，加双蒸水1000ml，调pH值至7.3。高温高压消毒后冷却备用。 

1)20×TBS缓冲液 

1M Tris-HCL(pH 7.5)200ml，加NaCl 176g，去离子水定容至1000ml，高压灭菌。 

2)50×TAE电泳缓冲液 

242g Tris，57.1ml乙酸，3722gNa2EDTA·2H₂O，加H₂O至1000ml。 

3)DAB显色液 

取0.85ml蒸馏水，加入DAB溶液A，DAB溶液B和DAB溶液C各50ul(1-2滴)，充分混匀，即配即用。 

4)3％H₂O₂/70％甲醇 

取30％H₂O₂ 10ml，甲醇70ml定容至100ml。 

5)多聚赖氨酸溶液的配制 

取多聚赖氨酸原液5ml，加蒸馏水45ml，配制成1∶10的多聚赖氨酸溶液。 

6)免疫组化用载玻片的处理 

磨边玻片→重铬酸钾浸泡处理24h→自来水冲洗后加洗衣粉煮沸去油污→自来水漂洗干净一蒸馏水冲洗→置片夹上放烘箱内60℃烘干→多聚赖氨酸溶液包被5min→再置片夹上，于烘箱内60℃烘干备用。 

2、脑胶质瘤组织和正常脑组织的固定与处理： 

10％甲醛固定组织标本24h-水(4h)-50％乙醇(过夜)-70％乙醇(4h)-80％乙醇(4h)-90％-乙醇(4h)-95％乙醇(过夜)-100％乙醇(2h)-100％乙醇(2h)-二甲苯(15min)-二甲苯(15min)-一蜡(45min)-二蜡(45min)-三蜡(45min)。 

包埋好的组织固定于石蜡切片机，调节切片的厚度，约为4μm，将包含有完整组织的载玻片置于40℃温水中进行展片。每张载玻片捞上两张切片，以便对照。将载玻片水平置于55℃温箱中烘烤过夜。 

3、免疫组化染色(SP法)步骤： 

1)二甲苯脱蜡：二甲苯1(15min)，二甲苯2(15min)，二甲苯3(15min)； 

2)梯度水化：无水乙醇(5秒)×3，95％乙醇(5min)； 

3)1×TPBS洗(5min×3次)； 

4)微波修复：(92℃-98℃，12min)； 

5)自然冷却至室温，1×TPBS洗(5min×3次)；封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2/70％甲醇室温封闭30min； 

6)1×TPBS洗(5min×3次)； 

7)5-10％正常兔血清封闭液(室温，10min)；记号笔标记范围 

8)甩去多余液体(勿洗)； 

9)加合适稀释度一抗(1∶50)，4℃过夜； 

10)1×TBST洗(10min×3次)； 

11)加入二抗，37℃15min； 

12)1×TBST洗(10min×3次)；链霉素蛋白过氧化酶37℃15min；1×TPBS洗(5min×3次)； 

13)DAB显色(室温，镜下控制，约10-60s)； 

14)自来水洗； 

15)苏木素复染3min，盐酸酒精分化2s调节PH值； 

16)水洗返蓝(10min)； 

17)梯度乙醇脱水：95％乙醇(5秒)，无水乙醇(10秒)×3； 

18)二甲苯(5秒)×3； 

19)滴加中性树胶，盖玻片封片。 

4、免疫组化染色结果判断与分析 

本实验中，CHIP与GFAP均表达在胞浆内，以细胞核或胞浆呈黄色为阳性染色。以胞浆内出现棕黄色染色颗粒作为阳性细胞。所有切片均经2位经验丰富的临床病理医师分别光镜观察，每片随机选择5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞占所有细胞的百分比。判定标准：根据着色深浅程度及阳性细胞数量(％)，对表达强度进行半定量评估分级。 

(二)U251及U87细胞株的培养 

1、细胞株的冻存 

1)取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×10⁶～2×10⁷/ml。 

2)在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4℃1小时，-80℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。 

2、细胞复苏 

1)从液氮罐中取出细胞冻存管 

2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 

3)完全解冻后，1000rpm，离心2min 

4)70％酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 

5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO₂培养箱培养6)次日更换一次培养液后再继续培养 

3、细胞传代 

1)收集含细胞的培养基 

2)1000rpm，离心2分钟，轻轻倒掉上清 

3)加入1ml新鲜预热的完全培养基重悬 

4)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养 

5)收集细胞，抽提RNA，备用。 

(三)实时定量RT-PCR 

1、总RNA抽提 

说明：根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行，均为RNase-free操作。 

1)离心去细胞上清，每孔加入1000μl Trizol，吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5ml eppendorf管中。 

2)每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。 

3)4℃，12000rpm，离心15min。 

4)从每管中吸取上清至另一新的1.5ml eppendorf管。加入等体积异丙醇，混匀后4℃沉淀10min。 

5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清。 

6)加入至少1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。 

7)4℃，10000rpm离心5min，弃上清。 

8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)。 

9)加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。 

2、RNA逆转录获cDNA 

M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase-free的物品都购自Axygen。 

说明：根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行，均为RNase-free操作。 

1)将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O 至9ul。混匀后离心，70℃温浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火。 

2)按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液。 

3)在每个反应管中加入的11ul的RT反应液，混匀后离心。 

1)RT反应在42℃进行1hour后完成，之后用70℃处理10min使RT酶失活。 

2)得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。 

3、引物合成 

STUB1引物和actin引物采用软件Beacon designer 2设计，引物序列信息如下表所示，actin扩增条带为202bp；STUB1扩增条带为136bp。所有引物均由吉凯基因合成。 

4、Real-time PCR检测 

按下列比例配置反应体系： 

1)设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，15S，之后每一步变性95℃，5S， 退火延伸60℃，30S，共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。 

Cycle 1：(1X) 

Step 1：     95.0℃     for 00:15. 

Cycle 2：(45X) 

Step 1：     95.0℃     for 00:05. 

Step 2：     60.0℃     for 00:30. 

Data collection and real-time analysis enabled. 

2)制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4S，同时读取吸光值。 

Cycle 3：(1X) 

Step 1：     95.0℃            for 01:00. 

Cycle 4：(1X) 

Step 1：     55.0℃            for 01:00. 

Cycle 5：(81X) 

Step 1：     55.0℃-95.0℃     for 00:30. 

Increase set point temperature after cycle 2by 0.5℃ 

(四)Western blot蛋白印迹 

1、胶质瘤细胞蛋白的抽提 

1)收集6cm培养皿中的细胞至EP管：用0.25％胰蛋白酶消化后，冰PBS清洗2次，800rpm离心5分钟，弃上清。 

2)每管加入50ul预冷的RIPA缓冲液。 

3)轻弹管壁10余下，使细胞与RIPA缓冲液充分混匀，室温静置30min； 

4)加入4×上样缓冲液，煮沸20min； 

5)超声1s×15次； 

6)4℃，12000rpm离心20min，上清分装。 

2、实验步骤： 

1)灌制10％分离胶，从顶端注入1ml蒸馏水压平。待分离胶凝固后，倒去蒸馏水，吸水纸吸干残存液体。 

2)配制积层胶，插入梳子，避免混入气泡。待胶凝固后，垂直拔出梳子。 

3)取等量蛋白与4×上样缓冲液混合，煮沸4分钟后上样。根据测定的蛋白浓度，每孔加入等量蛋白，约50ug。 

4)电泳起始电压80V，待样品进入分离胶后调整电压为100V。待溴酚蓝条带距分离胶 底线约1cm时，终止电泳。 

5)在电泳将要结束之前，进行PVDF膜甲醇预处理，甲醇浸泡15s后，双蒸水浸泡4min，之后用电转移缓冲液浸泡PVDF膜、Whatman 3MM滤纸、垫层海绵和塑料夹板，裁出与胶同样大小的6张滤纸和1张PVDF膜。 

6)按下列顺序装好装置：负极-垫层海绵-3层滤纸-电泳胶-PVDF膜-3层滤纸-垫层海绵-正极，用玻璃棒轻柔均匀赶掉各层之间的气泡。在275mA恒定电流下，4℃电转移1小时。 

7)电转移结束后，把胶置于染色液中染色1～2小时，后置于脱色液中脱色完全，检查蛋白质转移是否完全。 

8)把PVDF膜置于丽春红S中震摇5-10min后用去离子水清洗脱色，查看是否有清的条带印迹。 

9)将PVDF膜置于封闭液中，室温下封闭1小时。 

10)分别用抗体稀释液稀释一抗，保鲜膜密封，4℃震摇过夜。 

11)洗膜：室温下1×TBST洗涤10分钟×3次。 

12)加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶2500)，水平摇床上室温孵    育2小时，1×TBST洗涤10分钟×3次。 

13)1∶1混合ECL A液与B液各0.5ml，将膜正面贴于ECL液上反应5min，暗室中作用于膜5分钟，膜蛋白面朝上，X光胶片曝光，显影，定影。 

14)蛋白条带的光密度值采用Image J软件测定。 

(五)免疫荧光(immunofluorescence) 

将生长状态良好的U87细胞接种于6孔板中盖玻片上，PBS清洗3遍，每遍5分钟，而后用4％的多聚甲醛室温固定20分钟。PBS清洗3遍后，用0.25％的Triton X-100透膜5分钟。PBS清洗3遍，在含有1％BSA的PBS溶液中室温封闭30分钟。相应一抗4℃过夜，清洗后加入FITC标记的二抗37℃孵育1小时。经过PBS清洗3遍后，加入Hoechest333422ug/ml，室温放置15分钟复染核，再次PBS清洗，Olympus(IX70)显微镜观察并拍照，图像采用MetaMorph软件处理。 

(六)统计学方法 

数据均以平均数±标准差形式表示。根据不同数据类型，符合方差分析条件的，使用方差分析one-way ANOVA进行比较；不符合方差分析条件的，采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05定义为差异有统计学意义。使用SPSS15.0进行统计学处理。 

结果 

一、CHIP蛋白在正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中的表达 

SP法免疫组化染色提示，在正常脑组织中，CHIP表达阳性的细胞胞体较大，有树突结构，符合神经元细胞的表现。CHIP主要表达在神经元细胞的胞浆内，染色强度较高，而在神经元周边的正常胶质细胞内未见阳性染色。在胶质瘤组织中，CHIP主要表达在肿瘤细胞的胞浆内，CHIP在10例低级别胶质瘤(WHO I-II级)和10例高级别胶质瘤(WHOIII-IV级)中内阳性细胞表达率分别是4.79±2.16％和15.48±6.12％，高低级别胶质瘤之间CHIP的表达量差异显著(4.79±2.16％VS 15.48±6.12％，P＜0.01)。CHIP在不同级别胶质瘤中的表达量与胶质纤维酸性蛋白GFAP呈明显的负相关关系(Sperman r＝-0.72，P＜0.01)。 

二、STUB1/CHIP在胶质瘤细胞株U251和U87中的表达 

(一)STUB1mRNA在胶质瘤细胞株U251和U87中的表达 

通过相对定量方法，检测U251和U87胶质瘤细胞中STUB 1的mRNA表达水平及其差异。通过对STUB 1和β-actin两条基因进行梯度稀释后PCR扩增，获得两条扩增标准曲线，设定阈值使两条标准曲线斜率之差M小于0.1，应用2^-DD CT方法对结果进行分析，以U251组均值为1.0计算各组目的基因相对表达量。图1-1显示扩增产物的熔解曲线，图1-2显示扩增产物的胶图，图1-3显示实时PCR反应曲线，STUB1 mRNA在U251和U87胶质瘤系中均有表达，且两者之间表达无显著差异(图1-4；P＝0.285)。 

(二)CHIP蛋白在胶质瘤细胞株U251和U87中的表达 

通过Western blot，检测U251和U87胶质瘤细胞中CHIP的蛋白表达水平及其差异，此后采用Image J软件测定蛋白条带的光密度值测定并进行统计分析。结果提示：CHIP蛋白在U251和U87胶质瘤细胞中均有表达，且两株细胞系之间表达无显著差异(图1-5；P＝0.394)。 

三、CHIP蛋白在胶质瘤细胞株U87中的表达定位 

U87细胞爬片分别用GFAP、CHIP一抗染色后，加用荧光二抗，DAPI染核，MetaMorph软件处理显示：在胶质瘤细胞株U87中，CHIP与星形胶质细胞标记物GFAP共定位，主要表达在胶质细胞的胞浆内(图2)。 

实施例2 

靶向CHIP的RNA干扰和过表达慢病毒载体的构建和鉴定 

实施例1已经证明：CHIP在正常脑组织中主要表达于神经元细胞的胞质中，在正常胶质细胞中未见表达；在胶质瘤组织中，CHIP主要表达在肿瘤细胞的胞浆中，与星形胶质细胞的标记蛋白GFAP共定位，且随级别的增高而表达增加，提示其可能在胶质瘤发生发展、增殖侵袭中发挥作用。然而，这一发现与CHIP在其他肿瘤中的表达情况刚好相反。为进一步在细胞水平和动物水平研究CHIP的生物学功能，本实施例拟构建靶向CHIP的慢病毒RNA干扰和过表达载体，进一步研究CHIP的生物学功能。 

材料与方法 

一、实验试剂 

PCR用试剂primer(R&F)	上海吉凯基因技术有限公司合成
		Taq polymerase	Takara
dsDNA oligo	上海吉凯基因技术有限公司合成
		QIAGEN Plasmid大抽Kit	QIAGEN
Age I	New England Biolabs(NEB)公司
		EcoRI	NEB
BSA	上海捷倍思基因技术有限公司
		LB or SOB  or SOC	ATCC
CaCL2	上海越俊生化有限公司
		T4 DNA ligase	NEB
T4 DNA ligase buffer	NEB
		MgSO4	上海吴化化工有限公司
琼脂糖	赛百盛
		250bp DNA ladder Marker	捷瑞
positive clone测序	美季
		pEGFP-N1-3FLAG Vector	BD公司
1kp DNA ladder Marker	Fermentas公司
		dNTP	promega公司
Primer	上海吉凯基因技术有限公司合成
		Plasmid抽提Kit	QIAGEN公司
兔抗人CHIP多抗	Abgent公司

兔抗人GAPDH单抗

Santa Cruz公司

[0238] 二、实验仪器 

三、实验设计：见图3-1(由HIV慢病毒构建)，图3-2 

四、siRNA设计： 

(一)siRNA序列： 

Marker	gene	物种	TargetSeq	GC％	流水号
						pSC-1	STUB1	human	CTTGGCTATGAAGGAGGTT	42.86％	PSCSI1749
pSC-2	STUB1	human	GCTGGAGATGGAGAGCTAT	52.63％	PSCSI1750
						pSC-3	STUB1	human	GGAGGTTATTGACGCATTC	47.36％	PSCSI1751
pSC-4	STUB1	human	GCTGGAAGAGTGCCAGCGA	57.14％	PSCSI1752

(二)病毒载体构建框架：

(三)DNA合成片段： 

PSC1-1：CcggaaCTTGGCTATGAAGGAGGTTTTCAAGAGAAACCTCCTTCATAGCCAAGttTTTTTg 

PSC1-2：aattcaaaaaaaCTTGGCTATGAAGGAGGTTTCTCTTGAAAACCTCCTTCATAGCCAAGtt 

PSC2-1：CcggcaGCTGGAGATGGAGAGCTATTTCAAGAGAATAGCTCTCCATCTCCAGCtgTTTTTg 

PSC2-2：aattcaaaaacaGCTGGAGATGGAGAGCTATTCTCTTGAAATAGCTCTCCATCTCCAGCtg 

PSC3-1：CcggaaGGAGGTTATTGACGCATTCTTCAAGAGAGAATGCGTCAATAACCTCCttTTTTTg 

PSC3-2：aattcaaaaaaaGGAGGTTATTGACGCATTCTCTCTTGAAGAATGCGTCAATAACCTCCtt 

PSC4-1：CcgggaGCTGGAAGAGTGCCAGCGATTCAAGAGATCGCTGGCACTCTTCCAGCtcTTTTTg 

PSC4-2：aattcaaaaagaGCTGGAAGAGTGCCAGCGATCTCTTGAATCGCTGGCACTCTTCCAGCtc 

引物退火形成带粘性末端的双链，把合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温。 

五、vshRNA载体的构建 

(一)Age I和EcoRI酶切pGCSIL-GFP载体以使其线性化 

Polylinker序列： 

ccgcaggtatgcacgcgt 

(二)使用Age I和EcoRI进行酶切消化： 

酶切反应体系： 

纯化的DNA质粒(1μg/μl)	2μl
		10×buffer	5μl
100×BSA	0.5μl
		Age I(10U/μl)	1μl
EcoRI(10U/μl)	1μl
		H2O	40.5μl
Total	50μl

将上述混合的反应物置于37℃，1h。 

六、CHIP过表达载体的构建 

(一)引物合成 

1、STUB1-Xho I-F 

CCGCTCGAGATGAAGGGCAAGGAGGAG 

引物说明：含保护碱基和Xho I酶切位点(下划线标记的)，并含有目的基因3’端部分序列用于PCR钓取目的基因 

2、STUB 1-BamH I-R 

CGGGATCC GTAGTCCTCCACCCAGCC 

引物说明：含保护碱基和BamH I酶切位点(下划线标记)和用于调整读码框的序列(双划线标记)，并含有目的基因3’端部分序列用于PCR钓取目的基因。 

(二)真核表达载体信息：见图5 

(三)真核表达载体酶切体系： 

使用Xho I和BamH I进行酶切消化： 

纯化的DNA质粒(1ug/μl)	2μl
		10×buffer	5μl

100×BSA	0.5ul
		Xho I(10U/μl)	1μl
BamH I(10U/μl)	1μl
		H2O	40.5μl
Total	50μl

将上述混合的反应物置于37℃，1h。 

(四)PCR扩增目的基因 

PCR反应体系： 

试剂	体积(ul)
		Primer(+)	0.4
Primer(-)	0.4
		ddH2O	14.7
10×buffer	2
		MgCl2	0.5
dNTPs(2.5mM)	0.8
		pfu polymerase	0.2
Template(10ng/μl)	1

PCR引物说明： 

Primer(+)：STUB1-Xho I-F 

Primer(-)：STUB 1-BamH I-R 

PCR仪进行反应，按以下循环条件： 

PCR产物大小：926bp 

(五)目的基因酶切： 

使用Xho I/BamHI进行酶切消化： 

酶切反应体系：(混合的反应物置于37℃，1h)。 

PCR产物(100ng/μl)	5μl
		10×buffer	5μl
100×BSA	0.5μl
		Xho I(10U/μl)	1μl
BamH I(10U/μl)	1μl
		H2O	40.5μl
Total	50μl

七、感受态细胞制备 

(一)溶液配置： 

1、0.1M CaCl2溶液，以0.45过滤除菌； 

2、250mMKCl2溶液 

3、2M MgCl2溶液，高压灭菌； 

4、SOB：1ml250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液； 

(二)用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 

1、从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。 

2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。 

3、于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。 

4、倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。 

5、以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。 

6、于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。 

7、倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。 

8、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。 

9、将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。 

八、克隆制备： 

(一)连接 

连接反应体系于16℃连接过夜： 

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA 100ng/μl	1	1	1
退火的双链DNA 100ng/μl	1	-	1
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1	1	1
T4噬菌体DNA连接酶	1	1	1
				ddH2O	补足20	补足20	补足20

(二)转化：

1、配置溶液： 

1)250mMKCl2溶液 

2)2M MgCl2溶液，高压灭菌； 

3)SOB培养基：1ml250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液； 

4)SOB琼脂培养基：0.49396g MgSO4.7H2O溶于100mlSOB培养基，加入1.5琼脂粉，高压灭菌，冷至温度低于60℃，加入Amp至终浓度到100μg/ml，混匀铺板，一股90mm直径平皿需要30-50ml培养基； 

5)1M葡萄糖溶液，过滤除菌； 

6)SOC培养基：2ml 1M葡萄糖溶液加入100ml SOB培养基。 

2、实验步骤： 

1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。 

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 

3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。 

4)每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇 床上，温育45分钟使细菌复苏。 

5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO₄和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。 

6)将平板置于室温直至液体被吸收。 

7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。 

8)阳性克隆PCR鉴定。 

3、阳性克隆的PCR鉴定： 

1)PCR反应体系： 

试剂	体积(ul)
		10×buffer	2
dNTPs(2.5mM)	0.8
		Primer(+)	0.4
Primer(-)	0.4
		Taq polymerase	0.2
Template	l
		ddH2O	补足20

2)PCR引物说明及反应条件： 

Primer  (+)：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’ 

Primer  (-)：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’ 

PCR仪进行反应，按以下循环条件： 

3)PCR条带大小： 

a).连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：343bp(从载体中切掉24bp)； 

b).没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：306bp 

c).过表达产物PCR产物大小：阳性转化子得到1180bp的条带，阴性转化子得到310bp的条带 

接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μl送测序。 

九、统计学方法 

数据均以平均数±标准差形式表示。根据不同数据类型，符合方差分析条件的，使用方差分析one-way ANOVA进行比较；不符合方差分析条件的，采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05定义为差异有统计学意义。使用SPSS15.0进行统计学处理。 

结果 

一、靶向C HIP的慢病毒RNA干扰阳性克隆测序结果分析： 

PSC1 

GAAAAGGGGCTGGTTGAAGAGAAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAA 

TACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGAC 

TATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG 

AAACACCGGAACTTGGCTATGAAGGAGGTTTTCAAGAGAAACCTCCTTCATAGCCAAGTTTTTTTG 

AATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAAT 

CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGC 

CCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA 

ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCA 

GTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT 

GGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATC 

GCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGG 

GGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGAC 

TTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGA 

GGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATG 

GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACG 

TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGAC 

CCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGACCACCCTCG 

PSC2-1 

TATTCAAGGCCTGTTGAAGAGATAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAA 

TACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGAC 

TATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG 

AAACACCGGCAGCTGGAGATGGAGAGCTATATCCGATACTAGCTCTCCATCAAAGGATGTAGAAGT 

AACTGATCTTTATGCGTTTTTGAGTAAACAATTTTAACCCCATGATCAACCTTTCGAGCCTTCATTAC 

GGGGTCATTTACTCGGACATCATTTCTCAAGCTCTTCGTTACATTACTTATTGCATAAGGCACGCCTG 

GATGAACGCCTGACTACCCCCCCCCCTTGACCCCCATATTGACGTATGTTCCCTTTATAACGCCAATA 

TAGCCCCTCCATTGACTTTCCTGTGTGGAGTATGTACGGAAAACTTACCACCACTGCCCCATTGACT 

GTATTCTTGCCATCAAATGCCCCTATCGACCCCTATGACCGTCAATGACCCGCCAGGCCCCCCCCAT 

TGTTGACCTTAATGAACTTTCCTACCTGGCCGAACTGGCACCGATTCTACATAGTTTCTTCCATGGT 

GACGTGGTTATGGATTTCGCCAATGGTCTGAATAGTGGATTGACTCTTGACGATCTCCTATTCTCCA 

CTCTCCTGACCCTTGTCGGCAGTGGGATTGGTTCGAACACCAACATGACTTTGCCATACGTCGTAA 

CTGATCCACTCCACTGAATCGAATGGACGGGAGGTGTGCACGTACGGGAGGACTGTATATACAGCA 

CAGCT 

PSC2-2 

CGGTCTTGTTAGAGAGTATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG 

ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATA 

TGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACAC 

CGGCAGCTGGAGATG 

PSC3-1 

CAGGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATAC 

GTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATC 

ATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAAC 

ACCGGAAGGAGGTTATTGACGATTCATGACGCCCCATAACGCCAGCTTATTGTCAACAGAAAAATG 

TTGAACTTAAGTAACTTTTTGGAGAAATAAAGTTTAAACCACTGATGATCCTCTACTGTTCCTTCTA 

AAAAATAATCAATTACGGGGTCATTAGTGCATCCCCTATATATGGATTTACGGGTTACATAACTTACG 

GAAAATGGGCGGCCGGGCTAACCGCCCCACGACCCCCGCCCATTGACGTAATAATGACTTATGTTC 

CCATACTAACGCCAATATGGACTTTCCTTTGACGGGATGGGTGGAATATTTACGGTAAACTGCCCAC 

TTGGCTGGACATCATTGTATCAGATGCCAGGTACGCCCCCTATTGTCGTCAATGACAATAAATGACC 

CGCCCGGTTTGTTCCCATTACATGACCATACGGTATTTTCCTACTTGGCATACATCAACTTATTAGTC 

ATCTCTATTACCATGATGATGGGGATTTGGCTGTAGCTCAATGGTCGTGGATACCGTATTGACTCTCA 

CTGATCTCCGAGTCTCCACCTCC 

PSC3-2 

GTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGT 

AACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAAGGAG 

GTTTTTTATTTCTTGTGGAAAAGAAGAAACACCGCGTTCCGTATCATGGCAGCTTTCGATCGCTAAG 

GCGTGCGCCTGAATGCCTTTTTTAAGCCAAGGCTTCGAGAGAGGCCGCCGCCGCGGTGGAGCTCC 

ACCTTTTGTTACCCAACATATGGATAATTGCGCGTTATAATACATTGATGATTTTGGACAAACCACGA 

CTACAATGCAACGAAAAAAAAGCGTGATTTGTAAAATTTGTGATGCTATAGCTTTACTTTCAAACAT 

AATATCCAGTGACGTAAAAGTTAGGACGATCAATGCATAAATGTTAAGTTGCAGGTACCTCGGGGA 

GATGAGATGCGGAGTGCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGCTAAATGGACCGTCTGGCGTTATGCA 

CCGGACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCATAGATCTACATGTTAGTCATCGCTATTACCTGC 

CGATGCGGTTTTGGCACTACATCAATGGACCAGAATAGCTGATAGACTCGCGGGTATGTCCAAGCC 

TCATCCCCAGTTGACGTCATGGATAGTTTGTTTTGTGCCAAAATCAAATGGACGGTCGTCATGTCGT 

AACACCTCCCCCTCATTGCCGCGATTTGCAGTATGCCCGTACCGCGCAGTCCATATCAGCGTAGCTT 

GCTTAGTGAACCGTGACATCCTGCTAGAACGCCGACAC 

PSC4-2 

CGGCCTGTTAGAGAGATAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG 

ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATA 

TGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACAC 

CGGGAGCTGGAAGAAAGGGACGCGTACCCCGTGTGCAGCGAATCTCTTTTTTTTTTTGAGTTCGGA 

TCCATTAGGCGGGCGCGAGCATAACCCTATTACCGCCTTGCATTAGTTTTAAGAGTAATCTATTACG 

GGGTCAATAGTTCAAATCCCATATATGGAGTTCCGTGTGCATAACTTACGGTAAATGGACGGCCTGG 

CTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACCTACGTTCCCAAACTAACACCAAT 

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAGACTGCCCACTTGGCAGTACATCA 

AGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTTATGGCCCGCCTGGCATTATG 

CCCAGTACACGACCTTATGGGACTATCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATGACTATTACC 

ATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGCACAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCA 

AGTCTCCGCCCCGCTGACGTCAATGGTAGTATGTTTTGGCACAAAATCAACGGGACTTTTCCAAAT 

GTCGAACAACTCCCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGCGTGACGTGGGAGGTCTATATAGTAGAGC 

TGGTTTAGTGAACCGTAGA 

PSC4-3 

ACCAAGCTGTTAGAGAGATATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCT 

TGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTAT 

ATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGCTGGAAGTGCTTTTGTCTTAGGATTTCATTCCTCTTTGCATCTCCCTTTGCGTTACAT 

CCATTCGGCCGCCGCGTGGAAACACATTACGGCCATGCTTTAGTTTTAATCATAATCATTTACGGGGTCACTATCCATAACCCAGATAG 

GGAGTTCCGCGTTACGAACTTATCGTAAATGGCCCGCCTGGCTGATTTCCAACGACCTACGCCCGATGACGTCAACATGACGTATCTTC 

CCATGACAACGACAATTGGAATATTCCCTTGACGTTGATGGGTTGAGCATGCACAGTGTGCTGCCCTCGTGGAGTACTCATTGTAACAT 

ATGCAAGTACGTGCCCAATGACGTCTATGACCGTGAATGGCCCGCTGGCATTATGCTAGTACATGACCTTATGGGACTTACCTACAGGA 

GACATCTACGTATGACTCATCGCTATCACCATGGTGATGCGGTCTGGCAGTACTCACTGGGCTTGCATAGTCGGTTTGACTCACGGGAT 

TTCCGCTCTCCACCCAATGACAACATGGAGTCTGTCTGGCCACCAGATCAACGACACTTACTAAACTGACCTATCACTCCGCCTCATTG 

AAGGAATGC 

二、靶向CHIP的过表达阳性克隆测序结果及结果分析： 

                               1                                50 

seq-3      (1)TTAGCAGAGCTGGTTTAGTGACCGTCAGATCCGCTAGCGATGGACTACAA 

              STUB1 CDS(1)-------------------------------------------------- 

               51                                                        100 

seq-3      (51)GGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGG 

              STUB1 CDS(1)-------------------------------------------------- 

               101                                                       150 

seq-3      (101)ATGATGACGACAAACCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGATGAAG 

              STUB1 CDS(1)--------------------------------------------ATGAAG 

                  151                                                    200 

    seq-3    (151)GGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAG 

STUB1 CDS      (7)GGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAG 

                               201                             250 

    seq-3    (201)CCCCGAGAAGAGCCCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTC 

STUB1 CDS     (57)CCCCGAGAAGAGCCCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTC 

                               251                             300 

    seq-3    (251)TGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTACGGCCGCGCG 

STUB1 CDS    (107)TGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTACGGCCGCGCG 

                               301                             350 

    seq-3    (301)ATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTG 

STUB1 CDS    (157)ATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTG 

                               351                             400 

    seq-3    (351)CTACCTGAAGATGCAGCAGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCG 

STUB1 CDS    (207)CTACCTGAAGATGCAGCAGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCG 

                               401                             450 

    seq-3    (401)CCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTGGGGCAG 

STUB1 CDS    (257)CCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTGGGGCAG 

                               451                             500 

    seq-3    (451)TGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCG 

STUB1 CDS    (307)TGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCG 

                               501                             550 

    seq-3    (501)AGCTTACAGCCTGGCCAAGGAGCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCC 

STUB1 CDS    (357)AGCTTACAGCCTGGCCAAGGAGCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCC 

                               551                               600 

    seq-3    (551)CCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGGAG 

STUB1 CDS    (407)CCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGGAG 

                               601                               650 

    seq-3    (601)CGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCAT 

STUB1 CDS    (457)CGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCAT 

                               651                               700 

    seq-3    (651)TGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTGGAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGG 

STUB1 CDS    (507)TGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTGGAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGG 

                               701                               750 

    seq-3    (701)GTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCC 

STUB1 CDS    (557)GTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCC 

                               751                               800 

    seq-3    (751)AAGCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGA 

STUB1 CDS    (607)AAGCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGA 

                               801                               850 

    seq-3    (801)TGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCGACTACCTGTGTGGCAAGATCA 

STUB1 CDS    (657)TGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCGACTACCTGTGTGGCAAGATCA 

                               851                               900 

    seq-3    (851)GCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCACGCCCAGTGGCATCACCTAC 

STUB1 CDS    (707)GCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCACGCCCAGTGGCATCACCTAC 

                               901                               950 

    seq-3    (901)GACCGCAAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCC 

STUB1 CDS    (757)GACCGCAAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCC 

                               951                              1000 

    seq-3    (951)CGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCTCATCCCCAACTTGGCTA 

STUB1 CDS    (807)CGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCTCATCCCCAACTTGGCTA 

                               1001                             1050 

    seq-3    (1001)TGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGA-TGGCTGGGTGGAGGAC 

STUB1 CDS     (857)TGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGAATGGCTGGGTGGAGGAC 

                               1051                             1100 

    seq-3    (1050)TACCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT 

                   TACTGA---------------------------------------------------------STUB1 CDS(907) 

                               1101                             1150 

    seq-3    (1100)CATCGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACTAACGGCCCAC 

         -------------------------------------------------STUB1 CDS(913) 

            1151                                                    1162 

                                                             seq-3(1150) 

                                                            AGTTCATACGTG 

                                   ------------------------STUB1CDS(913) 

比对说明：seq-3是3号阳性克隆的测序结果；STUB1CDS是目标基因序列；一股一个正常的测序反应可以测出约800bp的序列，往后的序列不准确，所以可以认为测序结果与目标序列完全一致 

三、实时定量RT-PCR及Western blot验证实验结果： 

上述测序实验证明，在选取的阳性克隆中，能够成功表达siRNA和过表达序列，我们从中挑选了两条干扰效率高的序列PSC-3和PSC-4(在此后实验中分别标记为KD-1和KD-2)，和过表达载体(OE)一起，利用实时定量RT-PCR和Western blot验证实验结果。 

荧光图片显示：靶向CHIP的慢病毒RNA干扰载体的转染效率超过75％，在U251和U87细胞中，RNAi能够在mRNA水平和蛋白水平显著降低内源性CHIP的表达(p＜0.01)，而过表达载体也能够在mRNA水平和蛋白水平增加内源性CHIP的表达70％以上(p＜0.05)。这些实验载体的构建，为进一步研究CHIP在胶质瘤发生发展过程中的作用奠定了坚实的基础。(图6-1，图6-2，图6-3) 

实施例3 

在前两个研究部分，证明了CHIP在正常脑组织中主要表达在神经元内，正常脑组织的胶质细胞中未见阳性表达。在脑胶质瘤组织中，CHIP的表达量随级别的增高而增加，与GFAP表达量呈负相关关系；在胶质瘤细胞系中，CHIP主要表达于肿瘤细胞的胞浆中，与GFAP共定位。利用慢病毒技术，成功建立了靶向CHIP的RNA干扰载体(KD-1和KD-2)以及过表达载体(OE)。荧光图片表明，两个干扰片段的干扰效率达到75％，能够显著降低内源性CHIP的表达。而过表达病毒载体能够提升CHIP的表达水平达70％以上。这些工具的制备为进一步研究CHIP在胶质瘤发生发展、增殖侵袭过程中的作用奠定了坚实的基础。 

本实施例中将利用前期构建的能够稳定下调CHIP表达的慢病毒载体(KD1和KD2)，以及稳定上调CHIP表达的慢病毒载体(OE)，空病毒载体(Scr)，进行MTT、克隆形成 和流式细胞仪测细胞周期、凋亡等实验，来检测当CHIP的表达量升高或降低时，胶质瘤细胞系U251和U87的恶性生物学行为是否发生改变，进一步将使用Western blot和实时定量RT-PCR，验证当CHIP表达量变化时，其下游作用分子是否也会发生相应的变化；然后，将使用裸鼠皮下种植瘤模型，来验证瘤内注射RNA干扰或过表达慢病毒对肿瘤增殖的影响作用，以验证细胞学实验的结果。 

材料与方法 

一、实验试剂 

胎牛血清	GIBCO(cat.No.A11-102)
		DMSO	上海生物试剂厂
DMEM	GIBCO(cat.No.12800-017)
		OMEM	GIBCO
胰酶	上海化学试剂公司
		双抗	生工
MTT	博亚
		PI染料	晶美上海公司
兔抗人Bcl-2多抗	Biovision公司
		兔抗人CHIP多抗	Abgent公司
兔抗人MMP-2多抗	CST公司
		小鼠抗人AKT单抗	Abnova公司
兔抗人β-catenin单抗	CST公司
		兔抗人survivin单抗	CST公司
兔抗人Hsp90多抗	CST公司
		兔抗人Hsp70多抗	CST公司
兔抗人GAPDH单抗	Santa Cruz公司

二、实验仪器 

三、MTT(噻唑兰比色分析法)测定细胞增殖曲线 

(一)接种细胞： 

用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000个细胞(细胞数据根据细胞的增殖速度来调整)接种到96孔板，每孔体积100ul，6个复孔，共做5块复板。 

(二)培养细胞： 

37℃、5％CO2培养5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 

(三)呈色： 

每孔加MTT溶液(5mg/ml)10ul，继续孵育4小时(避光)，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 

(四)比色： 

选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，取其中相对误差较小的三个数据进行统计。连续检测5天，每天一块复板。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 

四、克隆形成实验 

(一)细胞接种： 

MTT铺板完成后，有剩余细胞悬液，于6孔培养板中各加入20ul，一股为200个细胞，设3个复孔； 

(二)细胞培养： 

将接种好的细胞于培养箱中继续培养到绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途进行数次换液并进行细胞状态观察，这个过程一股是10-14天； 

(三)结果处理： 

实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，白光背景和荧光；实验终止时PBS洗涤细胞2次；多聚甲醛固定细胞30～60min；PBS洗涤细胞2次；GIEMSA染细胞，10min；ddH2O洗细胞3次，洗净板上背景，晾干；数码相机拍照。 

五、流式细胞仪测定细胞周期和凋亡实验： 

(一)实验方案： 

培养生长状态良好的U251细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，感染当天按实验设计的分组情况加入不同MOI的慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，4-5天后进行PI染色流式细胞仪分析，检测生物学效果。 

(二)流式细胞仪检测细胞凋亡流程： 

1.胰酶收集细胞(数目约1～5×10⁶个/ml)，500～1000rpm/min离心5min，弃去培养液。 

2.3ml PBS洗涤1次。 

3.离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1-2小时。 

4.离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 

5.400目的筛网过滤1次，500-1000r/min离心5min，弃去PBS。 

6.用1ml PI染液染色，4℃避光30min。 

7.流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。 

8.结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。 

六、荷瘤裸鼠瘤内病毒注射实验 

(一)实验动物与细胞 

所有实验动物均购自上海市中科院神经所，共16只，均为7-8周的雌性BALB/c-nu小鼠，分为4组，每组4只，在常规无菌条件下喂养。实验所用的细胞(U251、U87)培养条件同前。 

(二)细胞处理 

取生长状态良好的细胞用胰酶消化，分瓶接种于细胞瓶中，正常培养。取对数生长期细胞，Hank′s液洗涤细胞2次，清除死亡脱落的细胞。25％′胰蛋白酶消化贴壁细胞，含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中和胰酶并重悬细胞；充分吹散细胞后计数。1500rpm、室温下离心，弃上清；用不含血清的细胞培养液充分洗涤细胞2次，以去除可能诱发裸鼠体内非特异性免疫反应的血清成分，离心，沉淀用少量不含血清的细胞培养液重悬成高浓度的细胞悬液；调整细胞浓度，使细胞数达到7.5×10⁷cell/ml。 

(三)荷瘤裸鼠瘤内病毒注射实验 

在每只小鼠的前臂皮下处注入0.2ml含1.5×10⁷U251肿瘤细胞的缓冲液体。5天后注射处可触及肿瘤包块，将这16只小鼠随机分为4组。第1组接受瘤内KD-1注射(30ug/mouse)，每周2次不定期；第2组瘤内注射KD-2；第3组瘤内注射OE病毒；第4组瘤内注射空病毒Scr。每天用测径器测量并记录肿瘤二维平面直径，通过V＝0.5×最大径×(最小径)²计算肿瘤体积(mm3)。治疗12天后，将这些小鼠处以安乐死，从处死的小鼠身上分离切割下肿瘤组织并称重。 

七、定量RT-PCR及Western blot 

实验方法同前。 

八、统计学方法 

所有细胞学数据均以平均数±标准差形式表示，动物数据均以平均数±标准误形式表示。根据不同数据类型，符合方差分析条件的，使用方差分析one-way ANOVA进行比较；不符合方差分析条件的，采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05定义为差异有统计学意义。使用SPSS15.0进行统计学处理。 

结果 

一、MTT结果 

MTT显示：经过靶向CHIP的RNA干扰慢病毒(KD-1和KD-2)作用后，U251和U87细胞的增殖速率显著减慢；经过靶向CHIP的过表达慢病毒(OE)作用后，U251和U87细胞的增殖速率显著增加(见表1，表2，图7-1A，C)。 

二、克隆形成实验结果 

克隆形成实验显示：经过靶向CHIP的RNA干扰慢病毒(KD-1和KD-2)作用后，U251和U87细胞的克隆形成数显著减少；经过靶向CHIP的过表达慢病毒(OE)作用后，U251和U87细胞的克隆形成数显著增加(见图7-1B，D)。 

三、细胞周期与凋亡实验结果 

靶向CHIP的RNA干扰和过表达病毒感染胶质瘤细胞后，进行PI染色并利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，结果提示：CHIP表达量改变对于细胞周期和凋亡并无显著影响(P＞0.05，见图7-2，图7-3)。 

四、荷瘤裸鼠瘤内病毒注射实验结果 

裸鼠皮下注射5天后，注射处可触及肿块。在瘤体内分别注射含KD-1、KD-2、OE以及空序列的慢病毒后，RNA干扰组肿瘤增殖速率显著减缓，而过表达组肿瘤增殖速率显著加快(P＜0.05，表3，图7-4)。 

五、下游分子变化 

靶向CHIP的RNA干扰慢病毒感染细胞后，survivin mRNA和蛋白表达量均降低，β-catenin mRNA表达水平无显著变化，蛋白表达量升高。靶向CHIP的过表达慢病毒感染细胞后，survivin mRNA和蛋白表达量均升高，β-catenin mRNA表达水平无显著变化，蛋白表达量降低(见图7-5，图7-6，图7-7)。其他下游分子如Hsp90、Hsp70、Bcl-2、AKT、MMP-2表达量无显著变化。 

表1 

CHIP干扰和过表达病毒处理U251细胞后，细胞增殖速率型校正数据(^*OE比Scr、KD-1、KD-2，P＜0.05；#KD-1、KD-2比Scr，P＜0.05) 

表2 

CHIP干扰和过表达病毒处理U87细胞后，细胞增殖速率型校正数据(^*OE比Scr、KD-1、KD-2，P＜0.05；#KD-1、KD-2比Scr，P＜0.05) 

表3 

CHIP干扰和过表达病毒治疗裸鼠皮下成瘤模型校正数据(^*OE比Scr、KD-1、KD-2，P＜0.05；#KD-1、KD-2比Scr，P＜0.05) 。 

Claims (9)

1.一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：所述的E3泛素连接酶CHIP在正常脑组织中表达于神经元细胞的胞质中，在正常胶质细胞中未见表达；在胶质瘤组织中，CHIP的表达量随级别的增高而增加，与GFAP表达量呈负相关关系；在胶质瘤细胞系中，CHIP表达于肿瘤细胞的胞浆中，与星形胶质细胞的标记蛋白GFAP共定位。

3.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：通过靶向CHIP的RNA干扰和过表达慢病毒载体的构建，干扰片段的干扰效率达到75％以上，过表达病毒载体能够提升CHIP的表达水平达70％以上。

4.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：所述的E3泛素连接酶CHIP其表达量降低后，胶质瘤细胞的增殖能力减弱，克隆形成能力减弱；CHIP表达量上升后，胶质瘤细胞的增殖能力增强，克隆形成能力增强。

5.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：所述的E3泛素连接酶CHIP表达量对细胞凋亡和细胞周期无显著影响。

6.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：通过构建胶质瘤成瘤模型，在瘤体内注射干扰CHIP的慢病毒可以减缓肿瘤的增长速度，注射过表达CHIP的慢病毒可以促进肿瘤的增长。

7.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：所述的E3泛素连接酶CHIP表达量升高后，survivin mRNA和其蛋白表达量均升高，β-catenin mRNA表达水平无显著变化，其蛋白表达量降低；CHIP表达量降低后，survivinmRNA和其蛋白表达量均降低，β-catenin mRNA表达水平无显著变化，其蛋白表达量升。

8.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：与所述的E3泛素连接酶CHIP相关的其他下游分子Hsp90、Hsp70、Bcl-2、AKT、MMP-2表达量无显著变化。

9.根据权利要求1所述的一种E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用，其特征在于：所述的E3泛素连接酶CHIP是一个促癌蛋白，且它的作用是通过调节Survivin和β-catenin的表达量来实现的。

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